23 III. METODE A. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari-April 2015 di Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung. B. Alat dan Bahan Alat-alat yang akan digunakan dalam penelitian ini antara lain alat-alat gelas, jarum ose, pembakar spritus, termometer, batang pengaduk, spatula, lemari pendingin Sanyo SF-C18K, mikropipet Eppendorff, autoclave model S-90N, laminar air flow CURMA model 9005-FL, neraca analitik Ainsworth AA-160, sentrifuga model 225 Fisher Scientific, shaker incubator invitro, ph meter Metrohm Mobile 826, waterbath Haake W19, penangas Precisterm JP Selecta, magnetic stirrer STUART (stir CB161 dan heat-stir CB162) dan spektrofotometer UV-VIS Carry Win UV 32. Adapun bahan-bahan yang akan digunakan pada penelitian ini adalah NA (Nutrient Agar), pepton, ekstrak ragi, glukosa, ammonium sulfat, akuades, alkohol, TNBS (asam 2,4,6-trinitrobenzena-sulfonat), larutan TCA (Tricloro
24 Asetic Acid), larutan kasein, larutan BSA (Bovine Serum Albumin), tirosin, Na 2 CO 3, NaOH, CuSO 4.5H 2 O, reagen follin ciocalteau, Na/K-tartrat, NaCl, NaH 2 PO 4.H 2 O, Na 2 HPO4.2H 2 O, asam borat, Na 2 B 4 O 7.10H 2 O, kantong selofan, kertas saring, dan sitrakonat anhidrat. Mikroorganisme penghasil enzim protease yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri B. subtilis ITBCCB148 yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi dan Teknologi Bioproses Jurusan Teknik Kimia Institut Teknologi Bandung. C. Prosedur Penelitian 1. Pembuatan media inokulum dan fermentasi Media inokulum dan fermentasi yang digunakan terdiri dari 00,5% pepton, 0,5% ekstrak ragi, 0,25% glukosa, 0,1% KH 2 PO 4, 0,05% MgSO 4.2H 2 O dan 0,25% NaCl dilarutkan dalam akuades, kemudian disterilkan padu suhu 121 o C dan tekanan 1 atm selama 15 menit dalam autoclave. 2. Produksi enzim protease Sebanyak 3 ose B. subtilis ITBCCB148 dari media agar miring dipindahkan ke dalam media inokulum secara aseptis, lalu dikocok dalam shaker inkubator dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 32 o C selama 24 jam. Selanjutnya media inokulum (2% dari volume media fermentasi)
25 dipindahkan ke dalam media fermentasi dan dikocok dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 32 o C selama 72 jam. 3. Isolasi enzim protease Sentrifugasi merupakan tahap awal pemurnian enzim. Metode ini digunakan untuk memisahkan enzim ekstraseluler dari sisa-sisa sel. Sentrifugasi dilakukan pada suhu rendah (di bawah suhu kamar) untuk menjaga kehilangan aktivitas enzim (Suhartono, 1989). Sentrifugasi akan menghasilkan filtrat yang jernih dan endapan yang terikat kuat pada dasar tabung, yang kemudian dipisahkan secara manual. Media fermentasi yang berisi B. subtilis ITBCCB148 dikocok menggunakan shaker inkubator pada suhu 32 o C selama 72 jam. Kemudian dilakukan pemisahan enzim dari komponen sel lainnya dengan sentrifugasi pada 5000 rpm suhu 4 o C selama 30 menit. Filtrat yang diperoleh merupakan ekstrak kasar enzim yang selanjutnya dilakukan uji aktivitas protease dengan metode Kunitz dan pengukuran kadar protein dengan metode Lowry. 4. Pemurnian Enzim Protease a. Fraksinasi dengan ammonium sulfat Ekstrak kasar enzim yang diperoleh dimurnikan dengan cara fraksinasi dengan garam ammonium sulfat pada berbagai derajat kejenuhan yaitu (0-20 %; (20-40)%; (40-60)%; (60-80)%; dan (80-100)% untuk mengetahui pada fraksi mana enzim protease
26 terendapkan. Skema proses pengendapan protein enzim dengan penambahan garam ammonium sulfat ditunjukkan pada Gambar 8. Ekstrak Kasar Enzim + (NH 4 ) 2 SO 4 (0-20%) Endapan(F1) Filtrat + (NH 4 ) 2 SO 4 (20-40%) Endapan(F2) Filtrat + (NH 4 ) 2 SO 4 (40-60%) Endapan(F3) Filtrat + (NH 4 ) 2 SO 4 (60-80%) Endapan(F4) Filtrat + (NH 4 ) 2 SO 4 (80-100%) Endapan(F5) Filtrat Gambar 8. Skema proses pengendapan protein enzim dengan pengendapan ammonium sulfat Sejumlah ekstrak kasar enzim yang diperoleh ditambahkan garam ammonium sulfat secara perlahan sambil diaduk dengan magnetic stirer pada suhu 4 o C. Endapan protein enzim yang didapatkan pada tiap fraksi kejenuhan ammonium sulfat dipisahkan dari filtratnya dengan sentrifugasi dingin pada kecepatan 5000 rpm selama ±30 menit. Kemudian endapan yang diperoleh dilarutkan dengan buffer fosfat 0,1 M ph 6,0 dan diuji aktivitasnya dengan metode Kunitz serta diukur kadar
27 proteinnya dengan metode Lowry. Selanjutnya, filtrat yang didapat dari fraksi (0-20)% digunakan untuk diendapkan dengan fraksi kejenuhan selanjutnya dengan prosedur yang sama. b. Dialisis Endapan enzim yang telah dilarutkan dari tiap fraksi amonium sulfat dengan aktivitas spesifik yang tinggi, dimasukkan ke dalam kantung selofan dan didialisis dengan 0,01 M buffer fosfat ph 6,0; selama + 24 jam pada suhu dingin (Pohl, 1990). Selama dialisis, dilakukan penggantian buffer selama 4-6 jam agar konsentrasi ion-ion di dalam kantong dialisis dapat dikurangi. Proses ini dilakukan secara kontinyu sampai ion-ion di dalam kantong dialisis dapat diabaikan. Untuk mengatahui bahwa sudah tidak ada lagi ion-ion garam dalam kantong, maka diuji dengan menambahkan larutan Ba(OH)2 atau BaCl 2. Bila masih ada ion sulfat dalam kantong, maka akan terbentuk endapan putih BaSO 4. Semakin banyak ion sulfat yang ada dalam kantong, semakin banyak pula endapan yang terbentuk. Selanjutnya dilakukan uji aktivitas enzim dengan metode Kunitz dan kadar proteinnya dengan metode Lowry.
28 5. Uji Aktivitas Protease a. Metode Kunitz 1. Pembuatan pereaksi untuk pengukuran aktivitas protease metode Kunitz Larutan kasein : sebanyak 1 gram kasein dilarutkan dalam 100 ml buffer fosfat ph 7, kemudian dipanaskan pada suhu < 100 o C dalam penangas air hingga kasein larut. Larutan TCA : sebanyak 5 gram TCA (Tricloro Aseti Acid) dilarutkan dalam 100 ml akuades. Larutan standar : larutan tirosin dengan kadar 0-800 ppm. 2. Pengujian aktivitas protease metode Kunitz Sampel : Larutan enzim sebanyak 1 ml dimasukan ke dalam tabung reaksi dan ditambah larutan kasein 1% sebanyak 1 ml. Kemudian diinkubasi pada suhu 60 o C selama 30 menit dalam penangas air. Setelah itu, ditambah larutan TCA 5% sebanyak 3 ml, dikocok lalu didiamkan pada suhu ruang selama ±30 menit atau disentrifugasi selama ±20 menit agar pengendapan sempurna. Kontrol : Larutan enzim sebanyak 1 ml dan ditambah larutan TCA 5% sebanyak 3 ml. Kemudian diinkubasi pada suhu 60 o C selama 30 menit dalam penangas air. Setelah itu, larutan kasein 1% sebanyak 1 ml, dikocok lalu didiamkan pada suhu ruang selama ±30 menit atau disentrifugasi selama ±20 menit agar pengendapan sempurna.
29 Selanjutnya filtrat diukur dengan spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 280 nm. Aktivitas enzim dihitung berdasarkan jumlah asam amino (peptida sederhana) yang terbentuk dengan menggunakan kurva standar tirosin. Digunakan standar tirosin karena sebagian besar protein mengandung tirosin. b. Metode Lowry 1. Pembuatan pereaksi untuk pengukuran kadar protein metode Lowry Pereaksi A : 2 gram Na 2 CO 3 dilarutkan dalam 100 ml NaOH 0,1N. Pereaksi B : 5 ml larutan CuSO 4.5H 2 O 1% ditambahkan ke dalam 5 ml larutan Na/K -tartrat 1%. Pereaksi C : 2 ml pereaksi B + 100 ml pereaksi A. Pereaksi D : reagen folin ciocelteau diencerkan dengan akuades 1:1. Larutan standar : Larutan BSA (Bovine Serum Albumin) dengan kadar 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140 ppm.
30 2. Pengujian kadar protein metode Lowry Sampel : Larutan enzim sebanyak 0,1 ml ditambah akuades 0,9 ml dan direaksikan dengan pereaksi C 5 ml. Lalu dikocok dan didiamkan selama 10 menit pada suhu ruang. Setelah itu, ditambahkan 0,5 ml pereaksi D dan didiamkan selama 30 menit pada suhu ruang. Kontrol : Larutan enzim sebanyak 0,1 ml diganti dengan 0,1 ml akuades. Selanjutnya perlakuannya sama seperti sampel. Serapan diukur dengan spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 750 nm. Untuk menentukan konsentrasi protein enzim dugunakan standar protein BSA (Bovine Serum Albumin). 6. Modifikasi Kimia Residu lisin pada suatu enzim secara spesifik dapat dimodifikasi dengan sitrakonat anhidrida yang prosedurnya telah dilaporkan oleh Khajeh et al., (2004). Sebanyak 10 ml enzim hasil pemurnian dalam 10 ml larutan buffer borat ph 8 ditambahkan reagen sitrakonat anhidrida sebanyak 30µL secara bertahap. Setiap penambahan reagen, ph larutan dijaga konstan pada ph 8 dengan menambahkan larutan NaOH 2 M, lalu diaduk menggunakan magnetic stirer selama 60 menit. Penambahan reagen sitrakonat anhidrida dilakukan dengan variasi volume sebagai berikut : 30µL, 40µL, dan 50µL dan dilakukan dengan prosedur yang sama.
31 7. Karakterisasi Enzim Sebelum Dan Sesudah Modifikasi a. Penentuan ph optimum Untuk mengetahui ph optimum enzim sebelum dan sesudah dimodifikasi digunakan buffer fosfat 0,05 M dengan ph bervariasi, yaitu 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5 dan 9,0. Suhunya dijaga tetap pada 60 o C. Kemudian dilanjutkan dengan pengukuran aktivitas enzim dengan metode Kunitz dan kadar proteinnya dengan metode Lowry. b. Penentuan suhu optimum Sedangkan untuk mengetahui suhu optimum, digunakan suhu yang bervariasi yaitu 40; 45; 50; 55; 60; 65; 70; 75 dan 80 o C dengan ph optimum yang telah ditentukan. Selanjutnya dilakukan pengukuran aktivitas enzim dengan metode Kunitz dan kadar proteinnya dengan metode Lowry. c. Penentuan nilai K M dan V maks Konstanta Michaelis-Menten dan laju reaksi maksimum (V maks ) enzim sebelum dan sesudah dimodifikasi ditentukan dari persamaan Lineweaver-burk. Untuk membuat kurva Lineweaver-burk dilakukan dengan menguji aktivitas enzim protease menggunakan metode Kunitz dengan variasi konsentrasi substrat 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 dan 1,0% dalam buffer fosfat pada ph dan suhu optimum selama 30 menit.
32 d. Penentuan stabilitas termal dan stabilitas ph enzim (Yang et al., 1996) Uji kestabilan termal enzim sebelum dan sesudah modifikasi dilakukan dengan mengukur aktivitas sisa enzim setelah diinkubasi selama 0, 60, 120, 180, 240, dan 300 menit pada ph dan suhu optimumnya (Virdianingsih, 2002). e. Penentuan waktu paruh (t 1/2 ),konstanta laju inaktivasi (k i ),dan perubahan energi akibat denaturasi ( G i ) Penentuan nilai k i (konstanta laju inaktivasi termal) enzim protease hasil pemurnian dan hasil modifikasi kimia dilakukan dengan menggunakan persamaan kinetika inaktivasi orde 1: 1n (E i /E 0 )= -k i t (1) Sedangkan untuk perubahan energi akibat denaturasi ( G i ) enzim hasil pemurnian dan hasil modifikasi kimia dilakukan dengan menggunakan persamaan: Keterangan : Gi=-RT 1n(k i h/k B T) (2) R = konstanta gas (8,315 J K -1 mol -1 ) T = suhu absolut (K) k i = konstanta laju inaktivasi termal h = konstanta Planck (6,63 x 10-34 J det) k B= konstanta Boltzman (1,381 x 10-23 JK -1 )
33 8. Penentuan derajat modifikasi (Synder and Sobocinski, 1975) Derajat modifikasi enzim merupakan perbandingan antara residu lisin dalam enzim yang termodifikasi terhadap residu lisin sebelum dimodifikasi. Cara penentuannya sebagai berikut : untuk sampel, sebanyak 0,1 ml enzim yang telah dimodifikasi dilarutkan dalam 0,9 ml bufer borat (ph 9,0). Kemudian ditambahkan 25 μl 0,03 M asam 2,4,6- trinitrobenzena-sulfonat (TNBS). Campuran ini dikocok dan dibiarkan pada suhu kamar selama 30 menit. Enzim hasil pemurnian (sebelum modifikasi). Blanko terdiri dari 1 ml buffer borat 0,1 M ph 9,0 dan 25µL TNBS 0,03 M. Absorbansi diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 420 nm. Derajat modifikasi dapat dihitung dengan menggunakan rumus : Derajat modifikasi = Keterangan : A St = absorbansi larutan standar A B1 = absorbansi larutan blanko A Sp= absorbansi larutan sampel = Jumlah residu lisin yang termodifikasi x 100% Jumlah residu lisin awal
34 Secara keseluruhan, penelitian ini terangkum dalam diagram alir penelitian yang ditunjukkan dalam Gambar 9. Produksi Enzim Ekstrak Kasar Enzim Uji aktivitas enzim protease (metode Kunitz) dan penentuan kadar protein metode Lowry Pemurnian Enzim : 1. Fraksinasi dengan ammonium sulfat 2. Dialisis Modifikasi Karakterisasi Enzim Enzim hasil modifikasi Penentuan suhu dan ph optimum Penentuan Km dan Vmaks Penentuan stabilitas termal dan ph Gambar 9. Diagram alir penelitian