BAB III METODE PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan selama 3 bulan yaitu bulan Desember 2013 sampai Maret 2014. Pengambilan sampel tanah rizosfer Zea mays di Kecamatan Selogiri, Wuryantoro, dan Eromoko Kabupaten Wonogiri, Surakarta. Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret Surakarta. B. Alat dan Bahan 1. Alat a. Alat yang digunakan untuk isolasi bakteri rizosfer antara lain: sekop, timbangan analitik, watch glass, gelas ukur 10 ml, gelas beker 1000 ml, tabung reaksi, mikropipet dan tip P200N, cawan petri, Laminar Air Flow (LAF) Cabinet, dan Autoklaf merek TOMY TM. b. Alat yang digunakan untuk pembuatan inokulum bakteri antara lain: rak tabung reaksi, spektrofotometer UV-Vis, tabung reaksi, mikropipet P20 dan tip, dan alumunium foil. c. Alat yang digunakan untuk seleksi sifat bakteri toleran kekeringan antara lain: timbangan analitik, watch glass, gelas ukur 10 ml, gelas beker 1000 ml, tabung reaksi, mikropipet dan tip P20N, cawan petri, jarum ose, 18
19 Laminar Air Flow (LAF) Cabinet, inkubator shaker, dan spektrofotometer UV-Vis. d. Alat yang digunakan untuk seleksi bakteri potensial penghasil eksopolisakarida antara lain: timbangan analitik, gelas ukur 10 ml, gelas beker 1000 ml, cawan petri, degalsky, kaca objek, mikropipet dan tip P200N, dan Laminar Air Flow (LAF) Cabinet. e. Alat yang digunakan untuk uji karakterisasi bakteri sebagai PGPR 1. Uji produksi IAA antara lain: tabung reaksi, rak tabung reaksi, gelas ukur 100 ml, timbangan analitik, jarum ose, inkubator biasa, inkubator shaker, sentrifugasi, dan spektrofotometer. 2. Uji kelarutan fosfat antara lain: timbangan analitik, gelas ukur 100 ml, gelas beker 1 L, cawan petri, jarum ose, dan inkubator biasa. 2. Bahan a. Bahan yang digunakan untuk isolasi bakteri rizosfer antara lain: : kain, 1,0 gram sampel tanah rizosfer Zea mays, garam fisiologi (0,85%), media Nutrient Agar (NA) dengan komposisi agar NA 23 g/l dan akuades 1000 ml, dan kertas merang. b. Bahan yang digunakan untuk pembuatan inokulum bakteri antara lain: 0,5 ml BaCl 2.2H 2 0 1,175%; 99 ml H 2 S0 4 1%; dan NaCl 0,85 %. c. Bahan yang digunakan untuk seleksi sifat bakteri toleran kekeringan antara lain: media NB (Nutrient Broth) dengan komposisi Nutrient Broth 8 g/l dan akuades 1000 ml; poli etilen glikol (PEG) 6000, dan kertas merang.
20 d. Bahan yang digunakan untuk seleksi bakteri potensial penghasil eksopolisakarida antara lain: media ATCC no.14 dengan komposisi K 2 HPO 4 0,2 g/l; KH 2 PO 4 0,8 g/l; MgSO 4.7H 2 O 0,2 g/l; CaSO 4.2 H 2 O 0,1 g/l; FeCl 2,0 mg/l; Na 2 Mo 4. 2H 2 O (trace); ekstrak khamir 0,5 g/l; sukrosa 20 g/l; bakto agar 15 g/l; dan akuades 1000 ml (Santi et al., 2008), air, kristal violet, dan tinta cina. e. Bahan digunakan untuk uji karakterisasi bakteri sebagai PGPR sebagai berikut : 1. Uji produksi IAA antara lain: 0,2 mm L-triptofan; 10 ml media Nutrient Broth (NB) dan reagen Salkowski dengan komposisi 150 ml H 2 SO 4 pekat; 250 ml akuades; dan 7,5 ml FeCl 3.6H 2 O (Gordon dan Weber, 1951). 2. Uji kelarutan fosfat antara lain: Medium Pikovskaya dengan komposisi dektrosa 10 g; Ca 3 HPO 4 5 g; (NH 4 ) 2 SO 4 0,5 g; KCl 0,2 g; MgSO 4.7H 2 O 0,1 g; ekstrak khamir 0,5 g; MnSO 4.H 2 O 1 mg; dan FeSO 4.7H 2 O 1 mg; serta agar-agar 18 g dalam 1 L akuades (Pikovskaya, 1948). C. Cara Kerja 1. Tahap Isolasi Bakteri Rizosfer a. Pembuatan Media Isolasi Bakteri Rizosfer Media yang digunakan adalah media Nutrient Agar (NA). Media tersebut dihomogenkan dan disterilisasi selama 15 menit dengan suhu 121ºC.
21 b. Isolasi Bakteri Rizosfer Bahan tanah diambil di daerah sekitar perakaran. Sebanyak 1,0 gram tanah rizosfer lahan kering secara aseptik disuspensikan ke dalam 9 ml larutan garam fisiologi (0,85%) lalu dibuat seri pengenceran sampai 10-6. Selanjutnya 100 μl suspensi dari setiap pengenceran dituangkan pada media NA dengan metode spread plate dan diinkubasi pada suhu 38ºC, selama 2 hari. Setelah diinkubasi, koloni bakteri yang tumbuh dipisahkan berdasarkan warna koloni, bentuk, tepian, dan elevasi. Koloni bakteri tersebut ditumbuhkan dengan metode streak plate untuk mendapatkan koloni murni. Koloni murni yang didapatkan, kemudian dipindahkan ke media agar miring NA (Subba-Rao, 1999). 2. Pembuatan Inokulum Bakteri a. Pembuatan Larutan MacFarland 0,5 Sebanyak 0,5 ml BaCl 2.2H 2 0 1,175% ditambah dengan H 2 S0 4 1% hingga volumenya 99,5 ml dan dihomogenkan. Kekeruhan MacFarland 0,5 tersebut diperiksa dengan spektrofotometer hingga menghasilkan absorbansi dalam kisaran 0,08-0,13 pada panjang gelombang 625 nm. Larutan tersebut disegel dan disimpan dalam ruangan gelap pada suhu kamar. Sebelum digunakan, larutan tersebut dihomogenkan dengan menggunakan vortex. Larutan MacFarland akan dijadikan sebagai standar kekekurahan bakteri yang akan diuji aktivitasnya (EUCAST, 2009).
22 b. Pembuatan Inokulum Bakteri uji ditumbuhkan dengan metode streak plate pada media Nutrient Agar dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 38ºC. Selanjutnya bakteri uji tersebut diinokulasi ke dalam 1,5 ml larutan NaCl 0,85 %. Kekeruhan disamakan dengan larutan standar MacFarland 0,5 sehingga dihasilkan bakteri dengan jumlah 1,5 x 10 8 CFU/ml (EUCAST, 2009). 3. Tahap Seleksi Sifat Bakteri Toleran Kekeringan a. Pembuatan Media Pembiakan Bakteri Media yang digunakan adalah media Nutrient Broth (NB). Media tersebut dihomogenkan dan disterilisasi selama 15 menit dengan suhu 121ºC. b. Penyiapan Media dengan Tekanan Osmotik Rendah Media NB yang sudah disterilkan, ketika masih panas ditambah dengan PEG 6000 (Karwati, 2012) untuk menurunkan potensial osmotik mengikuti persamaan menurut Michel dan Kaufmann (1973): Φw = -(1.18 x 10-2 C) - (1.18 x 10-4 ) CT) + ((8.39 x 10-7) x C 2 T) Keterangan : Ψw : potensial osmotik (Mpa) C : konsentrasi T : suhu ( o C) Potensial osmotik yang ditentukan adalah -1,0 MPa; -1,5 MPa; dan -2,0 MPa. Berdasarkan persamaan di atas, banyaknya PEG 6000 yang
23 ditambahkan ke dalam media untuk masing-masing potensial osmotik tertera pada Tabel 1. Tabel 1. Jumlah PEG 6000 yang ditambahkan untuk mendapatkan tekanan osmotik tertentu pada media tumbuh. Tekanan Osmotik PEG 6000 yang ditambahkan (MPa) (g/l) -1,00 295,75-1,50 367,67-2,00 428,89 c. Tahap Seleksi Bakteri Toleran Kekeringan Sebanyak 1 ml suspensi yang ditumbuhkan pada media NB dengan jumlah populasi berkisar 10 8 diinokulasikan ke dalam 20 ml media NB yang sudah ditambahkan dengan poli etilen glikol (PEG) 6000. Selanjutnya diinkubasi pada mesin penggoyang kecepatan 80 rpm pada suhu 38ºC selama 24 jam. Pengukuran Optical Density dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 570 nm. Berdasarkan nilai Optical Density yang termasuk toleransi kekeringan tertera pada Tabel 1 (Alikhani dan Mohamadi, 2010). Tabel 2. Nilai Optical Density (OD) yang termasuk golongan toleran kekeringan. Toleransi Terhadap Kekeringan Optical Density (OD) Sangat Sensitif OD<0,3 Sensitif OD=0,3-0,4 Toleran OD=0,4-0,5 Sangat Toleran OD>0,5 Pada tekanan -1 MPa apabila bakteri dengan nilai OD 0,5 maka termasuk bakteri toleran pada tekanan -1 MPa. Pengujian toleran kekeringan menggunakan commit tiga tekanan to user osmotik yang akan menentukan
24 golongan bakteri. Bakteri yang memiliki nilai OD 0,4 - >0,5 dinyatakan sebagai golongan toleran kekeringan. 4. Tahap Seleksi Bakteri Potensial Penghasil Eksopolisakarida a. Pembuatan Media Seleksi Terhadap Bakteri Penghasil Eksopolisakarida Media yang digunakan adalah media ATCC no.14. Media tersebut dihomogenkan dan disterilisasi dengan suhu 121ºC selama 15 menit. b. Seleksi Bakteri Potensial Penghasil Eksopolisakarida Seleksi bakteri potensial penghasil eksopolisakarida dilakukan melalui produksi eksopolisakarida yang dihasilkan oleh bakteri di dalam medium padat ATCC no. 14 dengan menggunakan sumber karbon sukrosa sebagaimana yang dikemukan oleh Emtiazi et al. (2004). Seleksi dilakukan dengan cara menumbuhkan masing-masing isolat bakteri yang berhasil diisolasi dari rizosfer sebanyak satu ose ke dalam media padat ATCC no. 14 selama tujuh hari pada temperatur 38ºC (Santi et al., 2008). Setelah tahap ini, koloni bakteri yang tumbuh dilakukan pengujian pewarnaan kapsul. Pada kaca objek diberi satu tetes NaCl fisiologis steril 0,85 % dan ditambah satu ose suspensi bakteri. Keduanya dicampurkan dan difiksasi dengan melalukannya di atas api. Kemudian ditambah satu tetes kristal violet dan didiamkan selama dua menit. Preparat dicuci menggunakan air mengalir melalui ujung kaca objek, lalu dikeringkan
25 dengan kertas saring. Selanjutnya diberi satu tetes tinta cina diletakkan di ujung kiri kaca objek. Kaca obyek kedua diletakkan pada ujung kanan kaca objek pertama dengan sudut 45 º, lalu diseret sepanjang kaca obyek pertama. Preparat tersebut ditetesi minyak emersi lalu diperiksa di bawah mikroskop dengan perbesaran 1.000 kali. Kapsul akan tampak sebagai bagian bening di sekitar tubuh bakteri, sedangkan sel bakteri akan berwarna ungu. 5. Tahap Uji Karakterisasi Bakteri sebagai PGPR a. Uji Produksi IAA 1. Kurva Standar IAA Larutan standar IAA dibuat dalam berbagai konsentrasi yaitu 0; 0,1; 0,4; 0,8; dan 1,2 ppm. Selanjutnya diambil 1,5 ml dari setiap larutan standar IAA dan ditambahkan 1 ml reagen Salkowski. Kandungan IAA diukur dengan spektofotometer pada 530 nm. Hasil pembacaan sebagai kurva standar (Brick et al., 1991). 2. Produksi IAA IAA yang diproduksi oleh bakteri rizosfer diukur dengan metode kolorimetri dengan menggunakan reagen Salkowski (Gordon dan Weber, 1951; Patten dan Glick, 2002). Isolat bakteri rizosfer diinokulasi ke dalam 10 ml media Nutrient Broth (NB) yang telah ditambahkan 0,2 mm L-triptofan tanpa penambahan L-triptofan. Kultur diinkubasi dan dikocok (80 rpm) pada suhu ruangan selama 48 jam. Sebanyak 3 ml kultur dari tiap perlakuan dimasukkan ke dalam 2
26 tabung mikro untuk kemudian disentrifugasi (10.000 rpm) selama 15 menit. Sebanyak 2 ml filtrat yang diperoleh dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril dan ditambah 2 ml reagen Salkowski. Suspensi kemudian diinkubasi selama 60 menit dalam ruangan gelap dan pada suhu ruangan. Selanjutnya kadar produksi IAA diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 510 nm. b. Uji Kelarutan Fosfat Uji kelarutan fosfat dilakukan dengan menggunakan metode standar yaitu menggunakan media Pikovskaya (Pikovskaya, 1948). Koloni bakteri uji dispot pada media tersebut, zona bening yang dihasilkan di sekitar koloni setelah diinkubasi selama 1 sampai 7 hari menunjukkan adanya aktivitas bakteri dalam melarutkan fosfat. D. Analisis Data Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif meliputi adanya kapsula yang merupakan eksopolisakarida yang dihasilkan sebagai bakteri toleran terhadap kekeringan dan kemampuan sebagai bakteri PGPR terutama produksi IAA dan kelarutan fosfat.