IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. PENENTUAN KADAR C (KARBON) DAN KADAR N (NITROGEN) MEDIA KULTIVASI Hasil analisis molases dan urea sebagai sumber karbon dan nitrogen menggunakan metode Walkley-Black dan Kjeldahl, dapat dilihat pada Tabel 5. Tabel 5. Hasil analisis karbon, nitrogen, kadar air dan kadar abu molases dan urea Bahan Kadar (%) C(b/b) N(b/b) Kadar air Kadar abu Molases 1% 0.54 0.04 99.08 0.08 Urea 0.07 45.11 Tidak diukur Tidak diukur Keterangan : C= karbon, N=Nitrogen b/b = bobot/bobot Analisis kadar karbon pada molases 1% yang ditunjukan pada Tabel 5, nilainya lebih besar (0.54%) dari analisis kadar karbon dari molases 1% yang juga dilakukan oleh Suastuti (1998) yakni sebesar 0.37%. Perbedaan ini disebabkan karena komposisi molases dipengaruhi oleh varietas dan kematangan tebu, kondisi iklim dan tanah. Di samping itu kondisi proses pada pabrik gula juga mempengaruhi komposisi molases. Kadar nitrogen dari urea yang dianalisis adalah sebesar 45.11% tidak berbeda dengan kadar nitrogen pupuk urea buatan PT PUSRI Palembang yang umumnya mengandung minimal 46% nitrogen (Chan dan Sumarna, 1986). B. POLA PERUBAHAN ph Nilai ph cairan kultur selama kultivasi P. putida berkisar antara 7.32-9.21. ada Pada awal kultivasi ph medium mengalami penurunan pada jam ke-6 sampai jam ke- 12 kemudian nilai ph naik kembali dan cenderung stabil hingga akhir kultivasi (jam ke-48). Berdasarkan analisis ragam (Lampiran 12, 13, 14), formula media kultivasi 19

berbeda nyata pada taraf nyata 5% untuk perubahan ph di tiap-tiap waktu pengambilan sampel selama kultivasi dan formula media kultivasi memberikan beda nyata pada taraf nyata 5% untuk penurunan ph antara nilai ph pada awal kultivasi dengan nilai ph terendah selama kultivasi, jadi minimal ada satu formula yang memberikan pengaruh berbeda dibanding formula yang lain pada taraf nyata 5% (Lampiran 15). Pola perubahan ph cairan kultivasi dapat dilihat pada Gambar 6 berikut ini. Gambar 6. Kurva perubahan ph medium selama kultivasi Besarnya penurunan ph berbeda, tergantung kepada konsentrasi molases (tetes tebu) yang digunakan. Semakin tinggi konsentrasi molases, semakin tinggi pula penurunan ph. Menurut Hilwan et al. (2006), semakin banyak jumlah karbon yang terdapat dalam media maka pembentukan asam piruvat di dalam cairan kultivasi akan semakin meningkat. Terjadinya perubahan ph selama kultivasi adalah hal yang umum terjadi. Hal ini juga sesuai dengan yang dinyatakan oleh Jenkins dalam Cartledge (1992) dimana ph dari suatu kultur metabolisme tidak tetap sepanjang waktu. Perubahan ph ini berhubungan dengan (1) degradasi protein dan senyawa protein lain dengan membentuk ammonia atau produk alkalin lain (2) pengambilan kation dan anion tertentu (3) metabolisme substrat karbon dengan membentuk asam organik. 20

Terjadinya penurunan ph ini karena bakteri menggunakan sumber karbon dalam metabolismenya yang menghasilkan senyawa metabolisme seperti asam asetat, asam piruvat dan asam karboksilat. Hal ini dinyatakan juga oleh Jenkins dalam Cartledge (1992) bahwa jika sumber karbon yang paling besar di dalam kultur medium adalah suatu karbohidrat maka ph akan turun selama pertumbuhan eksponensial pada kondisi aerob. Pada proses ini, asam organik jika berdisosiasi dalam air akan menghasilkan H + yang dapat menurunkan ph cairan kultivasi. Terbentuknya asamasam organik tersebut melalui proses katabolisme glukosa dan siklus asam trikarboksilat (TCA) yang merupakan kelanjutan dari reaksi glikolisis. Asam-asam ini merupakan substrat untuk anabolisme dalam sintesis asam amino dan makromolekul lain (Dawes dan Sutherland, 1976). Manfaat lain adanya asam-asam organik seperti asam oksalat yang dihasilkan P. putida, juga akan menguntungkan tanaman dalam memperoleh unsur P dalam tanah, terutama pada tanah masam yang tidak mampu menyediakan fosfat yang cukup bagi tanaman. Pada tanah yang demikian, efisiensi pemupukan P menjadi sangat rendah karena sebagian besar P yang diberikan terikat dengan alumunium, besi dan mangan dengan membentuk senyawa yang sukar larut. Oleh karena itu, dengan adanya asamasam organik akan membentuk kompleks dengan Al, Fe, Mn sehingga fosfat tidak terikat oleh ion-ion tersebut. Unsur P diperlukan oleh tanaman sebagai unsur makro untuk pertumbuhan. Peningkatan nilai ph cairan kultivasi disebabkan oleh penggunaan urea sebagai sumber nitrogen. James (1993) seperti dikutip Wicaksono (2000) menyatakan bahwa urea jika dilarutkan ke dalam air akan mengalami reaksi kimia dan berubah menjadi ammonium bikarbonat. Reaksi kimia ini akan menyebabkan peningkatan ph larutan dan reaksi ini berlangsung hingga jam ke-48 (akhir kultivasi). Kenaikan ph disebabkan oleh terakumulasinya bahan-bahan alkalin hasil metabolisme urea. C. POLA PERTUMBUHAN Pseudomonas putida SELAMA KULTIVASI Pertumbuhan bakteri dapat dilihat dengan peningkatan kekeruhan (optical density) dan bobot kering biomassa yang dihasilkan selama kultivasi. Pola pertumbuhan P. putida selama proses kultivasi dapat dilihat pada Gambar 7, 8 dan 9 berikut ini. 21

Gambar 7. Pola pembentukan biomassa oleh Pseudomonas putida selama kultivasi dalam medium A1B (molases 1%, urea 1%) Gambar 8. Pola pembentukan biomassa oleh Pseudomonas putida selama kultivasi pada medium A2B (molases 1.25%, urea 1%) 22

Gambar 9. Pola pembentukan biomassa oleh Pseudomonas putida selama kultivasi pada medium A3B (molases 1.5%, urea 1%) Pola pertumbuhan sel pada ketiga perlakuan memiliki pola yang sama yaitu fase adaptasi (lag), fase logaritmik (eksponensial) dan stasioner. Selain itu juga menunjukan pola pertumbuhan diauksik yakni pola pertumbuhan yang dicirikan oleh dua fase eksponensial yang dipisahkan dengan fase lag. Pertumbuhan diauksik terjadi karena pengunaan dua sumber karbon yakni glukosa dan fruktosa (monosakarida) dan sukrosa (disakarida). Sumber karbon yang mudah dimetabolisme seperti monosakarida merupakan molekul gula sederhana akan digunakan terlebih dahulu. Setelah sumber karbon yang pertama habis, sel akan memasuki fase stasioner sampai suatu ketika laju pertumbuhannya akan meningkat lagi. Dalam fase pertumbuhan kedua, P. putida akan menggunakan sumber karbon yang lebih kompleks seperti sukrosa yang merupakan disakarida. Pada setiap perlakuan, fase adaptasi pertumbuhan pertama pada konsentrasi molasses 1% urea 1% (A1B) berlangsung relatif cepat karena sel bakteri dapat menyesuaikan kondisi pertumbuhanya pada media kultivasi sedangkan pada konsentrasi molases 1.25% urea 1% (A2B) dan konsentrasi molasses 1.5% urea 1% (A3B) memiliki fase adaptasi yang berlangsung dari awal kultivasi sampai jam ke- 6, setelah fase adaptasi kemudian dilanjutkan oleh fase eksponensial pertama. 23

Pada konsentrasi molasses 1% urea 1% (A1B) fase eksponensial berlangsung dari awal kultivasi sampai jam ke-6, sedangkan molases 1.25% urea 1% (A2B) berlangsung dari jam ke-6 sampai jam ke-18 dan molasses 1.5% urea 1% fase eksponensial berlangsung dari jam ke-6 sampai jam ke-12, setelah itu dilanjutkan dengan fase stasioner. Fase stasioner ini sebagai awalan untuk mulai memasuki fase adaptasi pada fase pertumbuhan kedua yang diikuti fase eksponensial dan fase stasioner pertumbuhan kedua. Pada konsentrasi molases 1% urea 1% fase eksponensial kedua dari jam ke- 12 hingga jam ke-18, pada konsentrasi 1.25% urea 1% (A2B) fase eksponensial kedua terjadi dari jam ke-36 sampai jam ke-42 diikuti dengan fase stationer kedua hingga akhir kultivasi. Pada konsentrasi 1.5% urea 1% (A3B) fase eksponensial kedua dari jam ke-30 hingga jam ke-36 setelah itu terjadi fase stationer kedua hingga jam ke-48. Berikut ini kurva antara ln[biomassa] terhadap lama kultivasi yang menunjukan pola pertumbuhan sel (Gambar 10). Gambar 10. Pola pertumbuhan sel Pseudomonas putida pada setiap perlakuan A1 = molases 1%; A2 = molases 1.25%; A3 = molases 1.5%; B = urea 1% Perbanyakan sel terjadi setelah fase adaptasi dengan meningkatnya konsentrasi sel dalam cairan kultivasi. Pada fase ini laju pertumbuhan (dx/dt) meningkat. Saat laju pertumbuhan mencapai titik maksimal maka pertumbuhan berlangsung secara 24

logaritmik (eksponensial). Semakin tinggi konsentrasi molases, berarti sumber karbon semakin banyak, dengan demikian bakteri memiliki kebutuhan akan sumber karbon juga semakin banyak, sehingga dapat memperpanjang fase eksponensial bakteri, tetapi substrat yang berlebihan juga dapat menjadi penghambat pertumbuhan bakteri. Fase stasioner (pertumbuhan tetap) yang mana jumlah sel mati seimbang dengan jumlah sel baru (tumbuh) dan populasinya stabil (Fardiaz, 1988; Tortora et al., 1989; Schuler dan Kargi, 1992) Fase stasioner tidak selalu disebabkan oleh kehabisan nutrisi esensial tetapi dapat disebabkan oleh perubahan ph medium kultivasi yang dapat menghambat sintesis sel lebih jauh (Pritchard dan Tempest dalam Mandelstam, 1986). D. POLA PEMBENTUKAN BOBOT KERING BIOMASSA Bobot kering biomassa yang dihasilkan tertinggi pada konsentrasi molases 1.5% urea 1% (A2B) sebesar 3.495 (g/l) pada jam ke-48, konsentrasi molases 1.25% urea 1% (A3B) sebesar 2.196 (g/l) pada jam ke-42 dan konsentrasi molases 1% urea 1% (A1B) sebesar 1.951 (g/l) pada jam ke-42. Berdasarkan dengan analisis ragam, formula media berbeda nyata dengan taraf 5% untuk peningkatan bobot kering biomassa selama kultivasi (Lampiran 17), untuk jam ke-12 (W12), jam ke- 18 (W18), jam ke-24 (W24) dan jam ke-48 (W48) dapat dilihat pada Lampiran 18, sehingga hanya pada waktu-waktu itulah formula media berpengaruh untuk bobot kering biomassa. Pengaruh konsentrasi molases dan urea terhadap pertumbuhan sel (peningkatan bobot kering biomassa) dapat dilihat pada gambar berikut ini (Gambar 11). 25

Gambar 11. Pengaruh konsentrasi molases dan urea terhadap peningkatan bobot kering biomassa Tingginya bobot kering biomassa pada konsentrasi molases 1.5% dan urea 1% (A3B) menunjukan adanya kandungan kadar karbon lebih banyak yang dapat termanfaatkan oleh P. putida untuk pertumbuhannya. Dalam hal ini pada setiap perlakuan media kultivasi yang diujikan terdapat korelasi positif antara peningkatan kadar karbon pada molases terhadap peningkatan bobot kering biomassa P. putida. E. PENGGUNAAN SUBSTRAT SELAMA KULTIVASI Selama kultivasi berlangsung, sel bakteri mengkonversi substrat menjadi biomassa dan produk. Hal ini ditandai dengan berkurangnya konsentrasi sumber karbon. Tinggi rendahnya total sisa gula dipengaruhi oleh kemampuan sel dalam mengkonversi gula dari molases sebagai sumber karbon menjadi biomassa. Efisiensi penggunaan substrat tertinggi adalah media A3B (konsentrasi molases 1.5% dan urea 1%) yakni 0.7210 (72.10%). Berikut ini grafik efisiensi penggunaan sumber karbon dari setiap perlakuan (Gambar 12). 26

Gambar 12. Efisiensi penggunaan sumber karbon selama kultivasi (A1 = molases 1%; A2 = molases 1.25%; A3 = molases 1.5%; B = urea 1%) Berdasarkan analisis ragam bahwa formula media berpengaruh nyata pada taraf 5% untuk pengurangan substrat selama kultivasi berlangsung (Lampiran 19), hal ini terjadi pada jam ke-0 (W0), ke-6 (W6), ke-12 (W12) dan ke-24 (W24), maka pada waktu-waktu itulah formula media berpengaruh untuk total sisa gula (Lampiran 20).. Dan formula media berbeda nyata pada taraf 5% untuk nilai efisiensi penggunaan sumber karbon (Lampiran 21), pada jam ke-6 (W6), ke-12 (W12) dan jam ke-24 (W24) (Lampiran 22) sehingga hanya pada waktu-waktu itulah formula media berpengaruh untuk efisiensi penggunaan sumber karbon. Kemampuan sel dalam menggunakan substrat juga dapat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan, misalnya suhu dan ph. Sumber karbon pada molases terdapat dalam bentuk gula-gula sederhana yang dapat dimanfaatkan oleh mikroorganisme. Molases mengandung sukrosa (30-40%), glukosa ( 4-9%) dan fruktosa (5-12%) (Paturau, 1982). 27

Gambar 13. Pola penggunaan substrat pada setiap perlakuan (A1 = molases 1%; A2 = molases 1.25%; A3 = molases 1.5%; B = urea 1%). Pada jam ke-48, total sisa gula dari setiap perlakuan belum semuanya habis termanfaatkan, yakni hanya tersisa 2.704-4.500 (g/l), terjadinya kelebihan substrat yang masih belum termanfaatkan pada jam ke-48 berhubungan dengan terbatasnya jumlah bakteri yang masih hidup di dalam bioreaktor akibat dari terakumulasinya senyawa metabolit sekunder seperti antibiotik, senyawa HCN dsb yang mengganggu pertumbuhan P. putida sehingga berkurangnya bakteri tersebut dalam mengkonsumsi substrat yang masih tersisa. Berikut ini, (Gambar 14, 15, 16) pola pengurangan dan penggunaan substrat terhadap kenaikan bobot kering biomassa. Gambar 14. Kurva peningkatan biomassa terhadap pengurangan penggunaan substrat selama kultivasi dalam medium A1B (molases 1%, urea 1%) 28

Gambar 15. Kurva peningkatan biomassa terhadap pengurangan penggunaan substrat selama kultivasi dalam medium A2B (molases 1.25%, urea 1%) Gambar 16. Kurva peningkatan biomassa terhadap pengurangan penggunaan substrat selama kultivasi dalam medium A3B (molases 1.5%, urea 1% F. KINETIKA KULTIVASI Parameter kinetika kultivasi dapat digunakan untuk menentukan kecepatan pertumbuhan dari mikroorganisme, konsumsi substrat dan konversi pembentukan menjadi biomassa. 29

Tabel 6. Parameter kinetika kultivasi Parameter Kinetika A1B A2B A3B Kultivasi Xmax (g/l) 1.951 2.196 3.495 µ maks1 (jam -1 ) 0.060 0.099 0.147 µ maks2 (jam -1 ) 0.086 0.032 0.089 tdx 1(jam) 11.550 7.000 4.714 tdx 2(jam) 8.058 21.656 7.787 Yx/s 0.193±0.026 0.181±0.033 0.257±0.067 (So-S)/So 0.699 0.711 0.721 Keterangan: A1 = molases 1%; A2 = molases 1.25%; A3 = molases 1.5% B = urea 1% Tabel 6 menunjukan semakin tinggi konsentrasi molases yang digunakan maka laju pertumbuhan maksimum (µmaks) semakin tinggi. Nilai tertinggi µmaks pertumbuhan pertama terjadi pada medium dengan konsentrasi molases 1.5% urea 1% (A1B) yaitu sebesar 0.147/jam. Nilai µmaks digunakan untuk menghitung waktu yang dibutuhkan oleh sel untuk memperbanyak diri dua kali dari massa sel semula. Hasil perhitungan yang menunjukan waktu ganda sel tercepat berdasarkan massa sel sebesar 4.714 jam. Pada nilai rendemen biomassa terhadap substrat, nilai yang tertinggi terdapat pada konsentrasi molases 1.5% dan urea 1%, karena pada konsentrasi tersebut kadar karbon yang digunakan untuk pertumbuhan juga lebih tinggi. 30

Gambar 17. Pengaruh konsentrasi molases dan urea terhadap konversi substrat menjadi biomassa (Yx/s) Nilai Yx/s terbesar pada konsentrasi 1.5% dan urea 1% (A3B) sebesar 0.257±0.067 g biomassa/g substrat, sedangkan pada konsentrasi molases 1% dan urea 1% (A1B) sebesar 0.193±0.026 g biomassa/g substrat, kemudian pada konsentrasi 1.25% dan urea 1% (A2B) sebesar 0.181±0.033 g biomassa/g substrat. Efesiensi penggunaan substrat pada konsentrasi molases 1.5% dan urea 1% (A3B) sebesar 72.10%, konsentrasi molases 1.25% dan urea 1% (A2B) sebesar 71.12%, sedangkan konsentrasi molases 1% dan urea 1% (A1B) sebesar 69.89%. Nilai efesiensi penggunaan substrat tertinggi terdapat pada konsentrai molases 1.5% dan urea 1% (A3B) begitu juga dengan nilai Yx/s tertinggi terjadi pada konsentrasi 1.5% dan urea 1% (A3B). Berdasarkan analisis ragam, kosentrasi media berpengaruh nyata terhadap (Yx/s) pada taraf 5% (Lampiran 23). G. PENGUJIAN TOKSISITAS CAIRAN KULTIVASI TERHADAP NEMATODA (BIOASSAY) Bioassay merupakan salah satu cara yang dapat digunakan untuk menentukan aktivitas bahan aktif biopestisida dengan menggunakan hewan target. Biopestisida yang paling efektif adalah biopestisida yang mampu membunuh hewan target paling 31

banyak, yang ditunjukan oleh tingkat mortilitasnya. Dalam penelitian ini hewan target yang digunakan adalah nematoda Pratylenchus brachyurus. Pengujian toksisitas dilakukan dengan menggunakan filtrat bakteri P. putida hasil kultivasi jam ke-48, dengan pengenceran 20% cairan kultivasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi molases 1.5% dan urea 1% (A3B) memiliki tingkat mortalitas nematoda tertinggi sebesar 90%, konsentrasi molases 1.25% urea 1% (A2B) sebesar 82% dan terendah pada konsentrasi molases 1% urea 1% (A1B) sebesar 68%. Tingginya tingkat mortalitas nematoda pada perlakuan molasses 1.5% dan urea 1% (A3B) berhubungan dengan tingginya bobot kering biomasa yang dihasilkan yaitu sebesar 3.495 g/l, sedangkan pada perlakuan 1.25% urea 1% (A2B) dan 1% urea 1% (A1B) sebesar 2.196 g/l dan 1.951 g/l. Berikut ini (Gambar 19) menunjukan formula media terhadap persentase tingkat mortalitas nematoda. Gambar 19. Tingkat mortalitas nematoda terhadap berbagai perlakuan media kultivasi yang diujikan pada pengenceran 20% cairan kultivasi (A1B= molases 1% urea 1%, A2B= molases 1.25% urea 1%, A3B = molases 1.5% urea 1%) 32

Hasil uji toksisitas, menunjukan korelasi positif dengan peningkatan jumlah sumber karbon (kadar molases), juga dengan peningkatan biomassa. Hal ini disebabkan, bakteri P. putida memanfaatkan sumber karbon yang ada pada molases untuk pembentukan biomassa dan produk. Dan secara statistik, pada uji toksisitas (Lampiran 25) dengan taraf nyata 5% menunjukan formula media kultivasi tidak berpengaruh nyata pada tingkat toksisitas. 33