DAFTAR ISI Hal JUDUL.. LEMBAR PENGESAHAN... PERNYATAAN... KATA PENGANTAR... DAFTAR ISI... DAFTAR PUBLIKASI... DAFTAR TABEL... DAFTAR GAMBAR... DAFTAR LAMPIRAN... DAFTAR SINGKATAN... ABSTRAK... ABSTRACT... i ii iii iv vii xii xii xiv xix xxi xxiii xxiv BAB I PENDAHULUAN... 1 I.1 Latar belakang... 1 I.2 Perumusan masalah... 3 I.3 Manfaat penelitian... 4 I.4 Tujuan penelitian... 5 I.4.1 Tujuan umum... 5 I.4.2 Tujuan khusus... 5 I.5 Keaslian penelitian... 6 vii
BAB II TINJAUAN PUSTAKA... 8 II.1 Tumbuhan kasturi, kerabat, dan kandungannya.... 8 II.1.1 Tumbuhan kasturi (Mangifera casturi Kosterm.)... 8 II.1.2 Genus Mangifera... 11 II.1.3 Keaneragaman senyawa dalam buah dan bagian lain dalam tumbuhan... 12 II.2 Imunomodulator... 15 II.2.1 Mekanisme kerja imunomodulator... 20 II.2.2 Respon imun... 23 II.2.3 Makrofag... 24 II.3 Antioksidan... 27 II.3.1 Metode pengukuran antioksidan... 30 II.3.2 Senyawa antioksidan fenolik dalam makanan... 33 II.4 Penelusuran senyawa bahan alam... 35 II.4.1 Ekstraksi... 35 II.4.2 Fraksinasi... 35 II.4.3 Kromatografi lapis tipis (KLT)... 36 II.4.4 Isolasi senyawa... 37 II.4.5 Identifikasi... 43 II.5 Keterangan empiris... 50 BAB III METODE PENELITIAN... 54 III.1 Rancangan penelitian... 54 III.2 Variabel penelitian... 55 viii
III.2.1 Sampel uji... 55 III.2.2 Aktivitas antioksidan... 55 III.2.3 Aktivitas imunomodulator... 55 III.2.4 Elusidasi struktur... 55 III.3 Bahan yang digunakan... 56 III.3.1 Bahan tumbuhan dan pengolahannya... 56 III.3.2 Bahan kimia dan pendukung... 56 III.3.3 Hewan uji... 57 III.4 Alat yang digunakan... 57 III.5 Tempat penelitian... 58 III.6 Jalannya penelitian... 58 III.6.1 Ekstraksi... 58 III.6.2 Fraksinasi... 58 III.6.2.1 Fraksinasi dengan pelarut n-heksana... 58 III.6.2.2 Fraksinasi dengan pelarut etil asetat... 59 III.6.2.3 Fraksinasi dengan pelarut metanol... 59 III.6.3 Isolasi dan identifikasi... 60 III.6.3.1 Penelusuran senyawa target... 60 III.6.3.2 Isolasi senyawa aktif... 61 III.6.3.3 Identifikasi senyawa aktif... 63 III.6.4 Uji aktivitas antioksidan ekstrak, fraksi, dan isolat.. 65 III.6.5 Uji Imunomodulator In-vitro... 66 III.7 Analisis Data... 67 ix
III.8 Skema kerja penelitian... 69 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN... 70 IV.1 Karakteristik buah kasturi... 70 IV.2 Pembuatan simplisia buah kasturi... 70 IV.3 Ekstraksi... 71 IV.4 Fraksinasi... 71 IV.5 Isolasi... 72 IV.6 Uji aktivitas antioksidan... 77 IV.6.1 Aktivitas kuantitatif antioksidan ekstrak metanol dan fraksinya... 78 IV.6.2 Aktivitas antioksidan isolat 1, isolat 2, dan isolat 3... 82 IV.7 Uji aktivitas imunomodulator... 83 IV.7.1 Isolat 1... 83 IV.7.2 Isolat 2... 86 IV.7.3 Isolat 3... 89 IV.8 Identifikasi struktur senyawa hasil isolasi... 97 IV.8.1 Elusidasi struktur isolat 1... 97 IV.8.1.1 Interpretasi spektrum FT-IR... 97 IV.8.1.2 Interpretasi spektrum massa (LCMS)... 98 IV.8.1.3 Interpretasi spektrum 13 C-NMR-DEPT... 99 IV.8.1.4 Interpretasi spektrum 1 H-NMR... 105 IV.8.1.5 Interpretasi spektrum COSY... 108 IV.8.1.6 Interpretasi spektrum HMQC... 110 x
IV.8.1.7 Interpretasi spektrum HMBC... 111 IV.8.2 Elusidasi struktur isolat 2.. 116 IV.8.2.1 Interpretasi spektrum inframerah... 116 IV.8.2.2 Interpretasi spektrum massa (LCMS)... 117 IV.8.2.3 Interpretasi spektrum 13 C-NMR-DEPT... 118 IV.8.2.4 Interpretasi spektrum 1 H-NMR... 124 IV.8.3 Elusidasi struktur isolat 3.. 127 IV.8.3.1 Interpretasi spektrum UV-Vis... 128 IV.8.3.2 Interpretasi spektrum IR... 128 IV.8.3.3 Interpretasi spektrum massa (LCMS)... 129 IV.8.3.4 Interpretasi spektrum 13 C-NMR- DEPT... 132 IV.8.3.5 Interpretasi spektrum 1 H-NMR... 135 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN... 139 V.1 Kesimpulan... 139 V.2 Saran... 140 DAFTAR PUSTAKA... 141 LAMPIRAN... 157 RINGKASAN... 179 SUMMERY... 180 NASKAH PUBLIKASI ILMIAH... 181 MANUSCRIPT... 182 xi
DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1 Beberapa buah sekerabat dengan mangga daerah Barito Timur Kalimantan... 10 Tabel 2 Spesies tumbuhan dari genus mangifera... 11 Tabel 3 Kandungan kimia tumbuhan dari genus mangifera... 12 Tabel 4 flavonoid total beberapa ekstrak tumbuhan Kalimantan... 13 Tabel 5 Tabel korelasi jenis vibrasi terhadap frekwensi, panjang gelombang dan intensitas pada sepektrum IR... 45 Tabel 6 Aktivitas antioksidan ekstrak metanol, fraksi n-heksana, fraksi etil asetat, fraksi metanol, dan quersetin (kontrol positif) terhadap penangkapan radikal bebas DPPH... 78 Tabel 7 Analisis ANOVA aktivitas antioksidan ekstrak metanol, fraksi n-heksana, fraksi etil asetat, dan fraksi metanol.... 81 Tabel 8 Aktivitas antioksidan dari sampel (isolat 1, 2 dan 3) dan quersetin (kontrol positif)... 82 Tabel 9 Analisis ANOVA aktivitas antioksidan isolat 1, isolat 2, isolat 3, dan quersetin (kontrol positif)... 83 Tabel 10 Persentase aktivitas fagositasi dan index fagositasi setelah pemberian isolat 1 ± SE... 84 Tabel 11 Hasil analisis ANOVA isolat 1 terhadap aktivitas imunomodulator... 86 xii
Tabel 12 Persentase makrofag aktif yang memfagosit latex setelah pemberian isolat 2 ± SE... 87 Tabel 13 Hasil analisis ANOVA isolat 2 terhadap aktivitas imunomodulator... 88 Tabel 14 Persentase makrofag aktif yang memfagosit latex setelah pemberian isolat 3 ± SE... 90 Tabel 15 Hasil analisis ANOVA isolat 3 terhadap aktivitas imunomodulator... 91 Tabel 16 Analisis Tukey ANOVA aktivitas fagositasi makrofag dari isolat 1, isolat 2, isolat 3, dan kontrol pelarut... 93 Tabel 17 Analisis Tukey ANOVA indek fagositasi makrofag dari isolat 1, isolat 2, isolat 3, dan kontrol pelarut... 93 Tabel 18 Spektrum 13 CNMR isolat 1 (500 MHz, CDCl 3 )... 103 Tabel 19 Spektrum 1 HNMR isolat 1... 106 Tabel 20 Spektrum 13 CNMR isolat 2... 122 Tabel 21 Spektrum 1 HNMR isolat 2... 125 Tabel 22 Spektrum 13 CNMR dan DEPT isolat 3... 134 Tabel 23 Spektrum 1 HNMR isolat 3... 136 xiii
DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1 (a) pohon kasturi dan (b) buah kasturi (c) daging buah dan biji... 10 Gambar 2 a. Senyawa dalam kulit batang Mangifera indica L.... 13 b. Senyawa dalam kulit batang Mangifera indica L.... 14 Gambar 3 Senyawa dalam kulit buah Mangifera indica L...... 14 Gambar 4 senyawa dalam daun Mangifera indica L.... 15 Gambar 5 Senyawa golongan flavonoid yang bersifat imunomodulator.. 17 Gambar 6 a.senyawa golongan alkaloid yang bersifat imunomodulator.. 17 b.senyawa golongan alkaloid yang bersifat imunomodulator.. 18 Gambar 7 Senyawa golongan terpen sebagai imunomodulator... 19 Gambar 8 Senyawa kifunensine sebagai imunomodulator... 20 Gambar 9 Levamisole.. 21 Gambar 10 Azathioprin... 22 Gambar 11 Sistem imun dalam tubuh. 23 Gambar 12 Peningkatan aktivitas makrofag dalam tubuh... 24 Gambar 13 Mouse macrophage [ MMa-bm ] - immunostaining for CD11b, 200X... 26 Gambar 14 a. Struktur senyawa antioksidan... 29 a. Struktur senyawa antioksidan... 29 Gambar 15 Seyawa antioksidan dari kulit buah manggis... 29 Gambar 16 Reaksi DPPH dengan senyawa antioksidan... 32 Gambar 17 Mekanisme reaksi antioksidan BHT-DPPH 33 Gambar 18 Senyawa golongan fenolik dalam makanan... 34 xiv
Gambar 19 Pita kromatografi lapis tipis preparatif... 38 Gambar 20 Kromatografi cair vakum (KVC)... 39 Gambar 21 Kromatografi kolom (KK)... 42 Gambar 22 Spektrum infra merah dari parakresol, pelet KBr... 47 Gambar 23 Korelasi pergeseran kimia pada spektrum 1 H-NMR.. 49 Gambar 24 a. Posisi CH 3, CH 2, CH, dan C pada 13 CNMR-DEPT, b. Spektrofotometer DEPT dari senyawa citronellol... 50 Gambar 25 Triterpenoid dari kulit batang Mangifera indica L.... 51 Gambar 26 Skema penelitian... 69 Gambar 27 Profil kromatogram ekstrak metanol buah kasturi setelah disemprot dengan penampak bercak DPPH dan Ce(SO 4 ) 2... 73 Gambar 28 Profil kromatogram ekstrak metanol dan fraksi nheksana buah kasturi stelah disemprot dengan penampak bercak DPPH, FeCl 3, dan Ce(SO 4 ) 2... 73 Gambar 29 Profil kromatogram ekstrak metanol dan fraksi etil asetat buah kasturi stelah disemprot dengan penampak bercak DPPH, FeCl 3, dan Ce(SO 4 ) 2... 74 Gambar 30 Profil kromatogram hasil isolasi KLTP fraksi n-heksana buah kasturi setelah disemprot dengan penampak bercak, (a) DPPH dan (b) Ce(SO 4 ) 2... 75 Gambar 31 a. kristal isolat `1 dan b. kristal isolat 2 perbesaran 100... 76 Gambar 32 Profil kromatogram isolat murni dari fraksi n-heksana buah kasturi... 76 Gambar 33 Profil kromatogram isolat murni dari fraksi etiasetat buah kasturi... 77 Gambar 34 Grafik hubungan antara dosis (µg) dan penurunan (%) radikal hidrogen pada sampel uji (ekstrak dan fraksi buah kasturi) dan pembanding (quersetin)... 79 xv
Gambar 35 Struktur senyawa quersetin... 80 Gambar 36 Boxplot hubungan antara dosis dengan rasio fagositasi makrofag dan index fagositasi makrofag setelah pemberian isolat 1... 84 Gambar 37 Boxplot hubungan antara dosis dengan rasio fagositasi makrofag dan index fagositasi makrofag setelah pemberian isolat 2... 87 Gambar 38 Boxplot hubungan antara dosis dengan rasio fagositasi makrofag dan index fagositasi makrofag setelah pemberian isolat 3... 90 Gambar 39 Makrofag aktif memfagosit latex setelah pemberian senyawa hasil isolasi (perbesaran 40 x)... 92 Gambar 40 Spektrum fourier transform infrared isolat 1 dalam pelet KBr... 97 Gambar 41 Spektrum LCMS (ESI pos ion-70 ev) isolat 1... 98 Gambar 42 Spektrum 13 CNMR (500 MHz, CDCl 3 ) isolat 1... 99 Gambar 43 Spektrum a-1 ( 13 CNMR, 500MHz-CDCl 3 ) dan b-1 (DEPT,500MHz-CDCl 3 ) isolat 1 (δ C 15,11 ppm - δ C 30,84 ppm)... 100 Gambar 44 Spektrum a-2 ( 13 CNMR, 500MHz-CDCl 3 ) dan b-2 (DEPT, 500MHz-CDCl 3 ) isolat 1 (δ C 35,57 ppm - δ C 56,87 ppm)... 101 Gambar 45 Spektrum a-3 ( 13 CNMR, 500MHz-CDCl 3 ) dan b-3 (DEPT, 500MHz-CDCl 3 ) isolat 1 (δ C 79,71 ppm - δ C 151,97 ppm)... 102 Gambar 46 Senyawa dengan jumlah atom karbon 30... 103 xvi
Gambar 47 Spektrum 1 HNMR isolat 1 (Jeol, 500 MHz, CD 3 OD)... 106 Gambar 48 Lupeol... 108 Gambar 49 Spektrum hubungan 1 H, 1 H-COSY isolat 1 (a) δ H 0,0 5,0 ppm (b) δ H 0,7 ppm 1,8 ppm... 109 Gambar 50 a. Spektrum hubungan 1 H, 13 C-HMQC isolat 1 1 H δ H 0,0 5,0 ppm; 13 CNMR δ C 0,0 150 ppm... 110 Gambar 50 b. Spektrum hubungan 1 H, 13 C-HMQC isolat 1 1 H δ H 2,4 4,6 ppm; 13 CNMR δ C 50.0 110,0 ppm... 111 Gambar 51 a. Spektrum hubungan 1 H, 13 C-HMBC isolat 1 1 H δ H 0,0 5,0 ppm; 13 C-NMR δ C 0,0 150 ppm... 112 Gambar 51 b,c. Spektrum hubungan 1 H, 13 C-HMBC isolat 1 (b) δ H 0,6 1,2 ppm; 13 CNMR δ C 14.0 30,0 ppm (c) 1 H δ H 0,7 4,6 ppm; 13 C-NMR δ C 32,0 46,0 ppm... 113 Gambar 52 HMBC hubungan simetrik antara proton dan karbon isolat 1.. 114 Gambar 53 Struktur senyawa isolat 1 (lupeol)..... 115 Gambar 54 Spektrum FT-IR isolat 2 dalam pelet KBr... 117 Gambar 55 Spektrum LCMS isolat 2 (LC MS-Esi pos ion, 70 ev)... 118 Gambar 56 Spektrum 13 CNMR isolat 2 (Jeol 500 Hz, CD 3 OD)... 119 Gambar 57 Spektrum (a-1),(b-1) 13 CNMR-DEPT isolat 2 (δ C 12,05-21,27 ppm)... 121 Gambar 58 Spektrum (a-2),(b-2) 13 CNMR-DEPT isolat 2 (δ C 23,25-37,44 ppm)... 121 Gambar 59 Spektrum (a-3),(b-3) 13 CNMR- DEPT isolat 2 (δ C 39,96-143,27 ppm)... 121 xvii
Gambar 60 Senyawa dengan jumlah atom C=29... 122 Gambar 61 a. Spektrum 1 HNMR isolat 2 (Jeol 500 MHz,CD 3 OD) δ H 3.0 8.0 ppm... 124 Gambar 61 b. spektrum 1 NMR isolat 2 (Jeol 500 Hz, CD 3 OD) δ H 0.7 1,4 ppm... 125 Gambar 62 Struktur senyawa isolat 2 (β-sitosterol)... 126 Gambar 63 Spektrum UV-Vis isolat 3... 128 Gambar 64 Spektrum FT-IR isolat 3 dalam pelet KBr... 128 Gambar 65 Spektrum spektroskopi LCMS isolat 3... 129 Gambar 66 Senyawa dengan rumus molekul C 8 H 8 O 5... 130 Gambar 67 a,b. Fragmentasi LCMS (ESI pos ion-70 ev) isolat 3 131 Gambar 68 Spektrum 13 CNMR isoslat 3 (Jeol 500 MHz, CD 3 OD)... 132 Gambar 69 Spektrum 13 CNMR-DEPT isolat 3 (Jeol 500 MHz, CD 3 OD).. 134 Gambar 70 Spektrum 1 HNMR isolat 3 (Jeol, 500 MHz, CD 3 OD)... 136 Gambar 71 Struktur isolat 3 (metil gallat)... 137 xviii
DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1 Hasil determinasi tumbuhan.. 157 Lampiran 2 Analisis regresi linear aktivitas antioksidan ekstrak metanol buah M. casturi dan fraksinya (fraksi n- heksana, fraksi etil asetat, fraksi methanol)... 158 Lampiran 3 Analisis regresi linear aktivitas antioksidan isolat 1, isolat 2 dan isolat 3 buah M. casturi... 159 Lampiran 4 Spektrum FT-IR isolat 1 160 Lampiran 5 Spektrum LCMS isolat 1... 160 Lampiran 6 Spektrum 13 C-NMR isolat 1. 161 Lampiran 7 Spektrum 1 H-NMR isolat 1.. 161 Lampiran 8 Spektrum DEPT isolat 1 161 Lampiran 9 Spektrum NMR 2 dimensi (COSY) isolat 1... 162 Lampiran 10 Spektrum NMR 2 dimensi (HMQC) isolat 1... 162 Lampiran 11 Spektrum NMR 2 dimensi (HMBC) isolat 1... 162 Lampiran 12 Spektrum FT-IR isolat 2 163 Lampiran 13 Spektrum LCMS isolat 2... 163 Lampiran 14 Spektrum 13 C-NMR isolat 2. 164 Lampiran 15 Spektrum 1 H-NMR isolat 2.. 164 Lampiran 16 Spektrum DEPT isolat 2 162 Lampiran 17 Spektrum UV-Vis isolat3 3.. 165 Lampiran 18 Spektrum FT-IR isolat 3 165 Lampiran 19 Spektrum LCMS isolat 3... 166 xix
Lampiran 20 Spektrum 13 C-NMR isolat 3. 166 Lampiran 21 Spektrum 1 H-NMR isolat 3... 167 Lampiran 22 Spektrum DEPT isolat 3... 167 Lampiran 23 Uji normalitas data aktivitas antioksidan dari ekstrak, fraksi, dan isolat buah kasturi (Mangifera casturi)... 168 Lampiran 24 Uji normalitas data aktivitas imunomodulator isolat 1 dari buah kasturi (Mangifera casturi Kosterm.). 168 Lampiran 25 Uji normalitas data aktivitas imunomodulator isolat 2 dari buah kasturi (Mangifera casturi Kosterm.). 169 Lampiran 26 Uji normalitas data aktivitas imunomodulator isolat 3 dari buah kasturi (Mangifera casturi Kosterm.) 169 Lampiran 27 Analisis statistik (SPSS 16.0) IC 50 antioksidan ekstrak methanol buah kasturi 170 Lampiran 28 Analisis statistik (SPSS 16.0) IC 50 antioksidan fraksi n- heksana dari ekstrak methanol buah kasturi... 171 Lampiran 29 Analisis statistik (SPSS 16.0) IC 50 antioksidan fraksi etil asetat dari ekstrak methanol buah kasturi... 172 Lampiran 30 Analisis statistik (SPSS 16.0) IC 50 antioksidan fraksi metanol dari ekstrak methanol buah kasturi. 173 Lampiran 31 Analisis statistik (SPSS 16.0) IC 50 antioksidan isolat 1.. 174 Lampiran 32 Analisis statistik (SPSS 16.0) IC 50 antioksidan isolat 2.. 175 Lampiran 33 Analisis statistik (SPSS 16.0) IC 50 antioksidan isolat 3.. 176 Lampiran 34 Analisis statistik (SPSS 16.0) IC 50 antioksidan Quersetin... 177 Lampiran 35. Sel makrofag terisolasi sebelum pengecatan... 178 xx