3. METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilakukan pada bulan Maret 2009 hingga Januari 2010. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Pengawasan Mutu, Teknik Kimia, Bio-Industri dan Instrumentasi Departemen Teknologi Industri Pertanian dan Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah beberapa jenis rumput laut dari Pantai Ujung Genteng Sukabumi (G.salicornia, U.lactuca dan C.crassa), S. polycystum, E.spinosum, limbah pengolahan agar dan karagenan dari industri pengolah di Jakarta dan Tangerang. Bahan tersebut dikeringkan dan ditepungkan hingga lolos saringan 30 mesh. Bahan lain yang digunakan dalam karakterisasi polisakarida adalah akuades, aseton, larutan iod, NaOH, H 2 SO 4, HCl, BaCl 2, asam borat, pelarut heksana, kertas saring, katalis selen, H 2 O 2 10%, CTAB, asetaldehida, asam benzoat dan resorcinol. Alat-alat yang digunakan dalam analisis proksimat, komponen serat, kadar sulfat dan kandungan 3,6-anhidrogalaktosa adalah peralatan gelas, wadah timbang, oven, desikator, timbangan digital, cawan porselen, labu bulat, Soxhlet, labu Kjeldahl, kompor listrik, tanur, autoklaf, kertas saring, pendingin balik, pompa vakum dan waterbath, kaca masir dan spektrofotometer. 3.3 Tahapan Penelitian Penelitian diawali dengan preparasi bahan, meliputi pengeringan dan penepungan (hingga lolos ayakan 30 mesh), selanjutnya dilakukan ekstraksi bertingkat dengan jenis pelarut yang berbeda, kemudian dilakukan karakterisasi komposisi kimia rumput laut meliputi analisis proksimat (air, abu, protein, lemak, serat kasar, dan karbohidrat by difference), analisis komponen serat meliputi (kadar hemiselulosa, kadar selulosa, dan kadar lignin), analisis kadar sulfat, dan kandungan 3,6-anhidrogalaktosa. Adapun alur kerja penelitian dapat dilihat pada Gambar 1.
15 Rumput laut Pengeringan sinar matahari; 5 hari Oven 60 0 C; 3 jam Limbah Penepungan 30 mesh Tepung rumput laut Analisis proksimat Fraksinasi polisakarida Analisis komponen serat Uji kadar sulfat dan 3,6- anhidrogalaktosa Gambar 1. Diagram alir penelitian 3.3.1 Fraksinasi Polisakarida Fraksinasi polisakarida ini didapatkan dengan melakukan ekstraksi polisakarida rumput laut menggunakan 4 macam pelarut, yaitu air, air panas, H 2 SO 4 0,05% dan NaOH 0,05%. Pada sampel dilakukan ekstraksi bertingkat untuk mendapatkan yield (rendemen) terbesar pada masing-masing pelarut. Perlakuan yang dilakukan dapat dilihat pada Gambar 2 dan 3 untuk proses pengendapan polisakarida.
16 1) Ekstraksi Polisakarida Sampel (2 g) Air 100 ml Perendaman 1 jam; 30 o C Penyaringan Filtrat I Ampas I Air 100 ml Pencampuran dan pemanasan 1 jam; 100 o C Penyaringan Filtrat II Ampas II H 2 SO 4 0,05%; 100 ml Pencampuran dan pemanasan 1 jam; 100 o C Penyaringan Filtrat III Ampas III Pencampuran dan NaOH 0,05%; pemanasan 100 ml 1 jam; 100 o C Penyaringan Filtrat IV Ampas IV Gambar 2. Diagram alir ekstraksi polisakarida
17 2) Pengendapan Polisakarida Filtrat (I/ II/ III/ IV) 5ml Metanol 100 ml Pencampuran etanol 100 ml Pengendapan ± 24 jam Penyaringan Filtrat Ampas Penimbangan Penimbangan Gambar 3. Diagram alir pengendapan polisakarida 3) Pengamatan bentuk struktur rumput laut Filtrat rumput laut diamati di bawah mikroskop polarisasi cahaya, larutan sampel disiapkan dengan mencampur tepung rumput laut dengan air destilasi, kemudian didiamkan selama 1 jam dan disaring. Filtrat ini diteteskan di atas gelas obyek dan kemudian ditutup dengan gelas penutup. Selanjutya dilihat menggunakan mikroskop polarisasi untuk melihat pendaran warna molekul di dalamnya. 3.4 Prosedur Analisis 3.4.1 Analisis kadar air (AOAC 1995) Sebanyak 1-2 g contoh ditimbang dalam sebuah wadah timbang yang sudah diketahui bobotnya. Kemudian dikeringkan dengan oven dengan suhu 105 o C selama 3 jam. Setelah itu didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Pekerjaan tersebut diulang sehingga mendapat bobot yang konstan.
18 Kadar air (%) = A B C 100% Keterangan : A = wadah+contoh sebelum dikeringkan (g) B = wadah+contoh sesudah dikeringkan (g) C = bobot contoh (g) 3.4.2 Analisis kadar abu (Apriyantono et al. 1989) Sebanyak 2 g contoh ditimbang dalam cawan porselin yang telah dikeringkan dan diketahui bobotnya, kemudian diarangkan dengan menggunakan pemanas bunsen hingga tidak mengeluarkan asap lagi. Cawan perselin berisi contoh yang sudah diarangkan kemudian dimasukkan ke dalam tanur bersuhu 600 o C hingga proses pengabuan sempurna. Cawan porselin berisi abu didinginkan dalam desikator dan ditimbang hingga mencapai bobot tetap. Keterangan : A = cawan + contoh kering (g) B = cawan kosong (g) C = bobot contoh (g) 3.4.3 Analisis kadar lemak (Apriyantono et al. 1989) Sebanyak 2 g contoh bebas air diekstraksi dengan pelarut organik heksana dalam alat soxhlet selama 6 jam. Contoh hasil ekstraksi diuapkan dengan cara diangin-anginkan dan dikeringkan dalam oven bersuhu 105 o C. Contoh didinginkan dalam desikator dan ditimbang hingga diperoleh bobot tetap. 3.4.4 Analisis kadar protein (Apriyantono et al. 1989) Sebanyak 0,1 g contoh dimasukkan dalam labu mikro Kjeldahl lalu ditambahkan 2,5 ml H 2 SO 4 pekat, 1 g katalis. Larutan didestruksi hingga
19 menghasilkan larutan jernih kemudian didinginkan. Larutan hasil destruksi dipindahkan ke alat destilasi dan ditambahkan 15 ml NaOH 50%. Labu erlenmeyer berisi 25 ml HCl 0,02 N dan 2-4 tetes indikator mengsel (campuran metil merah 0,02% dalam alkohol dan metil biru 0,02% dalam alkohol (2:1)) diletakkan di bawah kondensor. Ujung tabung kondensor harus terendam dalam larutan HCl. Destilasi dilakukan sampai volume larutan dalam erlenmeyer mencapai 2 kali volume awal. Ujung kondensor dibilas dengan akuades (ditampung dalam erlenmeyer). Larutan yang berada dalam erlenmeyer dititrasi dengan NaOH 0,02 N hingga diperoleh perubahan warna dari hijau menjadi ungu. Setelah itu dilakukan penetapan blanko. Keterangan: a = ml NaOH untuk titrasi blanko b = ml NaOH untuk titrasi contoh N = normalitas NaOH W = bobot contoh (g) 3.4.5 Analisis kadar serat kasar (Apriyantono et al. 1989) Sebanyak 2 g contoh bebas air dimasukkan ke dalam erlenmeyer 500 ml dan ditambahkan 100 ml H 2 SO 4 0,325 N. Campuran tersebut dihidrolisis dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 105 o C dan didinginkan serta ditambahkan NaOH 1,25 N sebanyak 50 ml. Kemudian dilakukan hidrolisis kembali dalam autoklaf selama 15 menit. Sampel disaring dengan kertas saring yang telah dikeringkan dan diketahui bobotnya. Kertas saring tersebut dicuci berturut-turut dengan air panas, 25 ml H 2 SO 4 0,325 N, air panas dan terakhir menggunakan aseton/alkohol 25 ml. Kertas saring tersebut dikeringkan dalam oven bersuhu 105 o C selama 1 jam dan dilanjutkan sampai bobotnya tetap. Kadar serat ditentukan dengan rumus:
20 Keterangan: a = b = C = bobot residu serat dalam kertas saring (g) bobot kertas saring kering (g) bobot bahan awal (g) 3.4.6 Analisis kadar karbohidrat by difference Kadar karbohidrat dihitung dengan rumus sebagai berikut: Kadar karbohidrat (%) = 100% (% kadar air + % kadar abu + % kadar lemak + % kadar protein + % kadar serat kasar ) 3.4.7 Analisis sulfat (FMC Corp. 1997) Sampel sebanyak 1 g dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer kemudian ditambahkan 50 ml HCl 0,2 N dan direfluks smapai mendidih selama 1 jam. Ke dalamnya ditambahkan 25 ml larutan H 2 O 2 (1:10) dan direfluks selama 6 jam sampai larutan menjadi jernih. Larutan ini dipindahkan ke dalam gelas piala dan dipanaskan sampai mendidih. Selanjutnya ditambahkan 10 ml larutan BaCl 2 (tetes demi tetes sambil diaduk) di atas penangas selama 2 jam. Endapan yang terbentuk disaring dengan kertas saring tak berabu dan dicuci dengan aquades mendidih hingga bebas klorida. Kertas saring dikeringkan dalam pven pengering, kemudian diabukan pada suhu 1000 o C sampai didapat abu berwarna putih. Abu didinginkan dala desikator kemudian ditimbang. Perhitungan kadar sulfat adalah sebagai berikut : P, Kadar sulfat (%) = x 100% keterangan : P = Berat endapan BaSO 4 (g) 0,4116 = massa atom relatif SO 4 dibagi dengan massa atom relatif BaSO 4
21 3.4.8 Analisis komposisi serat (Van Soest 1963) 1) Penetapan Kadar NDF Larutan NDF dibuat dengan mencampurkan 18,61 g EDTA- 2 Na, 6,81 g Na 2 B 4 O 7. 10H 2 O 2, 30 g sodium lauril sulfat, 4,56 g Na 2 HPO 4 dengan 10 ml 2- etoksi-etanol dilarutkan sampai 1 liter, sehingga ph 6,9-7,1. sebanyak 1 g (a) sampel dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Sampel ditambahkan 200 ml larutan NDF dan 0,5 g Na 2 SO 3. Campuran direfluks pada pendingin tegak selama 60 menit, kemudian campuran disaring melalui cawan penyaring (b) dan endapan dicuci dengan akuades panas beberapa kali. Endapan yang terbentuk dicuci kembali dengan aseton beberapa kali, dikeringkan pada oven bersuhu 105 o C sampai diperoleh berat tetap (sekitar 8 jam) dan ditimbang (c). NDF (%) = 2) Penetapan Kadar ADF Sebanyak 1 g (a) sampel dimasukkan ke dalam gelas piala 600 ml, kemudian ditambahkan 100 ml larutan ADS (acid detergent solution) (20 g setil trimetil ammonium bromida dalam 1 l H 2 SO 4 1N) dan 2 ml dekalin. Ekstraksi selama satu jam setelah mendidih. Campuran tersebut kemudian disaring melalui cawan penyaring (b) dan endapan yang didapatkan dicuci dengan akuades panas beberapa kali. Endapan dicuci kembali dengan aseton beberapa kali dan filter glass dikeringkan dalam oven 105 o C sampai diperoleh berat yang tetap (sekitar 8 jam), kemudian ditimbang (c). ADF (%) = Hemiselulosa (%) = % NDF - % ADF 3) Kadar Selulosa dan Lignin Sampel dari uji ADF diletakkan pada cawan kaca masir dalam nampan yang berisi air dingin setinggi 1 cm. Larutan lignin sebanyak 2,5 ml dimasukkan ke dalam cawan. Ketinggian air diatur hingga dapat mengurangi laju aliran alir
22 larutan keluar cawan dan diaduk menggunakan batang gelas. Cawan disimpan pada suhu kamar selama 9-90 menit, kalau diperlukan dapat dilakukan penambahan larutan lignin. Cawan diisap dengan pompa vakum hingga kering dan disimpan dalam nampan bersih. Larutan demineral dimasukkan ke dalam cawan hingga setengah dari volume cawan, setelah 5 menit disaring hingga kering, dilakukan beberapa kali hingga warna serat menjadi putih (selama 20-30 menit). Selanjutnya sampel dicuci menggunakan etanol 80% dan aseton. Cawan dikeringkan semalam pada lemari pengering 105 o C dan ditimbang (d). Lignin dihitung sebagai bagian yang hilang dari ADF. Selanjutnya sampel dibakar dalam tanur 400-600 o C selama 3 jam dan ditimbang (e). kadar selulosa (%) = kadar lignin (%) = Keterangan : a = berat bahan awal (g) b = berat cawan penyaring (g) c = berat bahan+cawan setelah dioven (g) d = berat bahan+cawan setelah dioven dan dicuci dengan aseton (g) e = berat bahan + cawan setelah ditanur (g) 3.4.9 Kandungan 3,6 anhidrogalaktosa (Zatnika dan Istini 2008) Sebanyak 54 mg fruktosa ditimbang dan dimasukkan ke dalam gelas piala, kemudian ditambahkan 100 ml larutan jenuh asam benzoat. Larutan standard dibuat dari konsentrasi 0,003 M, kemudian dilakukan pengenceran dengan konsentrasi 0,00006 M; 0,00012 M; 0,00018 M; 0,00024 M; dan 0,0003 M. Stok Resorcinol: sebanyak 0,13 g resorcinol ditimbang dan ditambah aquades hingga volumnya mencapai 100 ml. Larutan tersebut disimpan dalam lemari es, jika akan digunakan larutan dipanaskan pada suhu kamar.
23 Stok Asetaldehida: sebanyak 0,18 ml asetaldehida diencerkan dengan aquades hingga volum mencapai 25 ml. Sebanyak 10 ml larutan diambil dan diencerkan dengan aquades hingga volumnya mencapai 1000 ml. Working Reagen: stok resornicol diambil sebanyak 25 ml dan ditambah 25 ml HCl pekat, kemudian ditambah 2,5 ml stok asetaldehid. Larutan ini digunakan dalam waktu 30 menit. Larutan sampel: sebanyak 20 mg sampel ditimbang dan dimasukkan labu erlenmeyer, kemudian dibilas menggunakan aquades dan dipanaskan sambil diaduk. Setelah itu ditambahkan aquades kembali hingga volumnya mencapai 100 ml, kemudian sebanyak 1 ml sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Sampel, larutan fruktosa standard dan blanko (aquades) sebanyak 1 ml didinginkan selama 10 menit dalam ice bath, kemudian ditambahkan 10 ml working reagen sambil diaduk hingga rata. Selanjutnya semua sampel dipindahkan dalam ice bath dan didinginkan selama 5 menit, kemudian dipindahkan ke dalam water bath selama 10 menit dengan suhu 80 0 C hingga terbentuk warna merah jingga. Sampel kemudian didinginkan kembali di dalam ice bath selama 1,5 menit, setelah itu tabung reaksi diletakkan di rak dan dibiarkan sampai mencapai suhu kamar. Absorbannya dibaca pada panjang gelombang 550 nm dengan menggunakan spektrofotometri dan dibandingkan dengan standard yang telah dibuat. Kadar 3,6-anhidrogalaktosa (%) = Σ mol x BM x 100% berat sampel BM galaktosa = 180,2 3.5 Rancangan Percobaan dan Analisis Data Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh jenis rumput laut terhadap nilai komposisi kimia yang dihasilkan. Perancangan percobaan yang digunakan pada penelitian kali ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktor tunggal yaitu jenis rumput laut, masingmasing 2 (dua) kali pegulangan dengan menggunakan uji lanjut Duncan. Software
24 SPSS 15 digunakan sebagai piranti pendukung. Model umum rancangan acak lengkap (RAL) dengan sebaran t-student menurut Mattjik dan Jaya (2006) adalah sebagai berikut: x μ t = s / n keterangan : t = sebaran statistik x = nilai rataan µ = pengaruh rata-rata pengamatan (nilai tengah umum) s = standar deviasi n = ukuran sampel Pada nilai yang berbeda nyata akan dilakukan uji lanjut Duncan menurut Steel dan Torie (1993) dengan rumus sebagai berikut: Y ij = µ+ τ i + ε ij Keterangan : Y ij = nilai pengamatan dari faktor jenis sampel taraf ke-i pada ulangan ke-j µ = Pengaruh rata-rata pengamatan (nilai tengah umum) τ i = Pengaruh jenis rumput laut ε ij = faktor galat Nilai komposisi kimia yang didapatkan diuji menggunakan hipotesis; H 0 = jenis rumput laut tidak berpengaruh terhadap komposisi kimia yang dihasilkan H 1 = jenis rumput laut berpengaruh terhadap nilai komposisi kimia yang dihasilkan