Percobaan 4 KROMATOGRAFI KOLOM & KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS Isolasi Kurkumin dari Kunyit (Curcuma longa L) I. Tujuan 1. Melakukan dan menjelaskan teknik-teknik dasar kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis 2. Menjelaskan Prinsip dasar kromatografi. 3. Melakukan isolasi campuran senyawa sampai pemurniannya secara kromatografi kolom II. Prinsip Pemisahan dua atau lebih senyawa atau ion berdasarkan kecepatan migrasinya dengan fasa gerak dan fasa diam. III. Teori dasar Kromatografi adalah suatu metode yang digunakan ilmuwan untuk memisahkan senyawa organik dan anorganik sehingga senyawa tersebut dapat dianalisis dan dipelajari. Dengan menganalisis senyawa, seorang ilmuwan dapat mengetahui apa yang membangun senyawa tersebut. Kromatografi adalah suatu metode fisik yang baik sekali untuk mengamati dan menyelidiki suatu campuran dan pelarutnya. Kata kromatografi berarti tulisan berwarna, artinya suatu cara seorang kimiawan dapat menguji campuran zat cair. Ketika mempelajari material zat warna dari tumbuhan, seorang botanis Rusia menemukan kromatografi pada tahun 1903.
Namanya adalah M.S. Tswett. Kromatografi digunakan oleh berbagai orang dan disiplin ilmu di dalam berbagai bidang. Sebagian orang menggunakan kromatografi untuk mengetahui komponen apa saja yang terdapat dalam suatu zat padat atau zat cair. Metode ini digunakan juga untuk mengetahui zat-zat yang tak dikenal dalam suatu sampel. Polisi, FBI, dan agen detektif lainnya menggunakan kromatografi ketika mengusut suatu kasus criminal. Metode ini digunakan pula untuk menguji keberadaan kokain dalam urin, alkohol dalam darah, PCB (polychlorinated benzene) dalam ikan, dan kandungan timbale dalam system perairan. Metode kromatografi adalah cara pemisahan dua atau lebih senyawa atau ion berdasarkan pada perbedaan migrasi dan distribusi senyawa atau ionion tersebut di dalam dua fasa yang berbeda. Dua fasa ini bisa berwujud padat-cair, cair-cair, atau gas-cair. Zat terlarut di dalam suatu fasa gerak mengalir pada suatu fasa diam. Zat terlarut yang memiliki afinitas terhadap fasa gerak yang lebih besar akan tertahan lebih lama pada fasa gerak, sedangkan zat terlarut yang afinitasnya terhadap fasa gerak lebih kecil akan tertahan lebih lama pada fasa diam. Dengan demikian senyawasenyawa dapat dipisahkan komponen demi komponen akibat perbedaan migrasi di dalam fasa gerak dan fasa diam. Dalam semua metode kromatografi terdapat fasa gerak dan fasa diam. Fasa diam adalah fasa yang tidak bergerak, sedangkan fasa gerak adalah fasa yang bergerak melalui fasa diam dan membawa komponen-komponen senyawa yang akan dipisahkan. Pada posisi yang berbeda-beda, senyawa-senyawa yang
berbeda akan tertahan dan terabsorbsi pada fasa diam, dan kemudian satu demi satu senyawasenyawa ini akan terbawa kembali oleh fasa gerak yang melaluinya. Dalam kromatografi kertas dan kromattografi lapis tipis, fasa gerak adalah pelarut. Fasa diam pada kromatografi kertas adalah kertas yang menyerap pelarut polar, sedangkan fasa diam pada kromatografi lapis tipis adalah pelat yang dilapisi adsorben tertentu. Kedua jenis kromatografi ini menggunakan aksi kapilaritas untuk menggerakkan pelarut melalui fasa diam. Keakuratan hasil pemisahan dengan metode kromatografi bergantung pada beberapa faktor berikut: Pemilihan adsorben sebagai fasa diam Kepolaran pelarut atau pemilihan pelarut yang sesuai sebagai fasa gerak Ukuran kolom (panjang dan diameter) relatif terhadap jumlah material yang akan dipisahkan. Laju elusi atau aliran fasa gerak. Dengan pemilihan kondisi yang sesuai, hampir semua komponen dalam campuran dapat dipisahkan. Dua pemilihan mendasar untuk pemisahan secara kromatografi adalah pemilihan jenis adsorben dan system pelarut. Pada umumnya, senyawa non polar melewati kolom lebih cepat daripada senyawa polar, karena senyawa non polar memiliki afinitas lebih kecil terhadap adsorben. Jika adsorben yang dipilih mengikat semua molekul yang terlarut (baik polar maupun non polar) dengan kuat, maka
senyawa-senyawa tersebut tidak akan bergerak turun keluar dari kolom. Sebaliknya, jika pelarut yang dipilih terlalu polar, semua zat terlarut (polar maupun non polar) akan dengan mudah tercuci keluar kolom, tanpa adanya pemisahan. Adsorben dan pelarut sebaiknya dipilih sedemikian rupa sehingga kompetisi molekul-molekul terlarut di antara kedua fasa terjadi dalam kesetimbangan. Koefisien partisi, k, yang mirip dengan koefisien distribusi untuk ekstraksi, merupakan tetapan kesetimbangan untuk distribusi molekul-molekuk atau ion terlarut di antara fasa gerak dan fasa diam. Kesetimbangan ini lah yang dapat memisahkan komponen-komponen dlam campurannya. Fasa Diam
Silika gel, fasa diam yang paling umum digunakan sebagai fasa diam, memiliki rumus empiris SiO 2. Tetapi, pada permukaan partikel silika gel, terdapat atom-atom oksigen yang terikat pada proton. Adanya gugus hidroksil ini mengakibatkan permukaan silika gel sangat polar, sehingga analit organik yang memiliki gugus fungsi polar akan terikat dengan kuat pada permukaan partikel silika gel dan senyawa yang non polar hanya berinteraksi lemah dengan silika gel. Molekul yang memiliki gugus fungsi polar dapat terikat pada silika gel dalam dua cara: melalui ikatan hidrogen dan melalui interaksi dipol-dipol. Pada gambar 1 diperlihatkan model interaksi analit senyawa oraganik dengan silika gel. Fasa diam lain yang juga biasa digunakan untuk kromatografi kolom dan lapis tipis adalah alumina, yang memiliki rumus empiris Al 2 O 3. Model interaksi senyawa organik dengan alumina dapat dilihat pada gambar 2 berikut.
Fasa Gerak Pada kromatografi yang menggunakan silika gel sebagai fasa diam, fasa gerak yang digunakan adalah suatu pelarut organik atau campuran beberapa pelarut organik. Ketika fasa gerak melalui permukaan silika gel, fasa gerak ini membawa analit organikkmelalui partikel-partikel pada fasa diam. Tetapi, molekul analit hanya bebas bergerak oleh adanya pelarut apabila molekul tersebut tidak terikat pada permukaan silika gel. Kemampuan suatu analit terikat pada permukaan silika gel dengan adanya pelarut tertentu dapat dilihat sebagai penngabungan 2 interaksi yang saling berkompetisi. Pertama, gugus polar dalam pelarut dapat berkompetisi dengan analit untuk terikat pada permukaan silika gel. Dengan demikia, jika pelarut yang sangat polar digunakan, pelarut akan berinteraksi kuat dengan permukaan silika gel dan hanya menyisakan sedikit tempat bagi analit untuk terikat pada silika gel. Akibatnya, analit akan bergerak cepat melewati fasa diam dan keluar dari kolom tanpa pemisahan. Dengan cara yang sama, gugus polar pada pelarut dapat berinteraksi kuat dengan gugus polar dalam analit dan mencegah interaksi analit pada permukaan silika gel. Pengaruh ini juga menyebabkan analit dengan cepat meninggalkan fasa diam. Kepolaran suatu pelarut yang dapat digunakan untuk kromatografi dapat dievaluasi dengan memperhatikan tetapan dielektrik (ε) dan momen dipol (δ) pelarut. Semakin besar kedua tetapan tersebut,
semakin polar pelarut tesebut. Sebagai tambahan, kemampuan berikatan hidrogen pelarut dengan fasa diam harus dipertimbangkan. Semua jenis kromatografi melibatkan proses kesetimbangan molekulmolekul yang dinamis dan cepat diantara 2 fasa (diam dan gerak). Kesetimbangan di antara kedua fasa tersebut bergantung pada 3 faktor: Kepolaran dan ukuran molekul yang akan dipisahkan Kepolaran fasa diam Kepolaran fasa gerak Isolasi Kurkumin dari Kunyit Kunyit merupakan salah satu tumbuhan yang sudah sangat akrab dengan masyarakat Indonesia. Rimpang (Rhizoma) dari tumbuhan ini biasa digunakan sebagai bahan warna kuning dalam industri tekstil tradisional serta digunakan sebagai bumbu masakan, di samping kegunaannya dalam obat tradisional. Nama latin dari kunyit adalah Curcuma longa yang termasuk dalam famili Zingeberaceae (temu-temuan). Komponen aktif dari rimpang kunyit adalah kurkumin (E,E)-1,7-bis(4-hidroksi-3-metoksifenil)- 1,6-heptadien-3,5-on) yang biasanya terdapat 1,5-2% dari berat rimpang kunyit kering. Struktur senyawa ini ditentukan tahun 1910 oleh V. Lampe dan merupakan diarilheptanoid yang pertama ditemukan. Kurkumin juga dapat disintesis di laboratorium. Kurkumin dilaporkan memiliki sifat antikanker dan antitumor. Analog kurkumin telah dilaporkan pula mampu menghambat enzim HIV-1 integrase.
IV. Alat & bahan Alat Alat destilasi Penyaring vakum Gelas ukur Kertas saring Kolom kromatografi Bahan Gelas kimia Neraca analitik Termometer Batang pengaduk Rimpang kering Diklorometana Kapas kunyit Plat kromatografi Silika gel lapis tipis Pipet tetes Pipa kapiler Gelas kimia Eluen Metanol n-heksana air Spektrum UV Kertas saring Kolom kromatografi V. Prosedur
20 g rimpang kunyit dikering dalam 50 ml diklorometana direfluks selama 1 jam. Campuran kemudian segera disaring dengan saringan vakum hingga diperoleh larutan kuning. Dilarutan lalu dipekatkan melalui distilasi pada penangas air 50 o C. Residu kuning kemerahan yang diperoleh kemudian dicampurkan dengan 20 ml n-heksana dan diaduk secara merata. Campuran kemudian disaring lagi dengan penyaring vakum. Padatan yang dihasilkan selanjutnya dianalisis dengan Kromatografi lapis tipis (TLC) menggunakan eluen CH 2 Cl 2 : MeOH = 97:3 yang akan menunjukkan 3 komponen utama. Kromatografi menggunakan kromatografi kolom dibuat menggunakan 15 g silika gel dan eluen CH 2 Cl 2 : MeOH = 99 : 1 dengan tinggi kolom berkisar antara 15-20 cm. 0,3 g diekstrak kasar yang diperoleh dilarutkan dengan sesedikit mungkin pelarut CH 2 Cl 2 : MeOH = 99:1 dan kemudian diteteskan secara perlahan pada bagian atas kolom (jangan merusak permukaan kolom). Dilakukan elusi hingga komponen pertama habis. Monitoring dilakukan dengan menggunakan TLC. Digabungan fraksi yang mengandung komponen pertama ini kemudian dikeringkan. Diuji spektrum UV dan IR dari senyawa murni yang berhasil diisolasi. Proses pemisahan dilakukan pula dengan menggunakan KLT preparatif. Diekstrak kasar (0,1 g) dilarutkan dengan sesedikit mungkin pelarut CH 2 Cl 2 : MeOH = 99 : 1, kemudian ditotolkan pada batas awal pelat KLT preparatif dengan menggunakan pipa kapiler yang diameternya lebih besar dari pada pipa kapiler untuk titik leleh. Setelah noda kering, dilakukan elusi dengan eluen
CH 2 Cl 2 : MeOH = 97 : 3. Hasil elusi dilihat dibawah lampu UV, kemudian pita komponen utamanya diberi tanda dengan ujung tumpul pipa kapiler. Bagian pita yang dipilih kemudian dipisahkan dari komponen lainnya dengan cara mengerok lapisan silika tersebut dan ditampung pada kertas. Dipindahkan silika tersebut ke dalam gelas kimia, dilarutkan dengan diklorometana, kemudian saring dan cuci dengan pelarut yang sama. Filtrat kemudian diuapkan dengan rotary evaporator (atau distilasi biasa dengan penagas air pada suhu 60 o C). Dilakukan uji kemurnian fraksi yang diperoleh dengan KLT (eluen CH 2 Cl 2 : MeOH = 97 : 3). Dibandingkan kemurniannya dengan fraksi hasil pemisahan secara kromatografi kolom! VI. Hasil & pembahasan Hasil pengamatan 20 gram rumpang kunyit + 50 ml diklorometana direfluks 1 jam menghasilkan padatan dan berwarna kuning kemerahan Hasil refluks di saringan dengan vakum menghasilkan kurkumin kuning kemerahan Distilasi pada penangas air pada suhu 50 C menghasilkan kurkumin kuning kemerahan murni + n-heksana menghasilkan kurkumin memadat atau mengkristal. kromatografi kolom, kapas + silikagel + estrak kurkumi + eluen CH2CI2 : MeOH = 99 : 1 menghasilkan kolom terbentuk tiga fraksi senyawa yang ditandai dengan warna yang berbeda. Dan atas ke
bawah berturut-turut adalah warna coklat kemerahan, oranye, dan kuning. kromatografi lapis tipis dengan eluen CH2CI2 : MeOH = 97 : 3 + totolkan ekstrak kurkumin dengan pipa kapiler di atas silica. Menghasilkan nilai Rf 0,9 cm. Pembahasan Kromatografi adalah metode yang digunakan untuk pemisahan komponen dan suatu sampel dimana komponen akan terdistribusi antara dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam mungkin berupa padat atau cair yang terikat pada bahan padat atau gel. Fase padat dapat terkemas dalam kolom, tersebar sebagai suatu lapisan, atau terdistribusi sebagai lapisan film. Fase gerak dapat berupa gas atau cair yang mengalir atau berpindah dalam arah tertentu (Pure and Applied Chem, 37, 447, 1974). Analisis dengan kromatografì dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun analisis kuantitatif. Berdasarkan mekanisme pemisahannya, kromatografi dapat dibedakan menjadi: Kromatografì adsorbsi Kromatografi partisi Kromatografì pasangan ion Kromatografì penukar ion Kromatografì eksklusi ukuran
Selain itu, kromatografi dapat dibedakan berrdasarkan media yang digunakan, yaitu: Kromatografi kertas Kromatografi lapis tipis (KIT) Kromatografì Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Kromatografì Gas Kurkumin adalah komponen utama senyawa kurkuminoid hasil metabolit sekunder yang banyak terdapat pada tanaman jenis kunyit dan temulawak (suku Zingiberaceae). Senyawa kurkuminoid lainnya adalah bis-demetoksi kurkumin dan demetoksi kurkumin. Dalam dunia farmasi, penggunaan kurkumin sebagai senyawa bahan obat telah dilakukan secara luas, diantaranya adalah sebagai antioksidan, antiinflamasi, antiinfeksi, dan antiviral. Pada tingkat penelitian yang lebih lanjut, kurkumin diduga dapat bermanfaat sebagai antitumor, bahkan dapat melakukan penghambatan replikasi human immunodeficiency virus (HIV). Kurkumin dapat ditemukan pada dua bentuk tautomer, yaitu bentuk keto dan bentuk enol. Struktur keto Iebih stabil atau Iebih banyak ditemukan
pada fasa padat, sedangkan struktur enol Iebih dominan pada fasa cair atau larutan. Untuk mengisolasi kurkumin dari kunyit, serbuk kunyit dilarutkan dalam diklorometana. Sebagai pelarut, digunakan diklorometana karena merupakan pelarut non polar karena senyawa yang ada dalam kunyit merupakan senyawa organik yang cenderung bersifat non polar. lnteraksi antar molekul non polar ini akan melarutkan senyawa yang ada dalam kunyit termasuk kurkumin pada pelarutnya. Campuran rumpang kunyit dengan diklorometana selanjutnya direfluks selama satu jam. Proses ini bertujuan untuk mengekstrak kurkumin yang ada pada kunyit. Pada saat refluks suhunya 5 o C, suhu larutan sebaiknya tidak terlalu tinggi karena proses ini berjalan relatif lambat. Jika suhu terlalu tinggi, ekstraksi tidak berjalan dengan sempurna sehingga tidak semua kurkumin pada kunyit dapat diekstrak. Setelah proses refluks selesai, campuran disaring dengan penyaringan vakum dan larutan berwarna kuning hasil penyaringan selanjutnya dipekatkan dengan melalukan distilasi pada penangas air pada suhu 50 C. Distilasi ini bertujuan untuk menguapkan pelarut (diklorometana) sehingga diperoleh kurkumin kuning kemerahan.
Kemudian ditambahkan dengan n-heksana yang bertujuan untuk menjenuhkan campuran sehingga kurkumin memadat atau mengkristal. Setelah didapat ekstrak kurkumin, lakukan kromatografi kolom. Kromatografi adalah cara pemisahan dua atau lebih senyawa atau ion berdasarkan perbedaan migrasi dan distribusi senyawa atau ion-ion tersebut di dalam dua fasa yang berbeda. Fasa diam merupakan fasa yang tidak bergerak, senyawa yang digunakan adalah silica gel. Fasa gerak merupakan fasa yang bergerak melalui fasa diam dan membawa komponen-komponen yang akan dipisahkan, menggunakan suatu pelarut organik atau campuran beberapa pelarut organik. Dalam kromatografi kolom, kolom bagian dasar buret dibalut kapas yang telah diberi aseton untuk menghilangkan gelembung udara. Aseton akan menyerap panas dari buret danterjadi penurunan suhu sehingga gelembung naik ke permukaan. Kemudian kolom disiapkan dengan silika gel sebagai fasa diam dan CH 2 CI 2 : MeOH = 99 : 1 sebagai fasa gerak. Dalam proses kromatografi kolom adsorben silika gel harus terus basah karena, jika dibiarkan kering kolom yang terbentuk dari silika gel bisa retak, sehingga proses pemisahan zat tidak berjalan optimal. Selain itu, juga untuk memudahkan proses elusi (larutan melewati kolom) dalam kolom. Karena digunakan silika gel yang sangat polar, maka komponen yang bersifat lebih polar atau cenderung polar akan berinteraksi dengan kuat, akibatnya akan tertahan lebih lama pada fasa diam. Setelah dilakukan elusi, ada kolom terbentuk tiga fraksi senyawa yang ditandai dengan warna yang berbeda. Dan atas ke bawah
berturut-turut adalah warna coklat kemerahan, oranye, dan kuning. Komponen yang berwarna coklat kemerahan adalah demetoksi kurkumin. Komponen oranye adalah bis-demetoksi kurkumin, dan komponen kuning adalah kurkumin. Ditinjau dari segi kepolaran molekul, urutan dan yang paling polar ke yang kurang polar adalah demetoksi kurkumin, kurkumin, dan bis-demetoksi kurkumin. Akan tetapi, pada kolom kurkumin menempati fraksi yang paling bawah, yang memiliki afinitas dengan silika gel paling kecil. Hal ini terjadi karena adanya ikatan hidrogen antar molekul kurkumin sehingga mengurangi kekuatan untuk berinteraksi dan membentuk ikatan dengan silika gel. Selain menggunakan kromatografi kolom, padatan yang dihasilkan dianalisis juga dengan kromatografi lapis tipis dengan eluen CH 2 CI 2 : MeOH = 97 : 3 yang nonpolar dan fase diamnya merupakan silica yang polar, kurkumin yang memiliki struktur simetris merupakan senyawa nonpolar. Sehingga eluen menarik kurkumin yang di totolkan dengan pipa kapiler di atas silica. Karena eluen yang non polar akan menarik kurkumin yang nonpolar. Maka didapat nilai Rf adalah 0,9 cm. VII. Kesimpulan Kromatografi adalah metode yang digunakan untuk pemisahan komponen dan suatu sampel dimana komponen akan terdistribusi antara dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam mungkin berupa padat atau cair yang terikat pada bahan padat atau gel. Fase padat dapat terkemas dalam kolom, tersebar sebagai suatu lapisan, atau terdistribusi sebagai lapisan
film. Fase gerak dapat berupa gas atau cair yang mengalir atau berpindah dalam arah tertentu. Kurkumin adalah komponen utama senyawa kurkuminoid hasil metabolit sekunder yang banyak terdapat pada tanaman jenis kunyit dan temulawak (suku Zingiberaceae). Senyawa kurkuminoid lainnya adalah bis-demetoksi kurkumin dan demetoksi kurkumin. Kromatografi kolom, padatan yang dihasilkan dianalisis kromatografi lapis tipis dengan eluen CH2CI2 : MeOH = 97 : 3 yang nonpolar dan fase diamnya merupakan silica yang polar, kurkumin yang memiliki struktur simetris merupakan senyawa nonpolar. Sehingga eluen menarik kurkumin yang di totolkan dengan pipa kapiler di atas silica. Karena eluen yang non polar akan menarik kurkumin yang nonpolar. Maka didapat nilai Rf adalah 0,9 cm. VIII. Pustaka