BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Rekayasa Genetika Puslit Limnologi LIPI Cibinong, Laboratorium Bioremediasi Puslit Bioteknologi LIPI Cibinong, dan Laboratorium Mikrobiologi PT Charoen Pokphan Jakarta. Waktu pelaksanaan dimulai pada bulan September 2008 hingga bulan Juni 2009. Alat dan Bahan Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: ph meter, sentrifus merk IEC Sentra tipe MP-4R, orbital shaker, otoklaf, pipet mikro, pengaduk vortex, inkubator, mikroskop digital merk DinoLite, penyaring vakum, spektrofotometer UV-Vis merk Hach tipe DR/2010, elektroforesis BioRad Mini- Sub Cell GT CA, PCR merk TOUCH, neraca analitik, pengaduk magnetik, sonikator, dan peralatan gelas. Bahan Bahan yang digunakan adalah efluen reaktor pengolahan limbah pelapisan logam (asal kawasan industri Kabupaten Bekasi) yang terdapat di Laboratorium Prototipe Puslit Limnologi LIPI Cibinong, medium PYE Cr-25 25% dalam bentuk cair dan padat (komposisi pada Lampiran 1) yang diperkaya dengan efluen pengolahan limbah sebanyak 1%, air demin (demineralized water), K 2 CrO 4, membran selulosa merk Whatman dengan ukuran pori 0,45 µm, buffer Tris-HCl, bovine serum albumin, Comassie brilliant blue G-250, asam fosfat 85%, metanol, NADH disodium salt, H 2 SO 4, difenil karbazid, KOH 3%, PrepMan Ultra (Applied BioSystem), GoTaq Green Master Mix (Promedia), primer DNA, dan Wizard SV Gel and PCR Clean System (Promega). Semua bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini memiliki kemurnian tinggi dengan spesifikasi proanalisis (p.a).
Metode Penelitian Isolasi Bakteri Tahan Krom Sebanyak 100 ul air outlet reaktor pengolahan limbah pelapisan logam, yang terdapat di Laboratorium Pengendalian Pencemaran Puslit Limnologi LIPI Cibinong, diaduk dengan pengaduk vortex lalu disebarkan pada medium padat Peptone Yeast Extract (PYE) 25% yang mengandung krom(vi) 25 mg/l sebagai K 2 CrO 4 (medium ini selanjutnya disebut PYE Cr-25 25%). Inokulum diinkubasi selama 2 hari pada suhu 30 o C. Bakteri-bakteri yang muncul pada medium dengan kandungan krom tertinggi kemudian ditumbuhkan kembali pada medium padat PYE Cr-25 25%. Isolat-isolat yang diperoleh kemudian disimpan pada agar miring dalam lemari pendingin. Peremajaan isolat dilakukan dengan cara menumbuhkan biakan stok sebanyak satu mata ose di dalam medium agar PYE Cr-25 25%. Uji Ketahanan Terhadap Krom(VI) Uji ketahanan bakteri terhadap 50, 100, dan 250 mg/l Cr(VI) dilakukan berdasarkan metoda yang digunakan oleh Luli dan kawan-kawan (1983) yang dimodifikasi. Sebanyak satu mata ose isolat bakteri dari medium cair PYE Cr-25 25% disebarkan di medium agar PYE Cr-25 25% dalam diameter 5 mm. Di atas sebaran tadi diletakkan kertas saring steril berdiameter 8 mm yang masingmasing telah direndam semalam dalam larutan K 2 CrO 4 50,100, dan 250 mg/l serta dikeringkan dalam suhu 37 o C selama 2 jam. Kultur diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 30 o C. Pembentukan koloni di pinggir kertas saring menunjukkan bahwa isolat tahan terhadap Krom(VI). Sebagai pembanding, digunakan isolat Alcaligenes sp. dan Pseudomonas stutzeri koleksi Labortorium Mikrobiota Puslit Limnologi LIPI. Identifikasi Isolat Morfologi koloni bakteri diamati dengan menggunakan mikroskop digital DinoLite pada perbesaran 100-200x, sedangkan pengamatan bentuk sel dilakukan dengan menggunakan pewarna safranin dan mikroskop cahaya merk Olympus pada perbesaran 1000x. Selanjutnya isolat bakteri dikelompokkan berdasarkan
warna koloni, bentuk koloni, dan bentuk sel bakteri. Dari masing-masing kelompok diambil satu koloni yang memiliki ukuran diameter terbesar sebagai calon isolat unggul. Calon isolat unggul tersebut diamati reaksi Gram menggunakan teknik Ryu (Powers, 1995). Seleksi Isolat Bakteri Tahan Cr(VI) Calon isolat bakteri unggul diamati kurva pertumbuhannya dalam medium cair PYE Cr-25 25% (suhu 30 o C, 100 rpm) untuk mengetahui fase eksponensialnya. Selanjutnya dibuat kultur bakteri dalam kondisi yang sama hingga mencapai fase eksponensial. Sebanyak 1,0 ml kultur diambil dan dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf. Biakan disentrifus pada kecepatan 8000 g selama 6 menit pada suhu 20 o C. Pelet bakteri kemudian dicuci tiga kali dengan 1,0 ml medium cair PYE Cr- 25 25%; pada tiap pencucian, pelet bakteri dipisahkan dari supernatan dengan sentrifugasi. Selanjutnya pelet bakteri diresuspensi dalam 1,0 ml medium cair PYE Cr-25 25% dan diinkubasi selama 2 jam pada suhu 30 o C sambil di-shaker pada kecepatan 100 rpm. Setelah dua jam, kultur bakteri diaduk dalam pengaduk vortex dan dipipet sebanyak 100 ul untuk perhitungan jumlah sel menggunakan metoda pengenceran bertingkat. Sisa kultur disentrifus pada kecepatan 8000 g dan suhu 20 o C selama 6 menit. Supernatan dipisahkan kemudian dianalisis kadar Cr(VI) dalam supernatan secara spektrofotometri menggunakan metoda difenil karbazid (Lampiran 3). Untuk mengetahui jumlah krom yang diserapkan oleh isolat, dilakukan juga pengukuran kadar awal Cr 6+ dalam medium sebelum inkubasi. Sebagai kontrol untuk mengetahui adanya penyisihan krom oleh medium, digunakan medium tanpa bakteri yang diinkubasikan pada kondisi yang sama. Selanjutnya dihitung daya penyisihan tiap isolat bakteri. Daya penyisihan isolat didefinisikan sebagai jumlah krom(vi) yang hilang dari medium tiap satuan waktu untuk setiap sel isolat, yang dihitung menurut persamaan: Daya Penyisihan (mg Cr 6+. menit -1. sel -1 ) = A fk B x T
dimana: A : fk : B : T : selisih kadar Cr 6+ (dalam satuan mg/l) sebelum dan sesudah inkubasi dalam medium kultur uji. selisih kadar Cr 6+ (dalam satuan mg/l) sebelum dan sesudah inkubasi dalam medium kontrol tanpa bakteri. Jumlah sel dalam kultur uji (sel/l) Waktu uji (menit) Isolat unggul, yaitu isolat yang memiliki nilai daya penyisihan tertinggi, akan digunakan dalam pengujian selanjutnya. Isolasi DNA Genom Isolasi DNA genom merupakan tahap awal dalam analisis 16S rrna. DNA genom bakteri diisolasi dari kultur murni isolat nomor 15 yang dibiakkan dalam medium agar PYE Cr-25 25% selama 48 jam. Sebanyak satu mata ose biakan dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf yang telah berisi 200 µl pereaksi campuran Prepman Ultra (Applied BioSystem, www.acugenix.com) dan diaduk menggunakan vortex selama 15 detik. Suspensi dipanaskan dalam penangas air bersuhu 100 o C selama 10 menit kemudian didinginkan dalam suhu ruang selama 2 menit, campuran disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit pada suhu 4 o C. Supernatan dipisahkan dari pelet dan disimpan pada suhu 4 o C sebelum digunakan sebagai cetakan DNA pada tahap amplifikasi DNA menggunakan polymerase chain reaction (PCR). Amplifikasi Gen 16S rdna Gen bakteri yang menyandikan 16S rrna (rdna) diamplifikasi dalam PCR menggunakan universal primer yaitu primer 9F(5 - GAGTTTGATCCTGGCTCAG) dan primer 1492R(5 - GGCTACCTTGTTACGACTT). Terlebih dahulu dibuat 96 µl campuran pereaksi dalam tabung Eppendorf yang terdiri atas 50 µl GoTaq Green Master Mix, 2 µl masing-masing primer 9F dan 1492R, dan 42 µl air bebas nuklease. Ke dalam campuran tadi kemudian dimasukkan 4 µl DNA genom bakteri sebagai cetakan. Campuran segera dimasukkan ke dalam PCR dengan kondisi running sebagai berikut: Pre-PCR (95 o C, 2 menit), denaturasi (95 o C, 30 detik),
Annealing primer (55 o C, 30 detik), Elongation (75 o C, 1 menit), dan Post PCR (75 o C, 5 menit). Jumlah siklus polimerisasi DNA sebanyak 30 kali. Sebanyak 10 µl DNA hasil PCR (amplikon) kemudian di-running pada mesin elektroforesis (BioRad) selama 25 menit dengan menggunakan arus sebesar 100 V. Konsentrasi agarose yang digunakan adalah sebesar 2%, sedangkan sebagai running buffer digunakan bufer 1xTAE (ph 8,0). Spot hasil elektroforesis kemudian dilihat di bawah UV Transiluminator. Pemurnian Amplikon Wizard SV Gel and PCR Clean System (www.promega.com) digunakan untuk memurnikan amplikon. Sebanyak 90 µl amplikon dimasukkan ke dalam satu set SV Minicolumn, kemudian ditambahkan membrane binding solution sebanyak volume amplikon yang digunakan dan didiamkan selama 1 menit pada suhu ruang. Kolom disentrifugasi pada kecepatan 12.000 x g selama 1 menit pada suhu ruang. Amplikon yang terikat pada kolom dicuci dengan 700 µl membrane wash solution dan disentrifugasi pada kecepatan 12.000 x g selama 5 menit pada suhu ruang. Amplikon dicuci kembali dalam 500 µl larutan pencuci dan disentrifugasi pada kondisi yang sama. Supernatan dibuang dan kolom disentrifus kembali dalam kondisi tabung terbuka untuk menguapkan sisa larutan pencuci. Amplikon yang terikat di kolom kemudian dilarutkan dalam 50 µl air bebas nuklease. Kolom dibiarkan dalam suhu ruang selama 1 menit, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12.000 x g selama 1 menit. Supernatan dipisahkan dan konsentrasi DNA dalam supernatan dianalisis menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm (Mac Kenzie, 1990). Supernatan yang diperoleh kemudian digunakan dalam analisis urutan basa (sequencing). Penentuan Urutan Nukleotida Gen 16S rdna Analisis untuk mengetahui urutan basa rdna dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi PT. Charun Phok Phan. Kromatogram yang diperoleh diedit menggunakan program Bioedit 7 untuk memperoleh urutan basa rdna. Urutan basa rdna selanjutnya dibandingkan dengan basis data nukleotida dari gen 16S
rdna berbagai jenis bakteri menggunakan program BLASTN (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov.) untuk mengetahui kekerabatan filogenetik isolat bakteri. Ekstraksi Enzim Krom(VI) Reduktase Ekstraseluler, Periplasma, dan Sitoplasma Isolat bakteri dibiakkan dalam medium cair PYE Cr-25 100% selama 24 jam dengan perbandingan 1:10 pada suhu 30 o C dan kecepatan pengadukan 100 rpm.. Biakan disentrifus pada kecepatan 5000 g selama 10 menit pada suhu 4 o C. Supernatan disaring dalam kondisi steril menggunakan membran selulosa nitrat Whatman dengan ukuran pori-pori 0,45 µm. Hasil saringan yang mengandung enzim ekstraseluler digunakan untuk uji aktivitas reduksi Cr(VI) ekstraseluler pada tahap selanjutnya. Pelet bakteri yang diperoleh dari tahap sentrifugasi selanjutnya diekstraksi menurut metoda Van der Westen dkk untuk mendapatkan protein periplasma (Michel, et.al. 2001). Pelet bakteri dicuci dalam larutan fisiologis NaCl 0,85% dan diresuspensi dalam campuran buffer Tris-HCl dan EDTA, yang konsentrasi akhir masing-masing larutan sebesar 100 mm dan ph 9. Suspensi bakteri diinkubasi selama 30 menit dalam suhu 37 o C. Kemudian suspensi tersebut disentrifus selama 15 menit pada kecepatan 12.000 x g dan suhu 4 o C. Supernatan yang mengandung ekstrak kasar enzim periplasma dipisahkan, sedangkan pelet bakteri yang diperoleh digunakan untuk mengekstrak bahan sitoplasma. Pelet bakteri dicuci dalam larutan fisiologis NaCl 0,85%, kemudian di resuspensi dalam buffer Tris-HCl (ph 7) 50 mm. Pemecahan sel untuk memperoleh cairan sitoplasma dilakukan dengan menggunakan sonikator selama 20 detik (amplitude 40%) sambil direndam dalam es. Tahap pemecahan dilakukan 10 kali dengan waktu istirahat selama 20 detik hingga diperoleh larutan berwarna putih opaq.
Ekstrak kasar enzim sitoplasma dipisahkan dari debris dengan cara sentrifugasi pada kecepatan 12.000 x g selama 30 menit pada suhu 4 o C dan total volume ekstrak enzim yang diperoleh kemudian diukur. Kadar protein dalam ekstrak kasar enzim ekstraseluler, enzim periplasma, dan enzim sitoplasma dianalisis secara spektrofotometri menggunakan metoda Bradford (Mac Kenzie, 1990) (Lampiran 2). Uji Aktivitas Enzim Krom(VI) Reduktase Dibuat campuran pereaksi dalam tabung Eppendorf yang terdiri atas 0,12 ml ekstrak enzim, 0,24 ml air demin, dan 0,12 ml buffer Tris-HCl 125 mm dengan tiga ulangan sampel. Sebagai kontrol negatif, digunakan campuran pereaksi dengan komposisi yang sama yang telah dipanaskan dalam air mendidih (suhu 96-100 o C) selama 2 menit. Uji aktivitas enzim krom(vi) reduktase dilakukan dengan cara memipet substrat yaitu 0,12 ml K 2 CrO 4 1,0 mm ke dalam campuran pereaksi. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 30 o C selama 30 menit. Reaksi enzimatis pada sampel uji dihentikan dengan memanaskannya dalam air mendidih selama 2 menit. Setelah didinginkan dalam suhu ruang, larutan uji disentrifus pada kecepatan 12.000 x g dan suhu 4 o C selama 5 menit untuk menurunkan uap air yang menempel di dinding tabung. Dianalisis kadar Cr(VI) dalam larutan uji dan kontrol dengan cara memipet 0,5 ml sampel ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan secara berturut-turut 0,1 ml larutan difenil karbazida 0,5% (w/v dalam aseton) dan 4,5 ml H 2 SO 4 0,1 M. Warna merah-pink yang terbentuk diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Sebagai larutan standar digunakan larutan K 2 CrO 4 pada konsentrasi 0 0,2 mm. Kadar Cr(VI) dalam sampel dihitung dengan menggunakan kurva kalibrasi standar. Dari hasil analisis kadar Cr(VI), dihitung selisih penurunannya antara larutan kontrol dan larutan uji. Unit aktivitas enzim Cr(VI) reduktase didefinisikan sebagai nmol K 2 CrO 4 yang hilang tiap menit dan aktivitas spesifik enzim dihitung sebagai unit aktivitas enzim tiap mg protein.
Pengaruh Donor Elektron Terhadap Aktivitas Enzim Pada uji ini, sebagai donor elektron digunakan NADH dengan konsentrasi akhir dalam larutan uji sebesar dua kali konsentrasi substrat K 2 CrO 4 (Park, et.al., 2000). Uji aktivitas enzim krom(vi) reduktase dilakukan dengan cara memipet 0,12 ml K 2 CrO 4 1,0 mm ke dalam campuran pereaksi dalam tabung Eppendorf yang terdiri atas 0,12 ml ekstrak enzim, 0,12 ml air demin, 0,12 ml NADH 2 mm, dan 0,12 ml buffer Tris-HCl 125 mm. Tahap selanjutnya dilakukan sama dengan uji aktivitas enzim krom(vi) reduktase di atas. Dari hasil analisis kadar Cr(VI), dihitung selisih penurunannya antara larutan kontrol dan larutan uji. Unit aktivitas enzim Cr(VI) reduktase didefinisikan sebagai nmol K 2 CrO 4 yang hilang tiap menit dan aktivitas spesifik enzim dihitung sebagai unit aktivitas enzim tiap mg protein.