Bidang: Ketahanan Pangan LAPORAN HIBAH PENELITIAN STRATEGIS NASIONAL Tahun Anggaran 2009 JUDUL PENELITIAN : Kajian Molecular 16S RNA Khamir Laut Isolate Baru untuk Bioprospekting Pengembangan Pakan dan Pangan di Bidang Perikanan Dibiayai oleh Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional, melalui DIPA Universitas Brawijaya No. 0174.0/023-04.2/XV/2009 tanggal 31 Desember 2008 dan berdasarkan SK Rektor Nomor : 160/SK/2009, tanggal 7 Mei 2009 Peneliti Utama : Ir. Sukoso, MSc. PhD Peneliti Anggota: Dr. Ir. Happy Nursyam, MS. Dr. Uun Yanuhar, Spi. MSi. UNIVERSITAS BRAWIJAYA 2009
RINGKASAN Perkembangan bioteknologi dewasa ini semakin pesat dengan kajian molekular. Salah satu obyek penelitian biologi molekuler dalam pengembangan bioteknologi adalah khamir. Pengenalan karakteristik digunakan sebagai acuan dasar untuk budidaya, melandasi penelitian lanjutan maupun tataran aplikasi. Data molekuler akan melandasi rekayasa bioteknologi modern terhadap khamir laut sehingga lebih berdaya guna. Daratan selama ini menjadi lahan produksi utama bagi pemenuhan kebutuhan pangan dan ekonomi dunia. Namun, sejalan dengan berkembangnya ilmu bioteknologi manusia juga kini berusaha memanfaatkan secara optimal potensi sumberdaya hayati lautan. Salah satu sumber daya yang coba dikembangkan potensi pangan dan ekonominya melalui kajian bioteknologi adalah khamir laut. Penelitian khamir laut sangat sedikit dilakukan di Indonesia, bahkan belum ada bank data tentang khamir laut di perairan Indonesia. Khamir / yeast termasuk fungi, tetapi dibedakan dari kapang karena bentuknya yang uniseluler, reproduksi vegetatif terutama dengan pertunasan, tumbuh dan berkembang biak lebih cepat dengan luas permukaan dengan volume lebih besar jika dibandingkan dengan kapang. Dalam sistematik yeast termasuk dalam kingdom Fungi divisi Eumecotina yang terbagi dalam dalam 4 subdivisi : Phycomycetes (zigomycetes), Ascomecetes, Basidiomycetes, dan deuteromycetes. Khamir laut merupakan salah satu anggota dari khamir yang masih belum banyak dikembangkan potensinya di Indonesia. Berdasarkan fenomena tersebut maka perlu dilakukan penelitian tentang karakteristik khamir laut melalui pendekatan fisiologis dan molekuler untuk memanfaatkan khamir laut secara optimal baik untuk bidang pakan maupun pangan. Tujuan umum dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan spesies baru khamir laut dan mengeksplorasinya secara molekular. Tujuan khusus dari penelitian ini adalah eksplorasi molekular untuk perekayasaan genetika guna mengembangkan pemanfaatan khamir laut di bidang pangan dan pakan di bidang perikanan. Manfaat praktis dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan bidang rekayasa bioteknologi untuk mengekplorasi materi genetik dan kandungan bioaktif untuk mengembangkan pemanfaatan khamir laut di bidang pangan dan pakan di bidang perikanan. Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode deskriptif. Pelaksaan kultur khamir laut dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Brawijaya, isolasi DNA dan sekuensing dilakukan dilaboratorium teknologi Genetika BPPT Serpong, Tangerang. Koloni murni yang telah ditumbuhkan dengan metode streak pada medium Malt Extract Agar (MEA) tumbuh setelah diinkubasi selama 24 jam dengan menggunakan suhu ruang dengan bentuk koloni bulat cembung mengkilat berwarna putih susu. Isolasi DNA dari kultur murni khamir laut yang berumur 48 jam menghasilkan DNA total dengan konsentrasi 489.6 ng/µl dan tingkat kemurnian DNA 2.03 (260 / 230).
Amplifikasi pada dua wilayah penanda kekerabatan, 16S (dengan primer 8F 5 -AGA GTT TGA TCC TTG GCT CAG-3 dan 1492R 5 -GCT TAC CTT GTT ACG ACT T-3 ), 28S (dengan menggunakan primer NL1 5 -TGC TGG AGC CAT GGA TC-3 dan NL4 5 -TAG ATA CAT GGC GCA GTC-3 ) tidak menghasilkan produk Amplifikasi DNA sehingga amplifikasi dilakukan pada wilayah ITS (dengan menggunakan primer ITS 1 5 -TCC GTA GGT GAA CGT GCG G-3 dan ITS 4 5 -TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3 ) dan menghasilkan 1 band pada panjang basa 500 600 bp pada penanda marker gene ruler 1 kb Selanjutnya DNA di sekuens dengan ABI genetic analyzer dan urutan DNA hasil sekuensing disusun (assembly), yaitu pembacaan dari dua arah (forward dan reverse) dengan menggunakan program ATGC. Untuk basa basa yang dibaca kurang sesuai dengan electrophoregram yang dihasilkan akan dilakukan koreksi. Hasil pembacaan basa basa yang berhasil di sekuens adalah sebagai berikut: 5 GCACCACATGTGTTTTTTATTGAACAAATTTCTTTGGTGGCGGGAGCAATC CTACCGCCAGAGGTTATAACTAAACCAAACTTTTTATTTACAGTCAAACTTGA TTTATTATTACAATAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCAT CGATAAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATATGAATTGCAGATATTCGT GAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCA TGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCCCTCAAACCCCCGGGTTTGGTGTTGAGCA ATACGCTAGGTTTGTTTGAAAGAATTTAC 3 Selanjutnya, urutan DNA yang telah di assembly tersebut di salin ke dalam bentuk Fasta untuk dianalisis dengan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Khamir laut yang diuji memiliki kekerabatan 100% dengan Candida tropicalis NT1410 yang diisolasi dari pantai timur Taiwan (Chen, 2008) Dengan demikian dapat dikatakan bahwa khamir laut yang diuji setingkat substrain dengan Candida tropicalis NT1410 yang selanjutnya disebut dengan Candida tropicalis YUB2009
SUMMARY The development of biotechnology on molecular study is growing rapidly. Yeast is eucaryotic microorganism classified in to the kingdom fungi, however, yeast is different from common fungus based on its unicellular form, vegetative reproduction with budding, and its reproductive phase is faster compared with common fungus. It also ha a wider colony form compared with common fungus colony. In a systematic phylogenetic tree, yeast is classified into Kingdom Fungi, Division Eumicotina that divided into four sub division : Phycomycetes (zigomycetes), Ascomecetes, Basidiomycetes, and deuteromycetes. Marine yeast used in this study is included to Ascomycetes that has not been optimally utilized in Indonesia. The discovery of marine yeast characteristic and phisiologis is important as a basis of its culture, the further research and its application. The study of chemical and nutrition value or marine yeast can be used as basis of marine yeast utilization as a food and feed resource primarily on fisheries field. The aims of this study is to explore mollecular properties of a novel marine yeast isolated from Java Sea in order to get a new species that had not been identified yet. The practical advantage of this study to develop biotechnological engineering to explore genetical matter of novel marine yeast and its bioactive components. Descriptive methods were used in this study. Marine yeast culturing were done at Basic Microbiology Laboratory, Fisheries and Marine Faculty, Brawijaya University, DNA isolation and sequencing were done at Genetic Technology Laboratory BPPT Serpong, Tangerang. Pure culture was obtained at Malt Extract Agar (MEA) using streaking methods. After 24 hours incubation, marine yeast formed circle, convex, and shiny colonies. DNA isolation for 48 hours old colonies resulted genomic DNA which has concentration 489.6 ng/µl and DNA purity 2.03 (260 / 230). PCR amplification on two phylogenic DNA region, 16S (primers 8F 5 - AGA GTT TGA TCC TTG GCT CAG-3 and 1492R 5 -GCT TAC CTT GTT ACG ACT T-3 ), 28S (primera NL1 5 -TGC TGG AGC CAT GGA TC-3 and NL4 5 - TAG ATA CAT GGC GCA GTC-3 ) did not result DNA amplification product. Therefore, DNA amplification was done on ITS region (primers ITS 1 5 -TCC GTA GGT GAA CGT GCG G-3 and ITS 4 5 -TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3 ) and resulted one band ranged on 500 600 bps measured by Marker Gene Ruler 1 kb. The amplified DNA was then purified and sequenced using ABI genetic analyzer and the sequence was then assembled using ATGC programs. The sequences of Marine Yeast DNA was: 5 GCACCACATGTGTTTTTTATTGAACAAATTTCTTTGGTGGCGGGAGCAATC CTACCGCCAGAGGTTATAACTAAACCAAACTTTTTATTTACAGTCAAACTTGA TTTATTATTACAATAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCAT CGATAAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATATGAATTGCAGATATTCGT GAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCA
TGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCCCTCAAACCCCCGGGTTTGGTGTTGAGCA ATACGCTAGGTTTGTTTGAAAGAATTTAC 3 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) was used to analyze the phylogenetic relationship of the marine yeast. It has 100% relationship to Candida tropicalis NT1410 isolated from east coast of Taiwan (Chen, 2008). Thus, the marine yeast is on a substrain level with Candida tropicalis NT1410 and then named Candida tropicalis YUB2009.