BAB III BAHAN DAN METODE

BAB III BAHAN DAN METODE III.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari hingga Maret 2012 di kawasan konservasi lumba-lumba Pantai Cahaya, Weleri, Kendal, Jawa Tengah dan Laboratorium Bakteriologi Bagian Mikrobiologi Medik Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner (IPHK) Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor (FKH IPB). III.2 Materi Penelitian Bahan-bahan yang digunakan adalah sampel swab blowhole T. aduncus, media untuk membiakkan sampel, seperti brain heart infusion broth (BHIB), triptic soy agar (TSA), agar darah (blood agar), dan MacConkey agar (MCA), media untuk pengujian secara biokimiawi, seperti triple sugar iron agar (TSIA), media semisolid indol, Simmon s citrate agar, kaldu Methyl Red-Voges Proskauer (MR-VP), kaldu gula-gula (glukosa, sukrosa, laktosa, manitol, maltosa), manitol salt agar (MSA), zat warna Gram (kristal violet, lugol, aseton alkohol, safranin), zat warna Ziehl Neelsen (karbol fuksin, asam alkohol, biru metilen), akuades, hidrogen peroksida 3% (H 2 O 2 3%), KOH 3%, dan alkohol 70%. Alat-alat yang digunakan meliputi mikroskop, pembakar Bunsen, ose, gelas objek, gelas penutup, inkubator, digital camera eyed pieces, dan lemari es. III.3 Metode Penelitian III.3.1 Pengambilan Sampel Pengambilan sampel dilakukan pada 11 ekor T. aduncus dengan melakukan 2 kali swab blowhole menggunakan cotton bud. Cotton bud dimasukkan ke dalam blowhole saat lumba-lumba sedang ekspirasi, yaitu saat blowhole terbuka. Cotton bud hasil swab blowhole yang pertama (B) kemudian dimasukkan ke dalam media BHIB untuk menjaga agar sampel swab tidak kering dan sebagai media penyubur. Cotton bud hasil swab blowhole yang kedua (B1) langsung digoreskan pada media agar darah dan MCA untuk isolasi bakteri, lalu diinkubasi pada suhu ruang. Sampel-sampel dalam BHIB dan yang telah

18 dibiakkan pada media agar darah dan MCA, kemudian dibawa ke Laboratorium Bakteriologi Bagian Mikrobiologi Medik FKH IPB untuk diidentifikasi. III.3.2 Isolasi Bakteri Seluruh sampel swab dalam medium BHIB (sampel B) kemudian dibiakkan pada media agar darah dan MCA untuk dilakukan isolasi bakteri. Bakteri Gram negatif diharapkan mampu tumbuh pada media MCA, sedangkan bakteri Gram positif dan beberapa bakteri Gram negatif yang tidak dapat tumbuh pada media MCA, seperti genus Neisseria dapat tumbuh di media agar darah. Sampel diambil dengan menggunakan ose yang telah disterilkan terlebih dahulu di atas pembakar bunsen hingga pijar. Sampel diambil sebanyak 1-2 mata ose lalu digoreskan pada media agar darah dan MCA dengan teknik goresan T. Sampel yang telah digoreskan pada media agar darah dan MCA kemudian diinkubasi selama 24 jam di dalam inkubator dengan suhu 37 C. Setelah 24 jam diinkubasi, seluruh koloni bakteri terpisah yang tumbuh kemudian dipindahkan ke dalam agar miring TSA dan dilakukan pelabelan sistematis untuk masing-masing koloni. Hal serupa juga dilakukan pada sampel B1. Seluruh koloni bakteri terpisah pada sampel B1 dipindahkan ke dalam agar miring TSA dan dilakukan pelabelan sistematis untuk masing-masing koloni. Koloni yang telah dipindahkan ke dalam media TSA, baik pada sampel B ataupun B1 kemudian diinkubasi di dalam inkubator selama 24 jam dengan suhu 37 C. Koloni-koloni bakteri yang tumbuh dalam media TSA akan diamati morfologi dan kemurniannya dengan pewarnaan Gram. III.3.3 Pemurnian Bakteri dan Pewarnaan Gram Masing-masing koloni yang tumbuh dalam media TSA baik sampel B ataupun B1 diwarnai dengan pewarnaan Gram untuk melihat morfologi, sifat Gram, dan kemurniannya. Cara melakukan pewarnaan Gram diawali dengan pembuatan preparat ulas. Ose disterilkan dengan dipanaskan di atas pembakar bunsen hingga pijar. Akuades diambil sebanyak 1-2 mata ose dengan menggunakan ose yang telah disterilkan dan diteteskan pada kaca objek. Biakan bakteri dari media TSA juga diambil sebanyak 1-2 mata ose dengan menggunakan

19 ose yang telah disterilkan lalu diulas pada permukaan gelas objek. Selanjutnya gelas objek dibiarkan kering udara dan difiksasi di atas pembakar bunsen. Preparat ulas bakteri pada gelas objek yang telah kering, kemudian diletakkan di rak untuk pewarnaan Gram. Tahap pertama yang harus dilakukan adalah kristal violet diteteskan ke seluruh bagian ulasan bakteri dan didiamkan selama 1 menit. Tahap kedua preparat diberi larutan lugol dan didiamkan selama 1 menit lalu dicuci dengan akuades hingga bersih. Tahap ketiga preparat diberi larutan pemucat (aseton alkohol) lebih kurang 10 detik dan dicuci kembali dengan akuades hingga bersih. Tahap keempat preparat diberi zat warna safranin selama 15-20 detik lalu dicuci dengan akuades hingga bersih. Tahap terakhir preparat dikeringkan dengan kertas saring lalu diamati di bawah mikroskop perbesaran objektif 100 kali dengan bantuan minyak emersi. Pada pewarnaan ini apabila terdapat koloni bakteri yang belum murni, maka kembali dilakukan isolasi pada agar darah ataupun MCA dengan teknik goresan T. Hasil pewarnaan bakteri Gram positif adalah ungu, sedangkan bakteri Gram negatif adalah merah. Apabila hasil dari pewarnaan Gram kurang meyakinkan, maka dapat dilakukan uji KOH 3% untuk menentukan sifat Gram bakteri. Bakteri Gram negatif akan memberikan hasil adanya masa gelatin yang membentuk benang-benang halus saat diangkat dengan ose. III.3.4 Identifikasi Bakteri Gram Negatif Berdasarkan hasil pewarnaan Gram didapatkan kelompok bakteri Gram positif dan negatif yang telah murni biakannya, kemudian dilanjutkan dengan tahapan identifikasi setiap isolat bakteri untuk menentukan genus melalui uji biokimia pada beberapa media. Uji yang dilakukan untuk kelompok bakteri Gram negatif adalah uji hidrogen sulfida di media TSIA, uji motilitas dan indol di media semisolid indol, uji sitrat di media Simmon s citrate agar, uji fermentasi asam campuran atau fermentasi butanadiol di media cair MR-VP, dan uji fermentasi karbohidrat di media kaldu gula bertabung Durham. Secara singkat identifikasi bakteri Gram negatif ditampilkan pada Gambar 7.

20 Bakteri Gram negatif Batang Kokoid TSIA Indol Sitrat MRVP Fermentasi karbohidrat: Glukosa Sukrosa Laktosa Maltosa Manitol Gambar 7 Diagram alir identifikasi bakteri Gram negatif (Lay 1994). III.3.4.1 Uji Motilitas dan Indol Uji motilitas dan indol dilakukan pada media semisolid untuk mengetahui pergerakan atau motilitas bakteri dan kemampuan bakteri dalam menghasilkan enzim pengurai asam amino triptofan. Hasil penguraian asam amino triptofan akan digunakan sebagai sumber karbon dalam metabolisme sel bakteri. Tahapan pengujian motilitas dan indol diawali dengan tabung yang berisi media semisolid ditandai dengan nomor isolat yang digunakan untuk uji. Biakan bakteri diambil dengan menggunakan needle (ose ujung jarum) sebanyak 1 needle, lalu ditusukkan ke dalam media semisolid sampai kedalaman kurang lebih 3/4 bagian dari permukaan media. Media semisolid yang telah diinokulasikan isolat bakteri kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 24-48 jam. Reagen Ehrlich-Bohme diteteskan sebanyak 10-12 tetes ke dalam media semisolid yang telah diinkubasi selama 48 jam dan ditunggu beberapa menit untuk melihat perubahan yang terjadi. Penumpukan indol pada permukaan media yang merupakan produk buangan dari hasil penguraian asam amino triptofan

21 ditandai dengan adanya cincin merah di permukaan media. Pergerakan atau motilitas bakteri dapat dilihat melalui pertumbuhan bakteri di sekitar tusukan dan juga di permukaan media (Lay 1994). III.3.4.2 Uji Hidrogen Sulfida (TSIA) Uji hidrogen sulfida digunakan untuk mengidentifikasi bakteri penghasil enzim desulfurase yang dapat menghidrolisis asam amino yang mengandung gugus sulfur seperti sistein dan methionin sehingga dihasilkan asam sulfida (H 2 S). Media yang digunakan untuk uji ini adalah agar miring TSIA. Pada media ini pembentukan H 2 S ditandai dengan adanya warna hitam pada media. Media TSIA juga mengandung tiga macam gula, yaitu glukosa, laktosa, dan sukrosa, sehingga media ini dapat juga digunakan untuk mengidentifikasi bakteri yang mampu memfermentasikan ketiga jenis gula tersebut (Lay 1994). Tahapan pertama untuk menginokulasikan isolat bakteri di media TSIA adalah tabung media TSIA yang digunakan ditandai dengan nama isolat yang akan diinokulasikan. Tahap kedua isolat yang diinokulasikan diambil menggunakan needle steril sebanyak 1 needle lalu ditusukkan ke bagian butt (bagian dasar) dan digoreskan pada bagian slant (bagian miring). Media TSIA yang telah diinokulasikan isolat bakteri diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam dan diamati perubahan warna yang terjadi pada media. Hasil fermentasi gula yang bersifat asam ditunjukkan dengan perubahan warna media menjadi kuning sedangkan perubahan warna media menjadi merah menunjukkan sifat basa akibat tidak terjadinya fermentasi gula. Pembentukan gas seperti H 2 dan CO 2 hasil fermentasi gula ditunjukkan dengan adanya retakan media di daerah butt (bagian dasar) (Lay 1994). III.3.4.3 Uji Sitrat Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan bakteri menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Bakteri yang menggunakan sitrat sebagai sumber karbon akan mampu mengubah warna media Simmon s citrate agar dari hijau menjadi biru. Tahapan untuk melakukan uji ini adalah tabung yang berisi media Simmon s citrate agar ditandai dengan nama isolat yang akan diinokulasikan lalu isolat tersebut diambil sebanyak 1 mata ose dengan ose yang

22 steril dan digoreskan pada permukaan miring media. Media yang telah diinokulasikan isolat bakteri diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam dan diamati perubahan warna yang terjadi pada media (Lay 1994). III.3.4.4 Uji Fermentasi Asam Campuran atau Butanadiol (MR-VP) Uji Methyl Red (MR) digunakan untuk mengidentifikasi kelompok bakteri yang menghasilkan fermentasi glukosa yang bersifat asam campuran. Uji Voges-Proskauer (VP) digunakan untuk mengidentifikasi bakteri yang memfermentasikan 2,3 butanadiol. Tabung kaldu MR-VP ditandai dengan nama isolat bakteri yang akan diinokulasikan. Isolat bakteri yang akan diinokulasikan diambil 1-2 mata ose dengan ose steril dan diinokulasikan di media kaldu MR-VP. Tabung kaldu MR-VP yang telah diinokulasikan isolat lalu diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Setelah 24 jam masa inkubasi, kaldu MR-VP dibagi menjadi 2 bagian pada tabung reaksi yang terpisah. Tabung pertama diberi tanda MR dan tabung kedua diberi tanda VP beserta nama isolatnya. Pada tabung kedua (VP) ditambahkan 10 tetes larutan KOH 40% dan 15 tetes larutan alpha naphtol lalu dikocok hingga berbuih. Hasil reaksi dapat terlihat setelah 30 menit penambahan reagen. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya perubahan warna kaldu menjadi merah dan hasil negatif bila tidak terjadi perubahan warna. Tabung pertama (MR) diinkubasi kembali pada suhu 37 C selama 4 x 24 jam. Setelah masa inkubasi 4 x 24 jam ditambahkan reagen methyl red ke dalam tabung dan didiamkan selama beberapa menit untuk melihat hasilnya. Hasil uji positif ditunjukkan dengan perubahan warna kaldu menjadi merah seperti pada uji VP dan hasil negatif ditunjukkan dengan perubahan warna media menjadi kuning atau jingga (Lay 1994). III.3.4.5 Uji Fermentasi Karbohidrat Uji fermentasi karbohidrat ini digunakan untuk menentukan jenis karbohidarat yang mampu difermentasi oleh bakteri. Indikator yang digunakan untuk menentukan hasil dari fermentasi karbohidrat adalah terbentuknya asam yang ditandai dengan perubahan warna media menjadi kuning dan pembentukan gas yang ditandai dengan adanya gelembung udara pada tabung Durham. Jenis

23 karbohidrat yang digunakan dalam uji ini adalah glukosa, sukrosa, laktosa, maltosa, dan manitol. Tabung kaldu karbohidrat ditandai dengan jenis karbohidrat dan nama isolat bakteri yang akan diinokulasikan. Isolat bakteri diambil 1-2 mata ose dengan ose steril dan diinokulasikan ke dalam kaldu karbohidrat dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Hasil fermentasi karbohidrat setelah diinkubasi diamati untuk melihat adanya pembentukan asam dan gas dari isolat yang diinokulasikan (Lay 1994). III.3.5 Identifikasi Bakteri Gram Positif Uji yang dilakukan untuk mengidentifikasi kelompok bakteri Gram positif lebih sederhana. Berdasarkan pewarnaan Gram didapatkan kelompok bakteri Gram positif batang dan kokus. Kelompok bakteri batang berspora dikelompokkan ke dalam Bacillus sp., sedangkan bakteri batang tidak berspora harus dilakukan pewarnaan tahan asam Ziehl Neelsen. Kelompok bakteri Gram positif kokus dilakukan uji katalase, uji fermentasi glukosa aerobik dan mikroaerofilik serta uji pertumbuhan bakteri pada media MSA. Identifikasi bakteri Gram positif secara singkat disajikan pada Gambar 8 dan 9. III.3.5.1 Pewarnaan Ziehl Neelsen Pewarnaan Ziehl Neelsen dilakukan pada kelompok bakteri yang lapisan dinding selnya mengandung lipid dan tahan terhadap asam. Tahapan pertama yang harus dilakukan adalah membuat preparat ulas. Akuades diambil 1-2 mata ose dengan ose yang steril kemudian ditambah 1-2 mata ose isolat bakteri Gram positif batang tidak berspora dengan menggunakan ose yang steril dan diulas pada gelas objek lalu difiksasi hingga terbentuk preparat ulas yang sempurna. Preparat ulas tersebut kemudian ditutup dengan sepotong kertas saring dan ditambahkan beberapa tetes larutan karbol fuksin lalu dipanaskan dengan pembakar bunsen selama 5 menit hingga terbentuk uap. Selesai dilakukan pemanasan, preparat dibiarkan dingin dan dibuang kertas saringnya lalu dicuci dengan akuades. Tahap selanjutnya preparat dicuci dengan asam alkohol selama 20 detik dan dicuci kembali dengan akuades. Terakhir preparat diwarnai dengan biru metilen selama 1 menit lalu dicuci kembali dengan akuades dan dikeringkan dengan kertas saring.

24 Preparat yang telah kering diamati dengan mikroskop perbesaran objektif 100 kali dan bantuan minyak emersi. Bakteri tahan asam ditunjukkan dengan warna merah dan bakteri tidak tahan asam berwarna biru (Lay 1994). III.3.5.2 Uji Katalase Uji katalase digunakan untuk mengidentifikasi bakteri kokus Gram positif yang mampu menghasilkan enzim katalase untuk memecah hidrogen peroksida (H 2 O 2 ) hasil metabolisme sel bakteri secara aerobik. Isolat bakteri yang akan diuji diambil 1-2 mata ose dengan menggunakan ose yang steril dan ditambahkan beberapa tetes larutan H 2 O 2 3%. Hasil uji katalase positif ditandai dengan pembentukan gelembung udara (Lay 1994). III.3.5.3 Uji Fermentasi Glukosa Aerobik dan Mikroaerofilik Uji fermentasi glukosa aerobik dan mikroaerofilik ini digunakan untuk mengetahui kemampuan penggunaan oksigen oleh bakteri untuk melakukan metabolisme karbohidrat. Uji ini dilakukan menggunakan 2 tabung reaksi yang berisi kaldu glukosa. Tabung pertama untuk uji glukosa aerobik dan tabung kedua untuk uji glukosa mikroaerofilik. Isolat bakteri diambil 1-2 mata ose dengan ose steril dan diinokulasikan ke dalam kaldu glukosa pada tabung pertama dan tabung kedua. Tabung pertama diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 37 C selama 24 jam, sedangkan tabung kedua dimasukkan dalam anaerobic jar bersama dengan lilin yang menyala sebagai indikator keberadaan oksigen di dalam jar. Lilin yang padam mengindikasikan bahwa kadar oksigen di dalam jar minimal, sehingga tercipta suasana yang miskin oksigen di dalam jar. Setelah lilin mati, jar diinkubasi dalam inkubator dengan suhu 37 C selama 24 jam. Hasil positif fermentasi glukosa dapat dilihat dengan perubahan warna media menjadi kuning.

25 Bakteri Gram positif Batang Kokus Berspora Tidak berspora Uji Katalase Bacillus sp Pewarnaan Ziehl Neelsen Katalase positif Katalasenegatif Tidak tahan asam Tahan asam Micrococcaceae Streptococcus sp. Listeria Nocardia Erysipelothrix Corynebacterium Mycobacteriumsp α-hemolytic ß-hemolytic -hemolytic Gambar 8 Diagram alir identifikasi bakteri Gram positif (Lay 1994). Micrococcaceae Uji fermentasi glukosa secara aerobik dan mikroaerofilik Fermentasi glukosa aerobik (+) Fermentasi glukosa mikroaerofilik (+) Fermentasi glukosa aerobik (-) Fermentasi glukosa mikroaerofilik (-) Staphylococcus sp. Micrococcus sp. Mannitol Salt Agar (MSA) inkubasi 37 o C 24 Jam S. aureus (+) (-) Staphylococcus sp. non patogen Gambar 9 Diagram alir identifikasi bakteri famili Micrococcaceae (Lay 1994).