10 3 METODE PENELITIAN Lokasi Penelitian dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium SEAFAST (South East Asia Food and Agricultural Science and Technology) Center, kampus IPB Darmaga, Bogor, Institut Pertanian Bogor pada bulan Juli sampai November 2012. Bahan Penelitian dan Peralatan Penelitian Bahan Penelitian Isolat yang digunakan dalam penelitian ini adalah 19 isolat lokal Cronobacter spp. koleksi SEAFAST Center IPB (Tabel 4) yang telah terkonfirmasi berdasarkan keberadaan sekuen parsial gen penyandi 16S rrna dengan PCR. Untuk melihat keragaman genetik berdasarkan gen infbnya dipilih 6 isolat lokal (isolat DES b7a, DES b10, DES c13, YR t2a, YR c3a dan 6a) yang telah dilaporkan kinetika termalnya oleh Seftiono (2012). Tabel 4 Daftar isolat Cronobacter spp. yang digunakan Nama Isolat Asal Isolat No. Aksesi DES b7a DES b10 DES c7 DES c13 YR c3a YR t2a 6a FWH b2 FWH b6 FWH b11 FWH b15 FWH c3 FWH d1 FWH d2c FWH d2u FWH d11 FWH d12 FWH d14 FWH d16 Makanan bayi b Makanan bayi b Maizena b Maizena b Susu formula c Susu formula c Formula lanjutan bayi d Tepung beras e Tepung terigu e Tepung beras ketan e Gula halus e Pati singkong e Cabai bubuk e Cabai bubuk e Cabai bubuk e Jintan e Ketumbar bubuk e Pala bubuk e Merica bubuk e - JF800179.1 JF800180.1 JF800181.1 JF800183.1 JF800182.1 AY624069 JX535016.1 JX535017.1 JX535018.1 a Belum terdapat pada GeneBank b Dewanti-Hariyadi et al. (2010); c Meutia (2008); d Estuningsih et al. (2006); e Hamdani (2012)
Bahan-bahan utama yang digunakan antara lain BHI broth (Oxoid Ltd., UK), TSA (Oxoid Ltd., UK), akuabides, phenol red broth, dulsitol dan perangkat cepat Rapid One untuk konfirmasi biokimia (Remel,USA). Bahan yang digunakan untuk isolasi DNA antara lain media pertumbuhan LB Broth (Miller Caisson Lab., USA), bahan-bahan ekstraksi antara lain Tris (Amersham Bioscience, Swedan), EDTA disodium salt (Amersham Bioscience, Swedan), 10% (w/v) Sodium dodecyl sulphate (SDS) (Promega Corporation, USA), 10 mg/ml proteinase K (Fermentas, US), Cethyiltrimethyl ammonium bromide (CTAB) (Merck, Darmstadt, Germany), NaCl, Phenol, Chloroform, Isoamyl alcohol (Applichem), sodium asetat (Merck, Darmstadt, Germany), isopropanol (Merck, Darmstadt, Germany), etanol 70%, dan HCl untuk pengaturan ph bufer. Bahan untuk campuran PCR yaitu akuabides steril, primer forward dan reverse (primer infb-f 5 -GCG TAA TAA ACT GTA GCA GGA A-3 dan primer infb-r 5 -CGT TCT CTT CAG CCA TAC GAC-3 ), DNA templet dari hasil ekstraksi DNA genom serta DreamTaq DNA polymerase (2 DreamTaq Green buffer, 0.4 mm dntp, 4 mm MgCl 2 ). Bahan yang digunakan untuk elektroforesis adalah medium agarosa (Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Germany), bufer Tris-asetat-EDTA (TAE bufer), 0.5 µg/ml etidium bromida (Amersham Biosciences, Sweden), 6 loading dye dan penanda 1 kb DNA ladder (0.5 µg/µl #SM0311). Peralatan Penelitian Tabung reaksi bertutup beserta dudukannya, jarum ose, inkubator, pipet mikro beserta tip, vortex, eppendorf beserta kedudukannya, sentrifugasi dengan kekuatan 18 000 rpm, water bath shaker, freezer, laminar air flow (ESCO ), perangkat PCR Applied Biosystem 2720 Thermal Cycler (Foster City, California), timbangan analitik, erlenmeyer, gelas ukur, pipet volumetrik, labu takar, botol Schott Duran, pengaduk magnet, hotplate stirrer, perangkat elektroforesis (Bio- Rad), ph meter, plastik steril, bunsen, kertas parafilm, Geldoc XR (Bio-Rad), autoklaf, termometer, perangkat dokumentasi, dan Spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu). Perangkat Lunak (Software) Beberapa software yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Eric (Remel) untuk konfirmasi hasil uji biokimia RapID one, program ChromasPro untuk proses trimming dan contig sekuen DNA, program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) dari situs NCBI (www.ncbi.nih.nlm.gov) untuk menganalisis hasil perunutan, serta program MEGA4 (www.megasoftware.net) untuk membentuk pohon filogeni. 11 Prosedur Penelitian Pelaksanaan penelitian ini terdiri atas dua tahap, yaitu tahapan biotyping dan keragaman genetik (Gambar 1). Pada tahapan biotyping dilakukan untuk mengidentifikasi dan klasifikasi isolat lokal berdasarkan sifat biokimianya, adapun pengamatan ini dilakukan menggunakan perangkat cepat RapID one dan 4 reaksi biokimia Iversen. Tahapan keragaman genetik dilakukan melalui analisa keragaman gen infb dengan cara melakukan amplifikasi dan perunutan gen
12 tersebut. Untuk melihat hubungan kekerabatan isolat lokal maka dilakukan dengan analisa pohon filogeni. Tahapan amplifikasi gen diawali dengan tahapan isolasi DNA genom. Pada gambar 2 disajikan skema penelitian tahap biotyping, adapun tahap keragaman genetik dapat dilihat pada Gambar 3. Gambar 1 Diagram Alir Penelitian Gambar 2 Diagram Alir Penelitian Tahapan Biotyping
Gambar 3 Diagram Alir Penelitian Tahapan Keragaman Genetik 13
14 Klasifikasi Isolat Lokal dengan Biotyping Persiapan Isolat Bakteri Bakteri uji yang digunakan pada penelitian ini yaitu sebanyak 19 isolat lokal Cronobacter spp. koleksi SEAFAST Center. Semua isolat berasal dari susu formula bayi, makanan bayi, tepung-tepungan dan tanaman rempah. Pembagian isolat yang digunakan dapat terlihat pada Tabel 4. Isolat-isolat tersebut telah dikonfirmasi sebagai Cronobacter spp. menggunakan PCR terhadap gen parsial 16S rrna (Gitapratiwi et al. 2012; Hamdani 2012). Selanjutnya isolat lokal pada media DFI agar dan CES agar diambil 1 atau 2 loop kemudian disegarkan pada media BHI broth, diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Satu ose isolat dari BHI broth dikultur pada media agar miring yang berisi TSA. Setelah diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam, kultur dapat digunakan sebagai kultur kerja. Identifikasi dan Klasifikasi Isolat Lokal Cronobacter spp. dengan RapID one Biotyping menggunakan RapID one merupakan perangkat cepat yang berguna untuk mengidentifikasi sifat biokimia bakteri Enterobacteriaceae. Perangkat ini berupa strip yang terdiri atas 18 sumur berisi kompartemen uji yang telah dikeringkan. Satu sumur pada RapID one mewakili satu pengamatan uji biokimia. Pada prinsipnya, perangkat cepat RapID one bekerja berdasarkan perubahan warna pada masing-masing sumur yang mengindikasikan reaksi positif atau negatif suatu sampel. Indikator warna untuk 19 uji biokimia dapat dilihat pada form laporan kerja RapID one (Lampiran 2). Masing-masing isolat dari agar miring diambil 1 hingga 2 loop untuk disuspensikan dengan larutan Remel. Kemudian larutan dituang ke dalam ujung strip dan diratakan. Setelah diinkubasi pada suhu 37 C selama 4 jam maka dapat diamati reaksi-reaksi warna pada masing-masing sumur. Untuk mengamati reaksi indol, maka ditetesi larutan indol pada sumur yang bertuliskan ADON. Pembacaan reaksi indol setelah 2 menit ditetesi larutan indol. Hasil pembacaan RapID one kemudian diinterpretasikan dengan menggunakan perangkat lunak Eric (Remel). Perangkat lunak akan bekerja dengan menghasilkan kombinasi angka, sehingga diperoleh hasil identifikasi spesies berdasarkan database perangkat tersebut serta persentase kemiripannya. Gambar 4 disajikan penampilan analisa salah satu isolat lokal Cronobacter spp. dengan perangkat lunak Eric (Remel). Hasil identifikasi RapID one dibandingkan dengan hasil API 20E yang telah diperoleh pada penelitian Gitapratiwi (2011) dan Hamdani (2012). Selain dianalisis menggunakan perangkat lunak Eric (Remel), 19 uji biokimia pada perangkat RapID one diamati secara manual untuk melihat pola spesifik hasil pengujian yang dihasilkan oleh masing-masing isolat uji. Uji biokimia yang menghasilkan reaksi positif saja atau reaksi negatif saja untuk semua isolat uji, tidak digunakan sebagai parameter klasifikasi. Sepuluh uji terpilih meliputi lisin (ODC), fatty acid ester (LIP), sorbitol (SBL), p- nitrophienyl-β-d-glukoside (βglu), p-nitrophienyl-β-d-xyloside, p-nitrophienyln-acetyl-β-d-glucoamide (NAG), malonat (MAL), pyrohidonyl-β-naphtylamide (PYR), adonitol (ADON) dan indol (IND) digunakan sebagai faktor pembeda dalam klasifikasi isolat-isolat lokal menjadi beberapa tipe. Isolat-isolat yang
memiliki karakteristik biokimia yang sama akan diklasifikasikan ke dalam satu biotipe. 15 Kombinasi angka Hasil pengamatan sifat biokimia isolat Hasil identifikasi dan persentase kemiripan Gambar 4 Penampilan Kerja Perangkat Lunak Eric (Remel) Klasifikasi Isolat Lokal Cronobacter spp. dengan 4 Reaksi Biokimia Iversen Dalam melakukan klasifikasi menggunakan 4 reaksi biokimia Iversen, dilakukan pengujian terhadap produksi asam dari dulsitol, methyl-α-d-glukosidase, produksi indol dan pemanfaatan malonat. Modifikasi metoda Iversen et al. (2007b) pada penelitian ini yakni tiga reaksi diantaranya diperoleh dari hasil uji pada RapID one yaitu malonat, indol dan p-nitrophienyl-β-d-glukoside. Pengujian terhadap produksi asam dari dulsitol dilakukan berdasarkan metoda Iversen et al. (2007b) yaitu phenol red broth dilarutkan dengan larutan steril dulsitol. Konsentrasi dulsitol yang digunakan pada medium adalah 0.5% (m/v). Kemudian media diinokulasi pada tabung reaksi dan diamati perubahan warna dari merah menjadi kuning untuk hasil positif setelah diinkubasi 24 jam pada suhu 37 C. Selanjutnya isolat-isolat lokal akan dikelompokkan ke dalam C. sakazakii, C. malonaticus, C. muytjensii, C. dublinensis dan C. turicensis. Klasifikasi ini dilakukan berdasarkan pengamatan reaksi positif atau negatif dari keempat uji biokimia Iversen yang disesuaikan dengan pola Iversen et al. (2007b) seperti pada Tabel 3.
16 Keragaman Genetik Persiapan Bahan Pereaksi Ekstraksi DNA Pembuatan larutan untuk isolasi DNA dan bufer yang dibutuhkan yaitu 0.5 M EDTA ph 8 (garam disodium EDTA.2H 2 O dilarutkan di dalam akuabides dan ditepatkan hingga ph 8 dengan NaOH. Kemudian larutan ditambahkan akuabides hingga tepat 50 ml dan larutan disterilisasi dengan autoclave). Larutan 1 M Tris dibuat dengan cara melarutkan garam tris dengan akuabides dan diatur ph 8 dengan HCl. Selanjutnya ditambahkan akuabides hingga 50 ml dan disterilisasi dengan akuabides. Untuk membuat larutan TE ph 8, maka 1 ml EDTA 0.5 M ditambahkan dengan 5 ml Tris 1 M lalu ditambahkan akuabides hingga 500 ml. larutan disterilisasi dengan autoclave. Bufer CTAB yang digunakan yaitu 10% CTAB dalam 0.7 M NaCl. Sebanyak 4.1 gram garam NaCl ditimbang dan dilarutkan dalam 80 ml akuabides. Kemudian ditambahkan secara perlahan 10 gram CTAB. Larutan dipanaskan sambil distirrer. Pemanasan dilakukan suhu 65 C. Selanjutnya ditepatkan hingga 100 ml. Larutan PCI dibuat dengan perbandingan phenol : chloroform : isoamyl alcohol = 25 : 24 : 1, sedangkan CIA dengan perbandingan chloroform : isoamyl alcohol = 24 : 1. Untuk larutan 3 M sodium asetat dibuat dengan melarutkan 408.1 gram sodium asetat 3H 2 O dalam 800 ml akuabides. Pengaturan ph disesuaikan menjadi 5.2 dengan menambahkan asetat glasial. Selanjutnya ditambahkan akuabides hingga volume 1 liter dan disterilisasi dengan autoclave. Larutan-larutan lain yang diperlukan yaitu SDS 10% (w/v), proteinase K 10 mg/ml, isopropanol dan etanol 70%. Bufer 50 TAE dan EtBr diperlukan untuk visualisasi DNA pada gel agarosa. Bufer TAE dibuat dengan 242 gram tris dilarutkan ke dalam 700 ml akuabides, kemudian ditambahkan 57.1 ml asam asetat dan 100 ml EDTA 0.5 M ph 8. Larutan tersebut ditepatkan hingga 1 liter dan disterilisasi dengan autoclave. Ekstraksi DNA DNA genom diekstrak dari 19 isolat lokal Cronobacter spp. yang telah diinkubasi pada media LB dengan inkubasi shaker pada suhu 37 C kecepatan 150 rpm selama 24 jam. Metode ekstraksi fenol-kloroform yang dilakukan berdasarkan Brown (1992) yaitu isolat yang telah ditumbuhkan kemudian disentrifugasi pada 18 000 rpm selama 3 menit. Pelet diresuspensi dalam 200 μl bufer TE dengan vorteks, ditambahkan 50 μl SDS 10% dan dicampur sampai suspensi terlihat jernih. Sepuluh μl proteinase-k (10 mg/ml) ditambahkan dan diinkubasi pada 37 C selama 1 jam. Setelah itu ditambahkan 80 μl CTAB/NaCl dan diinkubasi pada 65 C selama 20 menit. Ke dalam campuran ditambahkan campuran P:C:I (25:24:1) dengan rasio 1:1 dan divorteks selama 2 menit. Campuran disentrifugasi pada 13 500 rpm selama 10 menit dan fase cairan (top layer) dipindahkan ke tube baru, ditambahkan dengan campuran C:I (24:1) dengan volume yang sama. Campuran disentrifugasi pada 13 500 rpm selama 10 menit hingga fase terpisah dan top layer dipindahkan ke tube baru. Selanjutnya ditambahkan 0,1 volume NaO asetat 3M (ph 5.2) dan isopropanol dengan dua kali volume larutan. Tabung diinkubasi pada -20 C selama 1 jam dan presipitasi DNA dilakukan dengan sentrifugasi pada 13 500 rpm selama 10 menit. Presipitat
DNA ditambah dengan 500 μl etanol 70% dan disentrifugasi pada 13 500 rpm selama 10 menit. Pelet DNA dikeringkan dan diresuspensi dalam 100μl TE. Amplifikasi DNA Amplifikasi DNA hasil ekstraksi dilakukan secara in vitro dengan teknik PCR menggunakan mesin thermocycler (Foster City, California). Segmen DNA yang diamplifikasi adalah gen infb E. sakazakii. DNA target diamplifikasi dengan menggunakan 2 pasang primer spesifik infb-f 5 -GCG TAA TAA ACT GTA GCA GGA A-3 dan primer infb-r 5 -CGT TCT CTT CAG CCA TAC GAC-3. Primer dipilih berdasarkan Asakura et al. (2007) yang mengamplifikasi gen infb pada isolat E. sakazakii. Total pereaksi yang digunakan adalah sebanyak 25 µl, terdiri atas 9 µl air bebas ion, 9 µl 2 DreamTaq Green DNA polymerase (0.4 mm dntp, 4 mm MgCl 2 ), 0.8 µl primer forward 10 µm, 0.8 µl primer reverse 10 µm dan 5.4 µl DNA hasil ekstraksi. Proses amplifikasi dilakukan pada kondisi suhu pra-denaturasi 94 C selama 4 menit, dilanjutkan 30 siklus yang terdiri atas tahap denaturasi DNA 94 C selama 50 detik, penempelan primer (annealing) pada suhu 61 C selama 1 menit dan sintesis DNA target (elongasi) pada suhu 72 C selama 50 detik. Proses diakhiri dengan sintesis DNA akhir (post-pcr) pada suhu 72 C selama 4 menit. Elektroforesis dan Pewarnaan DNA Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan gel agarosa 1%. Agarosa bubuk LE-500 ditimbang dengan timbangan analitik sebanyak 0.4 g. Dilarutkan dengan menambahkan larutan bufer TAE 1 sebanyak 40 ml. Larutan tersebut dipanaskan dengan hotplate stirrer hingga jernih (kira-kira 10 menit). Ditunggu agak dingin dan larutan siap dituang ke gel tray dan dipasang sisir untuk membuat sumur-sumur pada agar dan ditunggu hingga beku. Gel agarosa yang telah beku dipindahkan ke dalam electrophoresis chamber dengan sebelumnya melepaskan sisir pembuat sumur. Sebanyak 9 µl DNA dicampur dengan 1 µl loading dye dengan cara meneteskan pada kertas parafin. Campuran DNA dan loading dye diambil dan dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel agarosa dengan perlahan. Diikuti dengan penenda 1 kb pada masing-masing sumur berbeda. Kemudian alat elektroforesis dijalankan dengan tegangan 110 volt selama 30 menit. DNA merupakan molekul bermuatan negatif sehingga bila diletakkan di medan listrik maka DNA akan bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan pergerakan DNA tergantung pada ukuran molekul DNA, kerapatan gel, dan arus listrik yang diberikan untuk memigrasikan molekul DNA. Pewarna (loading dye) ditambahkan untuk memudahkan peletakan sampel DNA ke dalam sumur. Loading dye juga berfungsi agar DNA dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA. Gel diwarnai dengan etidium bromida selama 30 menit. Selanjutnya direndam dengan aquades selama 5 menit dan dilihat gambarannya dibawah alat pengamat DNA (lampu UV). Gel tersebut difoto dengan menggunakan BioDoc Analize. 17
18 Hasil Elektroforesis Hasil elektroforesis bersifat kualitatif dalam bentuk pita-pita pada permukaan agarosa. Ukuran produk DNA diperoleh dengan membandingkan fragmen DNA masing-masing sampel dengan penenda DNA ladder (Gambar 5). Gambar 5 Marker DNA Ladder 1 kb Perunutan (Sekuensing) Fragmen Gen infb Produk hasil PCR dimurnikan sebelum proses sekuensing. Pemurnian produk PCR perlu dilakukan untuk mengurangi pengotor-pengotor berupa Mg 2+, DNA template dan dntp yang berlebih yang dapat mengganggu proses perunutan basa nukleotida sehingga dapat menimbulkan kesalahan dalam pembacaan hasil sekuensing. Proses pemurnian dan sekuensing fragmen Gen infb dilakukan menggunakan jasa sekuensing di 1st Base Pte Ltd, Malaysia. Alignment Gen infb Isolat Lokal Cronobacter spp. Produk hasil sekuensing dilanjutkan pada tahapan trimming dan contig menggunakan program ChromasPro. Proses trimming dilakukan untuk membetulkan hasil sekuen yang kurang tepat dan menghilangkan yang tidak dibutuhkan. Basa yang tidak sesuai dengan kromatogramnya akan ditandai dengan blok hitam secara otomatis. Proses contig dilakukan untuk menggabungkan dua sekuen hasil forward dan reverse. Hasil sekuen contig yang diperoleh akan dilinkkan ke program BLAST dari NCBI (the National Center of Biotechnology Information) pada situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Hasil BLAST merupakan identitas dari gen yang diamplifikasi berdasarkan tingkat kemiripannya dengan database yang tersedia. Program BLAST nukleotida juga digunakan untuk melihat tingkat kemiripan antar isolat lokal Cronobacter spp. ataupun tingkat kemiripan dengan isolat lain dalam Cronobacter. Sekuen contig gen infb sampel disepadankan dengan beberapa genom komplit Cronobacter spp. yang ada di data Gen Bank.