LAMPIRAN Lampiran 1. Alur Kerja Isolasi Bakteri Endofit dari Batang dan Akar Tanaman Dara metode Radu & Kqueen (2002) yang dimodifikasi Bagian akar dan batang (3-5 cm) Dicuci dengan air mengalir selama 20 menit Disterilkan bagian permukaannya dengan cara dalam larutan etanol 75% selama 2 menit direndam Direndam dalam larutan natrium hipoklorit 5,3% selama 5 menit Direndam dalam larutan etanol 75% selama 30 detik menit dibilas dengan akuades steril sebanyak 2 kali dikeringkan dengan kertas saring steril dibuang bagian ujung kiri dan kanan dari akar dan batang tanaman lebih kurang 1 cm dipotong manjadi 2 bagian diletakkan pada permukaan media NA yang telah dicampurkan dengan antibiotik ketokonazol (0,3 gram/100 ml) dengan posisi bekas potongan ke arah media diinkubasi pada suhu ruang 25-30 o C selama 1-3 hari Koloni Bakteri Endofit Disubkultur pada media NA baru sampai diperoleh biakan murni
43 Lampiran 2. Alur Kerja Karakterisasi dan Identifikasi Bakteri Endofit Isolat murni bakteri endofit Dikarakterisasi berdasarkan struktur dan warna koloni Pewarnaan Gram Uji Biokimia Diamati dengan mikroskop Uji sitrat Uji gelatin Uji motilitas Uji sulfida Uji katalase Uji hidrolisis pati
44 Lampiran 3. Alur Kerja Uji Daya Hambat Bakteri Endofit terhadap Bakteri Patogen Isolat Bakteri Patogen Isolat Bakteri Endofit Disubkultur pada suhu 28-30 o C selama ± 24 jam Diambil dengan jarum ose Dilarutkan dalam larutan fisiologis NaCl 0,9% Dihomogenkan dan disesuaikan kekeruhan/absorbansinya dengan standar 0,5 McFarland menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm Suspensi Bakteri Patogen Dibuat hapusan dengan menggunakan cutton bud pada permukaan media MHA Suspensi Bakteri Endofit Diteteskan pada kertas cakram kosong sebanyak 10 µl dengan menggunakan mikropipet Diletakkan cakram yang sudah ditetesi suspensi bakteri endofit pada media MHA Diinkubasi pada suhu 28-30 o C selama 24 jam Diukur luas zona hambat yang terbentuk dan diamati sampai hari ketiga
45 Lampiran 4. Alur Kerja Uji Daya Hambat Bakteri Endofit terhadap Jamur Patogen Jamur Patogen Diinokulasikan bagian yang aktif tumbuh di tengah media MHA dengan menggunakan cork borer Diinkubasi selama 2-3 hari Bakteri Endofit Dibuat suspensi dengan absorbansi/kekeruhan 0,5 standar McFarland yang diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm Diinokulasikan pada kertas cakram kosong berdiameter 0,6 cm sebanyak 10 µl di bagian tepi media Diinkubasi pada suhu 28-30 o C selama 24 jam Diukur zona hambat yang terbentuk Diamati sampai hari keenam
46 Lampiran 5. Alur Kerja Ekstraksi Bahan Antimikroba dari Bakteri Endofit dengan Pelarut Metanol Isolat Bakteri Endofit Potensial Antimikroba Dibuat suspensi dengan absorbansi/kekeruhan 0,5 standar McFarland yang diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm Disebarkan dengan cotton bud pada permukaan media padat NA sebanyak 5 petri Diinkubasi selama 5-6 hari Kultur Bakteri Dipotong kecil-kecil Dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer 500 ml yang ditutupi aluminuim foil Direndam dalam pelarut metanol 150 ml selama 72 jam Dimaserasi Disaring dengan kertas saring steril Dilakukan perendaman sebanyak 3 kali Maserat Supernatan Disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 15 menit Dipekatkan dengan menggunakan evaporator putar dengan suhu tidak lebih dari 50 ± 2ºC Ekstrak Bakteri
47 Lampiran 6. Alur Kerja Uji Aktivitas Ekstrak Metanol Bakteri Endofit terhadap Beberapa Bakteri Patogen Bakteri Patogen Suspensi Bakteri Patogen Disubkultur selama ± 24 jam pada media NA Diambil dengan jarum ose Dilarutkan dalam larutan fisiologis NaCl 0,9% Disesuaikan absorbansi/kekeruhannya dengan standar 0,5 McFarland yang diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm Ekstrak Metabolit Bakteri Endofit Dilarutkan dengan DMSO dengan konsentrasi masing-masing 40, 60, 80 dan 100% Diteteskan pada kertas cakram kosong sebanyak 10 μg Ditetesi kertas cakram kosong dengan DMSO sebanyak 10 μg sebagai kontrol (-) Digunakan cakram kertas kloramfenikol 10 μg pada bakteri dan untuk jamur digunakan cakram kertas nystatin sebagai kontrol (+) Dibuat hapusan dengan menggunakan cutton bud pada permukaan media MHA Diletakkan cakram kertas yang sudah ditetesi ekstrak metabolit bakteri endofit dan kertas cakram untuk kontrol (-) dan (+) Diinkubasi pada temperatur 28-30 o C selama 24 jam Diukur luas zona hambat yang terbentuk dengan menggunakan jangka sorong dan diamati sampai hari ketiga
48 Lampiran 7. Alur Kerja Uji Aktivitas Ekstrak Metanol Bakteri Endofit terhadap Jamur Patogen Jamur Patogen (A. flavus) Jamur Patogen (A. flavus) usia 2-3 hari Diinokulasikan bagian yang aktif tumbuh di tengah media MHA dengan menggunakan cork borer Diinkubasi selama 2-3 hari Diletakkan kertas cakram syang sudah ditetesi ekstrak metabolit bakteri endofit potensial dan kertas cakram untuk kontrol (-) dan (+) di keempat sisi empat sisinya Ekstrak Metabolit Bakteri Endofit dilarutkan dengan DMSO dengan konsentrasi masing-masing 40, 60, 80 dan 100% Diteteskan pada kertas cakram kosong sebanyak 10 μg Ditetesi kertas cakram kosong dengan DMSO sebanyak 10 μg sebagai kontrol (-) Digunakan kertas cakram kloramfenikol 10 μg pada bakteri dan untuk jamur digunakan kertas cakram nystatin sebagai kontrol (+) Diinkubasi pada suhu 28-30 o C selama 24 jam Diukur zona hambat yang terbentuk Diamati sampai hari keenam
49 Lampiran 8. Alur Kerja Pengamatan Hifa Abnormal Jamur Patogen (A. flavus) Diamati secara visual luas permukaan miselium jamur yang terhambat Diamati secara mikroskopis ujung miselium pada daerah zona yang terhambat Dipotong bagian ujung miselium dengan bentuk block square Diletakkan di atas kaca objek Diamati di atas mikroskop adanya abnormalitas pada pertumbuhan hifa jamur
50 Lampiran 9. Dokumentasi Penelitian a. Pengamatan Pewarnaan Gram b. Biakan Murni Isolat Bakteri Endofit c. Maserat Bakteri Endofit d. Pengamatan Block Square
51 e. Foto Kerja f. Foto Uji Biokimia