10 tersebut memanfaatkan hidrokarbon sebagai sumber karbon dan energi (Muslimin 1995; Suprihadi 1999). Selain itu keaktifan mikrob pendegradasi hidrokarbon juga dipengaruhi oleh kondisi lingkungan seperti temperatur dan ph. Kondisi lingkungan yang tidak sesuai menyebabkan mikrob ini tidak aktif bekerja mendegradasi minyak bumi. Sebagai contoh, penambahan nutrien anorganik seperti fosfor dan nitrogen untuk area tumpahan minyak meningkatkan kecepatan bioremediasi secara signifikan (Balba et al. 1998). Jadi menggubahkan mikrob sebagai pendegradasi tanah kontaminan oleh minyak merupakan tindakan yang tepat karena bersahabat terhadap lingkungan sekitarnya. 3 METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan mulai bulan Januari sampai dengan September 2012 di Laboratorium Bioteknologi Tanah, Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan, Institut Pertanian Bogor serta Laboratorium Bioteknologi Lingkungan, Indonesian Center for Biodiversity and Biotechnology (ICBB), Bogor. Bahan dan Alat Penelitian Bahan Bahan yang digunakan adalah sludge minyak berat (API 21,93), minyak ringan (API 40-45) dan oli bekas (API 34,9) serta 15 isolat bakteri koleksi ICBB- CC (Indonesian Center for Biodiversity and Biotechnology-Culture Collection of Microorganisms) yang telah teruji berpotensi mendegradasi hidrokarbon. Bahan lain yang digunakan meliputi larutan fisiologis steril, DCM : n-heksan (1:1), Na 2 SO 4, pupuk urea, pupuk SP-36, contoh tanah, KOH, HCl, phenolphtaleine, metil oranye, aquadest dan alkohol 70%, media NA (Nutrient Agar) dan media LB (Luria-Bertani) untuk pertumbuhan mikrobserta Media Minimal Cair yang mengandung bahan-bahan pemasok kebutuhan hidup bakteri dalam jumlah minimal (10gNaCl, 1g NH 4 NO 3, 0,5g MgSO 4, 0,7g K 2 HPO 4, 0,3g KH 2 PO 4, 0,1ml FeCl 3, 5-10% minyak berat dan 20g Agar) untuk seleksi isolat. Penambahan minyak berat bertujuan untuk memperoleh bakteri yang benar-benar mampu beradaptasi dengan lingkungan yang bercampur dengan oil sludge. Alat Alat yang digunakan adalah neraca analitik, autoklaf, laminar air flow, oven, incubator, cawan porselin, tabung reaksi, bunsen, cawan petri, gelas beker, erlenmeyer, jarum ose, pipet tetes, ph meter, toples kedap udara dan botol film.
11 Metode Penelitian Peremajaan, Seleksi dan Karakterisasi Peremajaan dan Seleksi Peremajaan bakteri dilakukan dengan tujuan agar bakteri awal yang merupakan biakan induk yang masih dalam keadaan dorman menjadi biakan segar sehingga ketika digunakan, bakteri dalam keadaan yang segar. Terdapat sebanyak 15 biakan bakteri ICBB yang telah teruji mampu mendegradasi hidrokarbon. Media tumbuh untuk peremajaan isolat yaitu media LB (Luria-Bertani). Biakan murni dari 15 isolat kemudian diseleksi kemampuannya dalam mendegradasi minyak berat. Masing-masing isolat yang ada di biakan induk dibiarkan dahulu beberapa menit, setelah itu satu persatu biakan dipindahkan ke dalam 20 ml media LB dalam tabung erlenmeyer dengan menggunakan jarum ose (Gambar 1). Biakan diinkubasi di atas shaker selama 24 jam pada suhu ruang. Gambar 1 Peremajaan Bakteri Bakteri yang telah diremajakan kemudian diseleksi yang bertujuan untuk memperoleh tiga bakteri terbaik dari ke-15 bakteri yang mampu mendegradasi hidrokarbon. Media yang digunakan pada proses seleksi ini adalah Media Minimal Cair yang mengandung minyak mentah (crude oil). Media Minimal Cair merupakan media yang mengandung bahan-bahan pemasok kebutuhan hidup bakteri dalam jumlah yang minimal. Penambahan minyak mentah bertujuan supaya diperoleh bakteri yang benar-benar mampu beradaptasi dengan lingkungan yang bercampur dengan minyak bumi. Karakterisasi Bakteri terbaik yang telah mampu mengurai komposisi minyak bumi dimurnikan kemudian dilakukan pengamatan dan pengujian untuk mengetahui
12 karakter bakteri tersebut untuk mendegradasi hidrokarbon. Pengujian yang dilakukan: a. Pengamatan morfologi bakteri Pengamatan morfologi bakteri dilakukan dengan mengamati koloni bakteri yang meliputi warna, bentuk koloni, elevasi (kenampakan dari samping), bentuk pinggiran dan tekstur permukaan (Hadioetomo 1993). b. Pengujian Hipersentive Response Pengujian menurut Schaad et al. (2001) yang dimodifikasi dilakukan untuk menguji patogenitas bakteri pada tanaman. Bakteri dengan kerapatan 10 9 CFU/ml dalam media cair disuntikkan ke daun tanaman tembakau (Nicotiana tabacum L.) berumur 2 bulan menggunakan syringe 1 ml (tanpa jarum) dan diamati selama 1 minggu. Pengujian menggunakan kontrol negatif berupa air steril dan kontrol positif bakteri pathogen tanaman. Tujuan pengujian ini adalah untuk menguji bakteri yang berpotensi sebagai patogen pada tanaman, dalam hal ini pengujian menggunakan tembakau (Schaad et al. 2001). Pada Gambar 2 adalah tahapan dari pengujian hipersentive response, bakteri yang sudah terseleksi diremajakan kembali hingga kerapatan 10 9 CFU/ml, lalu disuntikkan ke daun tanaman tembakau (Nicotiana tabacum L.) berumur 2 bulan menggunakan syringe 1 ml (tanpa jarum) dan diamati selama 1 minggu. Gambar 2 Proses tahapan pengujian Hipersentive Response. Ket: a : Meremajakan isolat selama 24 jam, b : mempersiapkan bahan dan alat: isolat, tembakau, syringe 1 ml dan masker), c: isolat dimasukan ke dalam syringe1ml, d: memasukkan isolat ke dalam jaringan daun tembakau
13 c. Pengujian Haemolysis Pengujian ini untuk menguji patogenitas bakteri pada manusia dan hewan. Bakteri ditumbuhkan pada media Blood Agar (Difco) yang telah dicampur darah domba 5%. Pengujian menggunakan kontrol positif bakteri pathogen pada manusia atau hewan, kemudian diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu ruang. Adanya zona bening sekeliling koloni menunjukkan bakteri yang diuji termasuk pathogen (Difco 2009). d. Pengujian Antagonis Bakteri-bakteri yang digunakan untuk uji antagonis adalah bakteri yang mampu mendegradasi hidrokarbon. Satu koloni bakteri yang tumbuh terpisah di cawan petri, diambil menggunakan jarum ose dan digoreskan pada media NA yang telah disiapkan. Pengujian antagonis empat isolat bakteri tersebut dilakukan pada media agar (Gambar 3 dan 4).Pengamatan dilakukan setiap hari terhadap koloni bakteri dengan cara melihat pertumbuhan empat bakteri bersama-sama. Bakteri 1 Bakteri 2 Cawan petri Gambar 3 Metode uji antagonis 2 isolat bakteri Bakteri 3 Bakteri1 2 Bakteri 2 Cawan petri Gambar 4 Metode uji antagonis 3 isolat bakteri
14 Penentuan Kurva Pertumbuhan dan Kurva Standard Penentuan Kurva Pertumbuhan Bakteri Kurva pertumbuhan isolat pada media LB ditentukan dengan mengukur kerapatan optik (620 nm) pada waktu tertentu. Bacillus sp.icbb 7859, Bacillus sp. ICBB 9461 dan Bacillus sp. ICBB 5071 masing-masing diambil 1 ose kemudian dimasukkan ke dalam 100 ml media LB dan dilakukan pengocokan. Kerapatan optik diukur pada jam ke: 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 48. Hasil pengukutan dibuat kurva dengan sumbu x adalah waktu inkubasi dan sumbu y adalah nilai kerapatan optik. Penentuan Kurva Standar Populasi Bakteri Kurva standar populasi menggambarkan hubungan antara nilai kerapatan optik suspensi bakteri (sumbu x) dengan jumlah satuan pembentuk koloni (SPK) bekteri per ml biakan (sumbu y). Kurva baku populasi mikrob terpilih ditentukan untuk memudahkan teknik inokulasi pada percobaan selanjutnya. Kurva ini menyatakan hubungan antara nilai kerapatan optik suspensi mikrob dengan Satuan Pembentuk Koloni (SPK) yang ditentukan dengan metode cawan hitung. Sehingga, inokulasi pada percobaan selanjutnya dapat menggunakan populasi mikrob yang seragam. -isolat yang telah didapatkan diambil menggunakan ose kemudian ditumbuhkan pada media NB. Setelah 2 hari diinkubasi di atas shaker, suspensi bakteri di dalam medium NB diencerkan berurut 2,3,4,8dan 10 kali dan diukur nilai kerapatan optiknya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 620nm. Pada waktu yang bersamaan setiap tingkat pengenceran ditentukan populasi mikrob dengan metodecawan hitung. Populasi mikrob dan nilai kerapatan optisnya dihubungkan dengan persamaan regresi linier, yang digunakan sebagai kurva baku populasi mikrob dalam medium. Uji Aktivitas Bakteri dalam Biodegradasi Hidrokarbon Minyak Bumi pada Tanah Tercemar Minyak Bumi Pengukuran ph Tanah Sebanyak 10 g tanah ditambahkan akuades dengan perbandingan 1:1 kemudian dikocok selama 30 menit. Selanjutnya ph tanah diukur dengan menggunakan ph meter (SNI 06-6989-2004) Pengukuran Respirasi Tanah Pengukuran CO 2 -C bertujuan untuk mengetahui tingkat aktivitas bakteri dalam menurunkan bobot minyak bumi.tanah dimasukkan ke dalam toples kemudian diberi 2 tabung film berisi 5 ml 0,2 N KOH dan 10 ml air dan ditutup sampai kedap udara. Selanjutnya diinkubasi selama 3 hari pada hari: 7, 14, 21 dan 28 pada suhu ruang di tempat gelap. Hal yang sama dilakukan pada kontrol, yaitu toples tanpa tanah.
15 Pada akhir inkubasi ditambahkan 2 tetes phenolphtalein ke dalam tabung film KOH kemudian dititrasi dengan HCl sampai warna merah hilang dan dicatat volume HCl yang diperlukan. Selanjutnya ditambahkan 2 tetes metil oranye dan dititrasi lagi dengan HCl sampai warna kuning berubah menjadi pink lalu volume HCl yang diperlukan dicatat. Menurut Anas (1989) jumlah CO 2 -C yang dihasilkan per kg tanah lembab per hari dihitung dengan rumus: r= (a b)x t x 12 x n Dimana: a = HCl contoh tanah (ml), b = HCl control (ml), t = normalitas HCl (N), n = jumlah hari inkubasi dan BKM = bobot kering mutlak tanah (g). Pengukuran Total Petroleum Hydrocarbon (TPH) Pengukuran Total Petroleum Hydrocarbon bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri mendegradasi senyawa hidrokarbon.tph diukur dengan metode gravimetri. Sampel sedimen kering dimasukkan ke dalam screw cap sebanyak 5 g. Setelah itu diekstraksi dengan menambahkan DCM : n-heksan sebanyak 5 ml (perbandingan sampel dengan DCM : n-heksan adalah 1:1) dan dihomogenkan. Setelah itu, larutan DCM : n-heksan yang berada di lapisan atas di dalam screw cap diambil dan disisakan sedikit lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 1,5 g Na 2 SO 4. Selanjutnya DCM : n-heksan 7 ml dimasukkan lagi ke dalam screw cap dalam dua tahap ekstraksi (5 ml kemudian 2 ml). Setelah ekstraksi selesai, tabung reaksi yang berisi hasil ekstrak ditutup dengan aluminium foil dan didiamkan selama 24 jam. Setelah itu hasil ekstrak dimasukkan ke dalam cawan porselin yang telah ditimbang beratnya terlebih dahulu. Cawan tersebut ditutup dengan aluminium foil dan ditunggu hingga hasil ekstrak menguap. Setelah kering cawan porselin ditimbang kembali. BPM BP %TPH = x 100% BS Dimana: BPM = Berat cawan Porselin + Minyak (g), BP = Berat Porselin (g), B = Berat Sampel (g) Rancangan Percobaan Pengujian dilakukan berdasarkan rancangan acak lengkap 2 faktor dan 3 ulangan. Untuk faktor yang berpengaruh nyata dilakukan uji lanjut Duncan. Kedua faktor tersebut adalah: 1. Faktor bakteri (B) terdiri 8 taraf, yaitu (i) B 0 = tanpa inokulasi bakteri (ii) B 1 = inokulasi A (iii) B 2 = inokulasi B (iv) B 3 = inokulasi C (v) B 4 = inokulasi A + B
16 (vi) B 5 = inokulasi B + C (vii) B 6 = inokulasi A + C (viii) B 7 = inokulasi A + B + C Ket : A =Bacillus sp. ICBB 7859 B =Bacillus sp. ICBB 9461 C =Bacillus sp. ICBB 5071 2. Faktor kontaminan (K) terdiri dari 3 taraf, yaitu; (i) K 1 = Penambahan minyak berat(api Gravity 21,93) (ii) K 2 = Penambahan minyak ringan(api Gravity 40,6) (iii)k 3 = Penambahan limbah oli bekas(api Gravity 34,9) Sebelum diinokulasikan ke media tanah, Bacillus sp. ICBB 7859, Bacillus sp. ICBB 9461 dan Bacillus sp ICBB 5071 ditumbuhkan dalam media LB selama 24 jam dengan pengocokan. Kemudian diukur nilai kerapatan optiknya untuk menetapkan jumlah per ml biakan bakteri dengan menggunakan kurva standar. Penelitian ini menggunakan masing-masing bakteri sebanyak 10 6. Sedangkan pada kontrol, dilakukan penambahan bakteri yang sudah dibunuh atau sel mati bakteri. Media yang digunakan adalah 2500 g tanah tercemar minyak bumi nonsteril yang merupakan campuran 2250 g tanah dan 250 g minyak bumi (10%). Tanah dikondisikan optimum untuk pertumbuhan bakteri, yaitu dengan mengatur kadar air pada kapasitas lapang dan memberikan aerasi melalui pengadukan tanah 3 kali seminggu. Selain itu, ditambahkan pupuk urea dan SP-36 masingmasing 500 kg N dan 50 kg P per 100 ton hidrokarbon minyak bumi (API 1980).
17 Bagan alir kegiatan penelitian disajikan pada gambar 5. Peremajaan 15 Seleksi dengan medium minimal cair yang mengandung sludge minyak API Gravity 21,93 Tiga yang terbaik Karakterisasi Uji Hypersensitive Response Uji Haemolysis Kurva Pertumbuhan OD dan bakteri Uji Antagonis Bioremediasi skala Laboratorium Analisis Mingguan Aktivitas Bakteri (ph tanah, Respirasi tanah dan TPH) Gambar 5. Diagram alir kegiatan percobaan Gambar 5 Diagram alir kegiatan percobaan.