BAB III METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Penentuan Variabel 3.1.1 Variabel Tetap Placket-Burman Screening Design Air kelapa Usia starter : 500 ml : 7 hari Respon Surface Method Air kelapa Usia starter Urea Sumber fosfat Vitamin B syrup Jumlah starter : 500 ml : 7 hari : 3 gr : 1,25 gr : 1 tetes : 50 ml 3.1.2 Variabel Berubah Placket-Burman Screening Design Sumber carbon Sumber nitrogen Sumber fosfat : 0,5% w/v; 2% w/v; 3,5% w/v : 0,1% w/v; 0,6% w/v; 1,2% w/v : 0% w/v; 0,25% w/v; o,50% w/v ph : 6; 4,5; 3 Lama fermentasi : 6 hari; 10 hari; 14 hari
Jumlah starter Vitamin B syrup : 5% v/v; 10% v/v; 15% v/v : 0 tetes; 1 tetes; 2 tetes Respon Surface Method Sumber karbon : 0,30% w/v; 0,50 w/v; 2% w/v; 3,5% w/v; 5,12% w/v ph : 7; 6; 4,5; 3; 2 Lama fermentasi : 4 hari, 6 hari, 10 hari, 14 hari, 16 hari 3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat fermentasi Wadah fermentasi berupa baki-baki plastik yang tahan asam dengan dimensi 24 x 19 x 3 cm Wadah perebus media digunakan untuk merebus media yang akan diinokulasi dengan starter, wadah harus tahan asam, atau menggunakan gelas kimia. Ruang fermentasi digunakan untuk fermentasi, ruang ini harus bersih, telah dicuci hamakan, tidak berserangga, dan tidak mudah dimasuki debu, angin dan serangga. Timbangan Kompor ph meter untuk mengatur ph Loyang aluminium Setrika listrik Kertas koran 33 lembar Gelas ukur Oven
Termometer Masker Gunting Karet gelang Penggaris 3.2.2 Bahan fermentasi Air kelapa Sumber karbon: Gula pasir merk Gulaku Sumber nitrogen: Urea Asam asetat glasial merk Dixi (asam suka 25%, air purifikasi 75%) Sumber fosfat: K 2 HPO 4 Vitamin B syrup merk Caviplex syrup Starter (Acetobacter xylinum) 3.3 Prosedur 3.3.1 Pembuatan starter Air kelapa 500 ml disaring sampai tidak ada padatan yang terikut. Hasil saringan dipanaskan sampai mendidih, kemudian tambahkan gula 10 gr, urea 3 gr, asam asetat 20 ml. Larutan kemudian didinginkan, setelah dingin diinokulasi dengan Acetobacter xylinum sebanyak 60 ml. Difermentasi selama 7 hari dalam ruangan tertutup pada suhu kamar. Hasil fermentasi selanjutnya dipakai sebagai starter. 3.3.2 Rancang Percobaan 1. Experimental design menggunakan Placket-Burman Screening Method
Untuk tujuan screening medium dan kondisi proses pembuatan nata dari air kelapa, ada tujuh variabel bebas yang akan dikaji dengan tujuh kombinasi menurut metode dalam Placket-Burman Screening Method (Lotfy, Ghanem et al. 2007). Semua percobaan akan dilakukan triple dengan respon yield nata yang akan dihasilkan sebagai respon. Efek utama tiap variabel dengan perhitungan sederhana dibuat dengan tiga level yaitu level rendah (-), level rata-rata (0), dan high level (+). Hasil besaran tiap level didasarkan dari penelitian pendahuluan dan pustaka (Budhiono, Rosidi et al. 1999; Iguchi, Yamanaka et al. 2000; Edria, Wibowo et al. 2008). Design percobaan dengan menggunakan Placket-Burman Method menggunakan model orde satu menurut persamaan dibawah ini. Z = bo + Σ bi Xi... (1) Dimana Z adalah respon (yield berat nata), bo adalah model intercept dan bi adalah koefisien linier, Xi adalah level dari variabel bebas yang dikaji. Model ini tidak dapat mendeskripsikan interaksi diantara faktor dan hanya digunakan untuk menyeleksi dan mengevaluasi faktor yang penting terhadap respon (Lotfy, Ghanem et al. 2007). Dalam penelitian ini untuk screening variabel yang berpengaruh dalam fermentasi nata de coco maka dapat dilakukan dengan dua langkah yaitu: 1) Menentukan level atas, menengah dan bawah dari masing-masing variabel Penentuan level atas, menengah dan bawah untuk masing-masing variabel didasarkan dari referensi dan penelitian pendahuluan (Budhiono, Rosidi et al. 1999; Edria, Wibowo et al. 2008; Effendi 2009). Tabel level dari parameter dapat dilihat dalam Tabel berikut.
Tabel 3.1 Level Tiap Variabel yang Akan Dikaji Level/500 ml air kelapa No Variabel Zat/parameter - 0 + 1. Sumber C Gula 0,5% (w/v) 2% (w/v) 3,5% (w/v) 2. Sumber N Urea 0,1% (w/v) 0,6% (w/v) 1,2% (w/v) 3. Sumber fosfat K 2 HPO 4,25% (w/v) 0,5% (w/v) 4. ph Asam cuka 6 4,5 3 5. Lama fermentasi Hari 6 hari 10 hari 14 hari 6. Jumlah starter Volume 5% (v/v) 10% (v/v) 15% (v/v) 7. Vitamin B syrup Volume 0 1 tetes 2 tetes 2) Membuat kombinasi dari tujuh variabel yang akan dikaji dengan screening variabel menurut Placket-Burman No. Tabel 3.2 Rancangan Placket-Burman Screening Method Faktor yang Variabel Respon dikaji C ph JS LF N P V 1. LF N P - - - + + + - 2. C P V + - - - - + + 3. ph N V - + - - + - + 4. C ph LF + + - + - - - 5. JS LF V - - + + - - + 6. C JS V + - + - + - - 7. ph JS P - + + - - + - 8. Semua variabel + + + + + + +
9. Basal 0 10. Basal 0 11. Basal 0 12. C N ph + + - - + - - Keterangan: C = jumlah sumber karbon (gula); ph = variabel ph; JS = variabel jumlah starter; LF = variabel lama fermentasi; N = jumlah sumber nitrogen (urea); P = sumber Phospat (K 2 HPO 4 4); V = jumlah sumber vitamin (vitamin B) 2. Experimental design menggunakan Respon Surface Method RSM (Response Surface Method) adalah suatu metodee statistik untuk perancangan percobaan, pemodelan matematik, optimasi dan analisis statistik dalam penelitian. Dengan menggunakann RSM, sebuah persamaan polinomial kuadratik dikembangkan untuk memperkirakan hasil percobaan sebagai fungsi dari interaksi antara variabel bebas. Koefisien dari model empirik diestimasi dengan menggunakan teknikk analisa regresi multiarah yang ada dalam RSM. Secaraa umum persamaan empirik yang akan digunakan adalah (Ilham and M; Ulfah, Yasnur et al. 2006; Lotfy, Ghanem et al. 2007) ):..... (2) Dimana Y = hasil yang diperkirakan/respon, βo = koefisien intercept, βj = koefisien linier Xj, βjj = koefisien kuadrat Xj, βij = koefisien interaksi, Xi dan Xj = variabel bebas. Adapun rentang variabel bebas dan levelnya ditunjukkan di
Tabel 3.3, sedangkan rancangan percobaan berdasarkan metode Central Composite Design ditunjukkan pada Tabel 3.4. Tabel 3.3 Rentang dan Level Variabel Bebas Range dan level Variabel bebas Star point Low Center High level Star point (-α) level (-1) level (0) (+1) (+α) Variabel 1 (%v/v) -α -1 0 +1 +α Variabel 2 -α -1 0 +1 +α Variabel 3 -α -1 0 +1 +α Tabel 3.4 Tempuhan Berdasarkan Design Eksperiment Menggunakan Central Composite Design Run Variabel 1 Variabel 2 Variabel 3 1-1 -1-1 2-1 -1 +1 3-1 +1-1 4-1 +1 +1 5 +1-1 -1 6 +1-1 +1 7 +1 +1-1 8 +1 +1 +1
9-1 10 +1 11 0 -α 0 12 0 +α 0 13 -α 14 +α 15 0 16 0 17 -α 18 +α Kurva tiga dimensi (Three dimensional response surface and contour plot) digunakan untuk menguji kebenaran pengaruh variabel percobaan pada hasil yang diperoleh. Koefisien-koefisien pada model empirik diestimasi dengan menggunakan analisis regresi multiarah. Kesesuaian model empirik dengan data eksperimen dapat ditentukan dari koefisien determinasi (R 2 ). Untuk menguji signifikan atau tidaknya model empirik yang dihasilkan digunakan ANOVA (Analysis of Variance) (Ilham and M). 3.3.3 Pembuatan nata de coco 1. Penyiapan bahan baku 1) Bahan baku berupa air kelapa disaring terlebih dahulu sampai tidak ada padatan atau impuritas yang terikut ke dalam fermentasi.
2) Hasil saringan yang sudah didapat, kemudian dipanaskan sampai mendidih dengan api besar sambil diaduk-aduk. Setelah mendidih, tambahkan variabel yang akan dikaji yaitu gula, urea, asam asetat untuk mengatur ph, vitamin, dan K 2 HPO4 untuk metode Placket-Burman. Sedangkan variabel untuk Respon Surface Methode variabel yang dikaji adalah hasil screening dengan metode Placket-Burman. 3) Campuran ini diaduk sampai semua bahan larut, larutan ini disebut air asam bergula dan selanjutnya dipindahkan dalam wadah fermentasi. 2. Fermentasi nata 1) Media nata yang sudah dimasukkan dalam wadah fermentasi selanjutnya didinginkan, setelah dingin ditambahkan dengan starter (sesuai dengan variabel). 2) Wadah ditutup dengan kertas koran yang telah disterilkan dipanaskan. 3) Fermentasi selama 6-14 hari sesuai variabel sampai terbentuk lapisan nata yang cukup tebal (untuk metode Plaket-Burman), dan 4-16 hari untuk Respon Surface Method. 3.3.4 Analisa hasil Nata yang terbentuk dianalisa dengan ketentuan sebagai berikut: 1) Yield nata (berat nata basah tiap volume air kelapa) Sebagai respon dari metode Placket-Burman, yield nata ini sebagai acuan yang digunakan untuk mengetahui pengaruh variabel yang dikaji. Yield nata dapat didefinisikan sebagai persentase berat basah nata de coco yang
dihasilkan dalam wadah kultur per volume air kelapa yang digunakan untuk fermentasi (Budhiono, Rosidi et al. 1999; Iguchi, Yamanaka et al. 2000). Sebagai respon dari metode Respon Surface Method, yield nata ini sebagai acuan yang digunakan untuk mengetahui pengaruh variabel yang dikaji. Yield nata dapat didefinisikan sebagai berat basah nata de coco yang dihasilkan dalam wadah kultur per volume air kelapa yang digunakan untuk fermentasi (Budhiono, Rosidi et al. 1999; Iguchi, Yamanaka et al. 2000). 2) Tebal nata Tebal nata diukur dengan menggunakan jangka sorong. Tebal nata digunakan untuk mengetahui tebal lapisan pellicle yang digunakan oleh bakteri Acetobacter xylinum (Budhiono, Rosidi et al. 1999). 3) Moisture content, berat basah dan berat kering Analisa moisture content dan berat kering dilakukan dengan memotong kecil nata dengan ukuran 2 x 2 cm. Kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 105ºC sampai beratnya konstan (Jagannath, Kalaiselvan et al. 2008). 4) WHC WHC ditentukan berdasarkan pada metode Jiang et al (1985) (Jagannath, Kalaiselvan et al. 2008). Nata dipotong berbentuk kotak dengan ukuran yang sama, kemudian dibungkus dengan kertas filter dan mesin pemisah (sentrifuge) dengan putaran 5.000 g tiap 10 menit. Selama dalam mesin pemisah, air yang dikeluarkan akan diserap oleh kertas filter. Persentase perbandingan dari kelembaban mengandung WHC (Jagannath, Kalaiselvan et al. 2008). 5) Uji organoleptis
Nata yang telah dicuci dan direndam, dipotong kecil 2 x 2 cm setelah ditambah gula diujicobakan ke 15 orang panelis. Pengukuran nilai organoleptis dilakukan dengan metode kesukaan dengan angka hedonik dan numerik (Effendi 2009). Sedangkan tekstur dinyatakan dalam tingkat kekenyalan yang dapat dilihat dalam Tabel berikut: Tabel 3.5 Skala Numerik dan Hedonik dalam Uji Organoleptis (Rasa) Skala Numerik Skala Hedonik 4 Sangat suka 3 Suka 2 Agak suka 1 Tidak suka 0 Sangat tidak suka Tabel 3.6 Skala Numerik dan Hedonik dalam Uji Organoleptis (Tekstur) Skala Numerik Skala Hedonik 4 Sangat kenyal 3 Kenyal 2 Agak kenyal 1 Tidak kenyal 0 Sangat tidak kenyal