I. NOMOR PERCOBAAN : 6 II. NAMA PERCOBAAN : Penentuan Kadar Protein Secara Biuret III. TUJUAN PERCOBAAN : Menentukan jumlah absorban protein secara biuret dalam spektroskopi IV. LANDASAN TEORI : Protein banyak terkandung di dalam makanan yang sering dikonsumsi oleh manusia. Seperti pada tempe, tahu, ikan dan lain sebagainya. Secara umum, sumber dari protein adalah dari sumber nabati dan hewani. Protein sangat penting bagi kehidupan organisme pada umumnya, karena ia berfungsi untuk memperbaiki sel-sel tubuh yang rusak dan suplai nutrisi yang dibutuhkan tubuh. Maka, penting bagi kita untuk mengetahui tentang protein dan hal-hal yang berkaitan dengannya. Struktur protein tidak stabil karena mudah mengalami denaturasi yaitu keadaan dimana protein terurai menjadi struktur primernya, baik reversibel maupun ireversibel. Faktor-faktor yang menyebabkan denaturasi adalah ph, panas, pelarut, kekuatan ion, terlarut, dan radiasi. Protein ada yang reaktif karena asam amino penyusunnya mengandung gugus fungsi yang reaktif, seperti SH, -OH, NH2, dan COOH. Kelarutan protein di dalam suatu cairan, sesungguhnya sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain, ph, suhu, kekuatan ionik dan konstanta dielektrik pelarutnya. Protein seperti asam amino bebas memiliki titik isoelektrik yang berbedabeda. Titik Isoelektrik (TI) adalah daerah ph tertentu dimana protein tidak mempunyai selisih muatan atau jumlah muatan positif dan negatifnya sama, sehingga tidak bergerak ketika diletakkan dalam medan listrik. Pada ph isoelektrik (pi), suatu protein sangat mudah diendapkan karena pada saat itu muatan listriknya nol. Protein dapat juga dibagi menjadi dua golongan utama berdasarkan bentuk dan sifat-sifat fisik tertentu yaitu protein globular dan protein serabut. Protein serabut bersifat tidal larut didalam air, merupakan molekul serabut panjang, dengan rantai polipeptida yang menunjang pada satu sumbu dan tidak berlipat. Sedangkan protein yang lain adalah Protein Globular, mempunyai rantai-rantai popipeptida berlipat rapat-rapat menjadi bentuk globular atau bulat padat. Protein ini biasanya larut dalam airyang segera berdifusi, hampir semua mempunyai fungsi gerak dan dinamik. Hampir semua enzim merupakan protein globular. 1
Dalam percobaan ini kita menguji protein secara biuret yaitu yang berdasarkan serapan cahaya oleh senyawa kompleks yang berwarna ungu. Di mana kompleks ini terbentuk dari Cu 2+ dan gugus CO dan NH pada protein. Untuk penentuan kadar protein dengan uji biuret ini, digunakan spektrofotometer UV. Adapun penggunaannya yaitu dengan mengukur absorban senyawa pada panjang gelombang yang rangenya sama dengan panjang gelombang UV, sedangkan range yang digunakan pada percobaan ini adalah 540 nm.. Untuk menentukan konsentrasi dari senyawa yang akan kita ukur, maka dalam percobaan spektrofotometer ini dilakukan pengukuran % T nya, sehingga dapat ditentukan harga absorbansinya, dan akhirnya kita mendapatkan harga dari konsentrasi sampel yang akan kita uji cobakan. Adapun prinsip kerja dari spektrofotometer UV ini adalah menggunakan Teori yang dikemukakan oleh Lambert (1760) dan Beer (1852) lebih dikenal dengan Hukum Lambert - Beer yang dapat dituliskan hubungan sebagai berikut : T P P t 0 10 abc P t log( T ) log abc P 0 1 Pt log log abc A T P 0 log( T ) i. e. A abc 1 1 T opasitas( tidaktembuscahaya) T A abc Di mana : A = absorban a = koefisien ekstingsi (absorpsivitas molar) yakni tetap b = lebar kuvet (jarak tempuh optik) c = konsentrasi analit T = Transmitansi 2
Penyerapan sinar UV-Vis dibatasi pada sejumlah gugus fungsional atau gugus kromofor yang mengandung elektron valensi dengan tingkat eksutasi rendah. Tiga jenis elektron yang terlibat adalah sigma, phi, dan elektron bebas. Kromoforkromofor organik seperto karbonil, alkena, azo, nitrat, dan karboksil mampu menyerap sinar ultraviolet dan sinar tampak. Panjang gelombang maksimumnya dapat berubah sesuai dengan pelarut yang digunakan. Auksokrom adalah gugus fungsional yang mempunyai elektron bebas nseperti hidroksil, metoksi, dan amina. Terkaitnya gugus kromofor akan mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju ke panjang gelombang yang lebih besar dan disertai dengan peningkatan intensitas Ketika cahaya melewati suatu larutan biomolekul, terjadi dua kemungkinan. Kemungkinan pertama adalah cahaya ditangkap dan kemungkinan kedua adalah cahaya discattering. Bila energi dari cahaya (foton) harus sesuai dengan perbedaan energi dasar dan energi eksitasi dari molekul tersebut. Proses inilah yang menjadi dasar pengukuran absorbansi dalam spektrofotometer. Cara kerja spektrofotometer dimulai dengan dihasilkannya cahaya monokromatik dari sumber sinar. Cahaya tersebut kemudian menuju ke kuvet (tempat sampel/sel). Banyaknya cahaya yang diteruskan maupun yang diserap oleh larutan akan dibaca oleh detektor yang kemudian menyampaikan ke layar pembaca. Larutan yang akan diamati melalui spektrofotometer harus memiliki warna tertentu. Hal ini dilakukan supaya zat di dalam larutan lebih mudah menyerap energi cahaya yang diberikan. Secara kuantitatif, besarnya energi yang diserap oleh zat akan identik dengan jumlah zat di dalam larutan tersebut. Secara kualitatif, panjang gelombang dimana energi dapat diserap akan menunjukkan jenis zatnya (Cahyanto 2008). Penentuan kandungan air dalam bahan makanan dapat dilakukan dengan berbagai cara, dimana hal ini tergantung dari sifat bahannya. Dalam percobaan, analisa kadar air ditentukan dengan metode pengeringan (Thermogravimetri). Prinsipnya adalah menguapkan air yang ada dalam bahan dengan jalan pemanasan, kemudian menimbang bahan tersebut sampai berat konstan yang berarti semua air sudah diuapkan. Cara ini relatif mudah dan murah, akan tetapi memiliki berbagai kelemahan. 3
V. ALAT DAN BAHAN : Alat yang digunakan Pipet tetes Beker gelas Gelas ukur Tabung reaksi Bahan yang digunakan Larutan Protein Reagen Biuret Larutan NaOH Spektrofotometri UV CuSO 4.5H 2 O Aquadest VI. PROSEDUR PERCOBAAN : Pipet ke dalam tabung reaksi 1 ml larutan protein yang mengandung 1 10 mg/ml. Tambahkan 4 ml reagen biuret. Kocok dan diamkan selama 30 menit pada suhu kamar. Baca serapannya pada 540 nm. Untuk blanko dipakai campuran 1 ml air dan 4 ml reagen biuret yang juga didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar. Untuk sampel adalah larutan putih telur dengan perlakuan yang sama. Hukum Lambert-Beer berlaku untuk larutan-larutan protein antara 1 10 mg/ml. 4
VII. HASIL PENGAMATAN : Data Absorban dengan Spektrofotometri UV dengan λ = 540 nm Tabung Konsentrasi (mg/ml) Absorban (A) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0.025 0.069 0.102 0.132 0.136 0.167 0.173 0.209 0.217 0.314 Dengan menggunakan kurva standar tentukan konsentrasi sample jika Absorbansinya = 0.275 VIII. PERSAMAAN REAKSI O O - C N CH C N CH - + Cu 2+ OH O = C C = O H R H R HN NH RCH HCR Cu 2+ O = C HN RCH C = O NH HCR Kompleks Ungu 5
IX. ANALISA DATA : Membuat Kurva Standar Konsentrasi Protein Vs Absorban Dengan : X = Konsentrasi protein (c) Y = Absorbansi (A) A = 1 log T X Y XY X 2 1 0,025 0,025 1 2 0,069 0,138 4 3 0,102 0,306 9 4 0,132 0,528 16 5 0,136 0,68 25 6 0,167 1,002 36 7 0,173 1,211 49 8 0,209 1,672 64 9 0,217 1.953 81 10 0,314 3,14 100 = 55 1,544 10,652 385 Slope (A) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) 6
Intersept (B) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) Persamaan Regresi Linier :Y = 0,026X + 0,0104 Kurva standar : Y = 0,026X+ 0,0104 X 0 2 4 6 8 10 12 Y 0.0104 0.0624 0.1144 0.1664 0.2184 0.2704 0,3224 Dengan menggunakan kurva standar konsentrasi vs absorban maka konsentrasi sample X yang memiliki Absorbansi= 0.275 dapat ditentukan dengan rumus berikut : Maka konsentrasi sampel X = 8,75 dengan absorbansi = 0.275 7
X. PEMBAHASAN : Pada percobaan kali ini digunakan protein dengan konsentrasi yang berbeda sebagai sampel untuk penentuan kadarnya. Sampel yang digunakan sebanyak 10 macam dengan bentuk fisik yang berbeda. Digunakan cara pengukuran serapan radiasi sinar oleh molekul pada larutan protein dengan kriteria warna atau dengan kata lain digunakan cara spektroskopi. Digunakan alat spectrometer untuk menghitung secara spesifik absorbansi dari senyawa yang mengandung logam ini. Pada awal pereaksian, didapatkan campuran berwarna ungu yang didapat dari pereaksian unsur tembaga, yang terdapat dalam larutan protein dengan tembaga dan dalam lingkungan alkali atau pada percobaan ini digunakan NaOH. Larutan NaOH ini merupakan basa kuat yang mampu mengikat ion H + pada larutan protein tersebut. Ion H + yang lebih reaktif mampu diikat dan bereaksi dengan gugus amino. Masing-masing konsentrasi didapat larutan yang berwarna ungu dimana, semakin besar konsentrasi larutan protein tersebut, maka warna ungu dari larutannya akan semakin pekat, begitu juga sebaliknya. Warna ungu ini terbentuk karena adanya pembentukkan senyawa kompleks dengan Cu 2+ yang dimana akan berikatan dengan 4 gugus asam amino saat penambahan biuret. Semakin tinggi konsentrasi larutan dan semakin pekat warna ungu pada larutan, maka akan semakin banyak ikatan peptide yang menyebabkan pembentukan komples semakin banyak. Saat dilakukan pendiaman larutan selama 30 menit, dimaksudkan agar endapan dan filtrat campuran dapat terpisah dan tidak mengganggu proses pengidentifikasian menggunakan spectrometer. Pada proses ini telah terjadi absorbsi radiasi sinar oleh larutan yang menyebabkan transisi. Kompleks ini mengabsorbsi pada panjang gelombang yang lebih panjang karena transfer elektron memerlukan energy radiasi yang kecil. Dari penggunaan alat spectrometer ini didapat hasil absorban yang berbeda dari pengukuran yang dilakukan. Sesuai dengan hukum Lambert-Beer yang menyatakan bahwa hubungan antara konsentrasi dengan adsorbansi yang berbanding lurus, yaitu semakin besar konsentrasi maka semakin besar pula absorbansinya. Jadi semakin tinggi konsentrasi larutan, akan semakin besar nilai absorbansinya. Dan juga 8
dapat dikatakan, semakin tinggi konsentrasi larutan akan semakin banyak mokul yang mengabsorbansi radiasi sinar UV sehingga sinar yang diteruskan akan semakin sedikit. Untuk mengidentifikasi sampel yang telah diberikan sebelumnya menggunakan grafik, tidak menghasilkan hasil yang sama dengan hasil sampel yang telah diidentifikasi menggunakan perhitungan. Pada perhitungan, sampel absorban sebesar 0,275 seharusnya menghasilkan konsentrasi sekitar 8 atau lebih tepatnya 8,75. Namun ketika ditarik garis pada grafik regresi linear yang telah dibuat, titik konsentrasi yang diinginkan melebihi angka 10. Terdapat kesalahan dalam percobaan ini dapat diakibatkan oleh berbagai faktor. Salah satunya ketidak telitian praktikan dalam melakukan penimbangan menggunakan spectrometer. blangko yang seharusnya diisi filtrate saja, telah bercampur dengan endapan. Sehingga mempengaruhi hasil identifikasi absorban dan juga mempengaruhi terhadap hasil akhir dari perhitungan XI. KESIMPULAN : 1. Digunakan alat spectrometer untuk menghitung secara spesifik absorbansi dari senyawa yang mengandung logam 2. didapatkan campuran berwarna ungu dari pereaksian unsur tembaga, dalam larutan protein dengan tembaga dan dalam lingkungan alkali 3. Semakin tinggi konsentrasi larutan dan semakin pekat warna ungu pada larutan, maka akan semakin banyak ikatan peptide yang menyebabkan pembentukan komples semakin banyak. 4. semakin tinggi konsentrasi larutan akan semakin banyak mokul yang mengabsorbansi radiasi sinar UV sehingga sinar yang diteruskan akan semakin sedikit. 5. Kompleks ini mengabsorbsi pada panjang gelombang yang lebih panjang karena transfer elektron memerlukan energy radiasi yang kecil. 9
XII. DAFTAR PUSTAKA : Anonim. 2010. Protein. http://ilmukimia.webs.com/apps/blog/show/3316253 (diakses tanggal 14 April 2012) Bumbungan, Nober. 2011. Protein. http://noberanagbio.blogspot.com/2011/11/protein.html (diakses tanggal 8 April 2012) Fessenden, JR & Fessenden, JS. 1986. Kimia Organik Jilid 2 Edisi Ketiga. Jakarta: Erlangga. Lehninger, Albert L. 1982. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta: Erlangga. Poedjiadi, A. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: UI-Press. Panji. 2010. Spektrofotometer. http://panjicm.wordpress.com/spektrofotometer/ (diakses tanggal 14 April 2012) Underwood /R.A. Day, Jr. 1980. Analisa Kimia Kuantitatif Edisi Keempat. Jakarta; Erlangga. 10
XIII. GAMBAR ALAT : 11
XIV. JAWABAN PERTANYAAN : 1. Buatlah standar kurva dan tetapkan kadar protein yang diberikan? Jawab : 0.35 Kurva standar konsentrasi vs absorban 0.3 0.25 0.2 0.15 Y 0.1 0.05 0 0 2 4 6 8 10 12 2. Berikanlah penjelasan tentang Hukum Beer-Lambert! Jawab : Hukum ini menghubungkan ketebalan dari sel sampel (kuvet) pada perbandingan kekuatan radiasi berkas cahaya yang masuk dan berkas cahaya yang keluar, dan menyatakan. Juga berlaku untuk unsur yang menyerap cahaya dengan menghubungkan konsentrasi dari jenis absorbing pada perbandingan kekuatan radiant berkas cahaya yang masuk dan yang keluar. Kerja spektrofotometri berdasarkan hukum Lambert Beer,bila cahaya monokromatik (Io) melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut diserap (Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It). Hukum Beer-Lambert menyatakan hubungan antara konsentarsi dan adsorban yang berbanding lurus, dimana semakin besar konsentrasi maka semakin besar adsorbannya. Hal ini ditunjukkan dengan bentuk kurva yang linear antara konsentrasi dengan adsorbannya. 12
3. Senyawa apa yang dapat mengganggu cara Biuret seperti diatas? Jawab : Garam ammonia. Senyawa ini dapat membentuk endapan hitam atau merah pada reagen. 4. Mengapa reaksi tersebut disebut reaksi Biuret? Jawab : Karena dalam reaksi protein ini menggunakan reagen Biuret. Yaitu Larutan tembaga sulfat CuSO 4.5H 2 O dan Natrium Kalium Tartrat (NaK C 4 O 6.4H 2 O. dalam keadaan basa (dengan ditambahnaoh). 5. Senyawa kompleks apa yang sebenarnya terjadi? Jawab : Senyawa kompleks Cu 2+ 6. Apakah peptida juga memberikan reaksi Biuret. Jika memberikan, berikanlah penjelasan dan bagaimana cara menentukan kadar protein yang tercampur dengan peptida? Jawab : Ya, dengan menambahkan reagen Biuret pada larutan protein dan pengukuran adsorbansi larutan tersebut dan dibandingkan dengan sampel, dicari yang sama adsorbansinya maka akan diketahui berapa kadar proteinnya. 13