LAMPIRAN
Lampiran 1. Sterilisasi Alat dan Bahan Semua peralatan yang akan digunakan dalam penelitian disterilisasikan terlebih dahulu. Peralatan mikrobiologi disterilisasi dengan oven pada suhu 171 o C selama 1,5 jam. Alat-alat yang terbuat dari kaca sebelum digunakan dicuci dan dikeringkan. Alat-alat tersebut dibunkus dengan kertas dan disterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 121 o C selama 20 menit dan tekanan 1 atm. Kemudian dikeringkan dengan menggunakan oven. Sedangkan media disterilisasi pada suhu 121 o C selama 15 menit dan tekanan 1 atm. Sterilisasi pembakaran yaitu jarum ose untuk inokulasi bakteri disterilisasi dengan membakarnya sampai berwarna kemerahan dengan menggunakan lampu bunsen. a. Erlenmayer b. Cawan Petri
Lapirnan 2. Pembuatan Media Bakteri 1. Media Tryptic Soy Agar (TSA) Ditimbang media TSA sebanyak 20 g, lalu ukur akuades sebanyak 500 ml, setelah itu campurkan media TSA dengan akuades kedalam labu Erlenmeyer lalu aduk hingga merata, kemudian tutup erat bagian mulut labu Erlenmeyer dengan aluminium foil, kemudian panaskan larutan media TSA dengan menggunakan hot plate sampai mendidih, lalu larutan media dimasukkan kedalam autoclave agar steril, kemudian dituang kedalam cawan petri, ditunggu sampai media mengeras dan disimpan kedalam kulkas. 2. Pembuatan Media Sulfat Indol Motility (SIM) Sebanyak 30 g serbuk media SIM dilarutkan dengan 1 liter air suling, dipanaskan hingga melarut, setelah itu dimasukkan ketabung reaksi sebanyak 10 ml, disterilkan dengan autoclaf selama 15 menit pada suhu 121 C tekanan 15 lbs.
Lampiran 3. Pengukuran Kualitas Air a. Lokasi Tambak Penelitian b.pengukuran Suhu c. Pengukuran Salinitas d. Pengukuran ph e. Pengukuran Kecerahan
Lampiran 4. Isolat pada Media Selektif a. Penanaman Bakteri dari Ikan pada Media TSA b. Pemurnian Bakteri pada Media TSA
Lampiran 4. Lanjutan. c. Pemurnian Bakteri pada Media TSA
Lampiran 5. Prosedur Pewarnaan Gram Pewarnaan Gram dilakukan dengan membersihkan kaca objek dengan alkohol dan dilewatkan beberapa kali pada nyala api bunsen, kemudian diambil isolat bakteri masing-masing media dengan jarum ose dan dioleskan pada kaca objek. Isolat bakteri kemudian ditetesi ungu violet dan dibiarkan selama 1 menit, selanjutnya dicuci dengan air mengalir dan dianginkan hingga kering. Selanjutnya isolat bakteri ditetesi alkohol 95% selama 30 detik,kemudian dialiri air dan didinginkan hingga kering. Isolat bakteri kemudian ditetesi safranin selama 30 detik dan dicuci dengan air mengalir, dikeringkan dengan kertas penghisap dan dikering anginkan, kemudian dilakukan dengan pengamatan dengan menggunakan mikroskop. Bakteri Gram positif ditandai dengan warna ungu yang menunjukan bahwa bakteri tersebut mampu mengikat warna kristal violet, sedangkan bakteri gram negatif ditandai dengan warna merah muda yang menunjukan bahwa bakteri tersebut tidak mampu mengikat warna kristal violet dan hanya terwarnai oleh safranin (pewarna tandingan) (Hadioetomo, 1993). a. Pewarnaan Gram A b. Pewarnaan Gram B
Lampiran 5. Lanjutan. b. Pewarnaan Gram C d. Pewarnaan Gram D Hasil Pewarnaan a. Staphylococcus aureus b. Streptococcus iniae
Lampiran 6. Uji Reaksi Biokimia 1. Uji Katalase Uji katalase dilakukan untuk mengetahui sifat bakteri dalam manghasilkan enzim katalase dengan menggunakan reagen hidrogen peroksida (H 2 S 2 ) 3 %, hidrogen peroksida bersifat toksik terhadap sel karena menginaktifkan enzim dalam sel. Katalase merupakan enzim yang digunakan untuk mikroorganisme untuk menguraikan hidrogen peroksida menjadi H 2 O dan O 2. Adapun prosedurnya adalah diambil isolat murni bakteri dengan jarum ose steril, goreskan isolat pada slide glass, teteskan H 2 S 2 3% pada goresan isolat di slide glass, amati pembentukan gelembung udara yang terjadi pada saat koloni bakteri bercampur atau bereaksi dengan H 2 S 2 3%. Katalase bersifat (+) akan terjadi gelembung udara dan katalase bersifat negatif (-) jika tidak terjadi gelembung udara. 2. Uji Oksidase Uji oksidase dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya enzim oksidase pada bakteri dengan menggunakan paper oksidase yang dapat dilihat dari perubahan warna yang terjadi pada paper oksidase. Oksidase bersifat (+) akan terjadi perubahan warna ungu dan oksidase bersifat negatif (-) jika tidak ada perubahan warna pada paper oksidase. 3. Uji KOH Uji KOH dilakukan untuk mengetahui gram strain dari bakteri. Hal ini dilakukan sebelum dilakukan uji pewarnaan gram agar dapat dilihat kesamaan hasilnya. Keunggulan uji KOH adalah lebih sederhana dan praktis. Adapun prosedurnya adalah bakteri murni diambil dengan menggunakan jarum ose steril dan digoreskan ke slide glass yang telah diisi KOH 3%. KOH bersifat positif (+)
Lampiran 6. Lanjutan. akan mengeluarkan lendir dan KOH bersifat negatif (-) jika tidak ada lendir yang ditimbulkan. Hasil gram strain dapat diketahui dengan mengetahui KOH positif (+) maka gram (-) dan jika KOH negatif (-) maka gram (+). 4. Uji Indol Uji indol dilakukan untuk kemampuan bakteri menghasilkan indol dari asam amino tryptophan. Adapun prosedur dalam uji indol adalah inokulum bakteri diambil menggunakan jarum ose untuk ditanam dalam media SIM, diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Lalu diteteskan reagen kovacks (terdiri dari diametil aminobenzaldehid, n-amyl alkohol & HClp). Hasil positif (+) ditunjukkan dengan terbentuknya cincin merah. Hasil negatif (-) ditunjukkan dengan terbentukknya cincin kuning. 5. Uji SIM (Sulfat Indol Motility) Uji SIM dilakukan untuk membedakan bakteri motil dan bakteri non motil. Motilitas bakteri dapat diamati dari pertumbuhan bakteri pada media. Diambil bakteri dengan menggunakan jarum ose, kemudian bakteri ditanam secara tegak lurus ditengah medium SIM (sulfat indol motility) dengan cara ditusukkan, diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Hasil positif (+) ditunjukkan dengan pertumbuhan bakteri menyebar menjauhi garis inokulasi (pergerakan) sehingga media manjadi keruh. Hasil negatif (-) ditunjukkan dengan pertumbuhan hanya terlihat disepanjang garis inokulasi dan media tidak menjadi keruh.
Lampiran 6. Lanjutan. 6. Uji O/F (Oksidatif/Fermentatif) Uji O/F medium (Oksidatif/Fermentatif) dilakukan untuk mengetahui sifat oksidatif atau fementatif bakteri terhadap glukosa dengan menggunakan dua tabung media yang salah satunya ditutup dengan menggunakan paraffin, sehingga diharapkan didalam media tidak terdapat udara yang mendukung terjadinya fermentasi. Adapun prosedurnya dalah inokulasi bakteri kedalam media O/F secara tegak lurus, inkubasi pada suhu ruangan selama 24-48 jam. Jika kedua larutan tetap hijau maka NR (No Reaction). Jika yang tanpa parafin kuning maka oksidatif dan jika keduanya kuning maka fermentatif.
Lampiran 7. Hasil Bakteri pada Media TSA a. Staphylococcus aureus b. Streptococcus iniae