VISUALISASI HASIL PCR DENGAN METODE PCR LANGSUNG DAN TIDAK LANGSUNG PADA SAMPEL BAKTERI Pseudomonas fluorescens dan Ralstonia solanacearum Pendahuluan Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro. Menurut Handoyo dan Rudiretna (2001), proses PCR berlangsung dengan melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda. Tahapan dalam PCR yang dimaksud adalah: (1) denaturasi, yaitu tahap pemanasan molekul DNA yang menyebabkan terjadinya pemisahan untai ganda DNA menjadi untai tunggal DNA, (2) penempelan atau annealing, yaitu tahap penempelan primer pada untai tunggal DNA target, (3) pemanjangan atau ekstension, yaitu tahap memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang baru dari gabungan antara primer, DNA cetakan dan nukleotida (Kusuma, 2010). Teknik PCR pertama kali dikembangkan oleh Karry Mullis pada tahun 1985. Pada umumnya metode PCR dilakukan dengan menggunakan sampel DNA. Hal tersebut membutuhkan waktu untuk mendapatkan DNA murni dari sampel yang diuji. Pengujian ini dilakukan untuk membandingkan hasil PCR menggunakan metode tidak langsung (melalui tahapan ekstraksi DNA) dengan metode langsung (menggunakan koloni atau pelet bakteri). Metodologi Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam pengujian ini adalah microsentrifus, vortex, thermostart block, spindown sentrifuse, PCR thermocycler, elektroforesis, Gel doc, mikropipet, mikrotip, jarum ose, erlenmeyer, dan tabung ulir. Sedangkan bahan yang digunakan adalah TE buffer, SDS, CTAB, NaOH, Cloroform, Isoamil Alkohol, Ethidium Bromide, Agarose gel,
TBE buffer, etanol absolut, Primer P0_forward 5'- GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG- 3', Primer P6_reverse 5'- CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA- 3', primer balai Forward 5'- AGA GTT TGA TCA TGG CTT AG - 3' dan reverse 5'- TAC GGC TAC CTT GTT CG - 3', mastermix PCR, Bovin Serum Albumin (BSA), aquabidest, marker 100bp, marker 1kbp, loading dye, sybergreen, parafilm, alkohol 96%, media Kings B dan media NA. Persiapan koloni Bakteri Koloni tunggal bakteri Pseudomonad fluorescens dan Ralstonia solanacearum dimudakan pada media Nutrient Agar dengan metode streak. Biakan diinkubasikan pada suhu ruang selama 24 jam. Persiapan pelet bakteri Bakteri Pseudomonad fluorescens dan Ralstonia solanacearum diperbanyak pada media Nutrient Broth, diinkubasikan sambil dishaker selama 24 jam. Biakan selanjutnya disentrifugasi dan dibuang supernatannya. Pelet yang didapat dilarutkan dengan 20 µl aquades. Isolasi DNA Bakteri Biakan bakteri Pseudomonad fluorescens dan Ralstonia solanacearum pada media NB umur 24 jam sebanyak 1,5 ml disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 o C, selanjutnya buang supernatannya. Pelet yang didapat dilarutkan dengan TE buffer ph 7,6 sebanyak 573 µl, dicampur hingga pelet larut, selanjutnya ditambahkan 15 µl 20% SDS dan 6 µl Proteinase-K 10 mg/ml, dicampur sampai homogen dengan menggunakan vortex. Pelet yang terlarut kemudian diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 1 jam sambil di goyang dengan kecepatan 500 rpm. Selesai inkubasi, larutan ditambahkan dengan 5 M NaCl sebanyak 100 µl, dicampur sampai homogen kemudian ditambahkan dengan larutan CTAB/NaCl sebanyak 80 µl, dicampur sampai homogen dan diinkubasikan pada suhu 65 o C selama 10 menit
sambil digoyang dengan kecepatan 800 rpm. Selesai inkubasi, larutan ditambahkan dengan larutan chloroform: isoamil alkohol (24:1) sebanyak 600 µl. Tabung kemudian dibolak balik sampai larutan homogen. Selanjutnya sentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm, selama 5 menit pada suhu ruang. Supernatan yang didapat dipindahkan dalam tabung 1,5 ml baru dengan hati-hati sambil diukur volumenya, kemudian tambahkan dengan 1 x volume Chloroform: isoamil alkohol (2:1), dicampur dengan cara tabung dibolak balik sampai homogen. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit pada suhu 25 o C. Supernatan yang didapat dipindahkan dalam tabung 1,5 ml baru dengan hati-hati sambil diukur volumenya, kemudian tambahkan dengan 0,6 x volume isopropanol, dicampur dengan cara tabung dibolak balik sampai muncul benang, kemudian larutan diinkubasikan pada suhu -20 o C selama 3 jam atau semalaman. Kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 o C. Pelet kemudian ditambahkan dengan etanol 70% sebanyak 500 µl, tabung diketuk-ketuk sampai pelet lepas. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm, selama 10 menit pada suhu 4 o C. Pelet yang didapatkan selanjutnya dikeringanginkan, kemudian dilarutkan dengan 50 µl TE buffer ph 7,6. Sampel DNA dapat disimpan dalam freezer -20 o C. Uji Kuantitas DNA Kuantitas dan kemurnian DNA diuji dengan menggunakan alat nanodrop spektofotometer. Uji Kualitas DNA Uji kualitas DNA dilakukan dengan menggunakan alat elektroforesis. Sampel DNA sebanyak 5 µl dicampur dengan 1 µl loading dye, kemudian dimasukkan dalam sumuran agarose 1% yang mengandung 1 µl Ethidium Bromida. Agarose gel selanjutnya dimasukkan ke dalam alat elektroforesis yang berisi TE buffer dan dirunning dengan
daya listrik 100 volt selama 40 menit. Hasil elektroforesis yang diperoleh divisualisasi dengan menggunakan UV transminator. Running PCR Reaksi PCR dilakukan dengan menggunakan Go Taq Green Master Mix, 2X dari Promega. Komposisi bahan yang digunakan ada dua macam, komposisi pertama dengan total volume 10 µl yang terdiri dari 5µL PCR mix, 0,5µL primer P0 10 pm/ µl, 0,5µL primer P6 10 pm/ µl, 27,5 µl nuklease free water, 0,25 µl BSA 10 mg/ml dan 1µL dna sampel/1µl pelet bakteri/1 koloni bakteri. Kondisi amplifikasi PCR pada komposisi pertama: pre denaturasi pada 95 o C selama 2 menit; 35 siklus dari denaturasi pada 95 o C selama 1 menit, annealing pada 57 o C selama 1 menit, extention pada 72 o C selama 1,5 menit; post extention pada 72 o C selama 10 menit, dan 4 o C selama tak terhingga. Komposisi kedua dengan total volume 20µL yang terdiri dari 10µL PCR mix, 1µL primer P0 10 pm/ µl, 1µL primer P6 10 pm/ µl, 7 µl nuklease free water, BSA 10 mg/ml 1 µl, 1ul suspense pelet bakteri atau 1 koloni bakteri. Kondisi amplifikasi PCR ialah: pre denaturasi pada 95 o C selama 10 menit; 35 siklus dari denaturasi pada 95 o C selama 1 menit, annealing pada 57 o C selama 1 menit, extention pada 72 o C selama 1,5 menit; post extention pada 72 o C selama 10 menit, dan 4 o C selama tak terhingga. Hasil Pada uji kuantitas dan kemurnian DNA bakteri Pseudomonas fluorescens (A) diperoleh hasil sampel A1 sebanyak 3,58 ng/µg dengan kemurnian 2,46 dan sampel A2 sebanyak 3,77 ng/µg dengan kemurnian 2,29. Sedangkan pada uji kuantitas dan kemurnian DNA bakteri Ralstonia solanacearum (B) diperoleh hasil sampel B1 sebanyak 65,89 ng/µg dengan kemurnian 1,98 dan sampel B2 sebanyak 3461,17 ng/µg dengan kemurnian 2,01.
Pada uji kualitas DNA bakteri Pseudomonas fluorescens (A) tidak diperoleh hasil (tidak muncul pita DNA), sedangkan bakteri Ralstonia solanacearum (B) diperoleh hasil (muncul pita DNA). Kuantitas DNA bakteri Pseudomonas fluorescens dan Ralstonia solanacearum disajikan pada gambar 1. Gambar 1. Hasil Uji Kualitas DNA bakteri, M : marker, A1 dan A2 : DNA bakteri Pseudomonas fluorescens, B1 dan B2 : DNA bakteri Ralstonia solanacearum Berdasarkan gambar 1, diketahui bahwa sampel B1 dan B2 mengandung DNA yang banyak. Sedangkan sampel A1 dan A2 mengandung DNA sedikit, sehingga tidak muncul pita DNA. Hal tersebut sesuai dengan hasil uji kuantitatif DNA dengan menggunakan alat spektofotometer, bahwa sampel Pseudomonas fluorescens memiliki kandungan DNA kurang dari 4 ng/µg. DNA bakteri yang berhasil diisolasi selanjutnya dilakukan PCR, dan dibandingkan dengan metode PCR langsung melalui koloni bakteri atau suspensi pelet bakteri. Hasil PCR dengan menggunakan komposisi pertama (total volume 10 µl) disajikan pada gambar 2.
Gambar 2. Hasil PCR dengan menggunakan komposisi pertama (total volume 10 µl), A1, A2, A3 = DNA bakteri Pseudomonas fluorescens, B1, B2, B3 = DNA bakteri Ralstonia solanacearum, AP3, AP4 = pelet bakteri Pseudomonas fluorescens, BP3, BP4 = pelet bakteri Ralstonia solanacearum, AK3 = koloni bakteri Pseudomonas fluorescens, AK4 = koloni bakteri bakteri Pseudomonas fluorescens, BK4 = koloni bakteri Ralstonia solanacearum. Berdasarkan gambar 2 diketahui bahwa pada sampel AP3, BP3, AP4, BP4, dan BK3 tidak muncul pita DNA. Dari data tersebut dapat disimpulkan bahwa PCR dari sampel pelet bakteri Pseudomonas fluorescens dan Ralstonia solanacearum pada jumlah formula 10µl tidak berhasil. Sedangkan untuk kode K (sampel dalam bentuk koloni), ketidakberhasilan hanya pada sampel Ralstonia solanacearum. Kesimpulan dari hasil tersebut adalah sampel dalam bentuk pelet tidak cocok digunakan untuk kedua bakteri, sedangkan sampel dalam bentuk koloni cocok digunakan untuk sampel Pseudomonas fluorescens dan tidak cocok untuk sampel Ralstonia solanacearum. Hal tersebut diduga karena karakter dari bakteri Ralstonia solanacearum adalah tebal dan besar, sehingga kemungkinan koloni yang terambil terlalu banyak. Sebagai pembanding, dilakukan running PCR dengan menggunakan komposisi kedua (total volume 20 µl). Hasil PCR dengan menggunakan komposisi kedua disajikan pada gambar 3.
Gambar 3. Hasil PCR dengan menggunakan komposisi kedua (total volume 20 µl), M = marker, AP1 dan AP2 = pelet bakteri Pseudomonas fluorescens, BP1, BP2 = pelet bakteri Ralstonia solanacearum, AK1, AK2 = koloni bakteri Pseudomonas fluorescens, BK1, BK2 = koloni bakteri Ralstonia solanacearum. Berdasarkan gambar 3 diketahui bahwa pada sampel BK1, dan BK2 tidak muncul pita DNA. Hal tersebut menunjukkan bahwa pada sampel bakteri Ralstonia solanacearum dalam bentuk koloni, proses PCR tetap tidak berhasil meskipun jumlah suspensi dalam formula tersebut sudah diperbanyak menjadi 20µl. Sedangkan pada sampel pelet bakteri Pseudomonas fluorescens ataupun Ralstonia solanacearum, dengan peningkatan volume formula menjadi 20µl mampu meningkatkan keberhasilan dalam proses PCR sehingga muncul pita DNA. Kesimpulan Deteksi bakteri Pseudomonas fluorescens dengan metode PCR langsung (menggunakan koloni ataupun pelet) dapat dilakukan dengan menggunakan komposisi pertama (total volumen 10µl) ataupun kedua (total volume 20µl). Deteksi bakteri Ralstonia solanacearum dengan metode PCR langsung (menggunakan pelet) hanya dapat dilaksanakan dengan menggunakan komposisi kedua (total volume 20 µl), sedangkan deteksi bakteri Ralstonia solanacearum dengan metode PCR langsung dengan menggunakan koloni baik pada komposisi pertama ataupun kedua tidak dapat dilakukan.
Daftar Pustaka Handoyo, D. dan A. Rudiretna. 2001. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR). Unitas, Vol. 9, No. 1, September 2000 - Pebruari 2001 17-29p. Kusuma, S.A.F. 2010. PCR. Makalah. Fakultas Farmasi, Universitas Padjajaran. Semarang. Oleh Nurul Hidayah, SP.,MP. (POPT Muda BBPPTP Surabaya) Fathul Mukaromah, SP. (POPT Muda BBPPTP Surabaya)