3.1 Tempat dan Waktu BAB III BAHAN DAN METODE PENELITIAN Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan, Balai Penelitian Tanaman Kelapa dan Palma Lain (Balit Palma) Manado, pada bulan Desember 2011 hingga Maret 2012. 3.2 Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan dalam peneltian ini, terdiri dari: Embrio kelapa Genjah Salak yang belum matang berasal dari buah umur 9 bulan. Bahan kimia penyusun media Eeuwens, dan bahan kimia untuk sanitasi. Zat pengatur tumbuh Giberelic Acid (GA3). Bahan pembantu lainnya (alkohol, tisue, kapas, aluminium foil, aquades, Byclean, karet gelang) Alat-alat yang akan digunakan dalam penelitian ini, terdiri dari: Laminar air flow (LAF), Autoclave, Timbangan analitik, Oven, Peralatan gelas (gelas ukur, labu ukur, erlenmeyer, beker gelas, tabung/ botol kultur, petridish, pipet), Scalpel, Gunting, Lampu Bunsen, Cock borer, Hot plate, Pinset, ATM dan Kamera (Dokumentasi) 3.3 Metode Penelitian Penelitian ini dilakukan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan enam perlakuan dan tiga ulangan. Setiap perlakukan menggunakan 10 embrio sehingga penelitian ini membutuhkan 180 embrio Kelapa GSK. Perlakuan yang dicobakan adalah pemberian konsentrasi GA3/ l media yang terdiri atas: 1. P0 = 0 ppm (Kontrol) 2. P1 = 40 ppm 19
3. P2 = 50 ppm 4. P3 = 60 ppm 5. P4 = 70 ppm 6. P5 = 80 ppm 3.4 Parameter yang di amati 1. Kecepatan kecambah (hari) Dihitung waktu yang dibutuhkan embrio untuk berkecambah perhitungan waktu ini dimulai dari kultur awal sampai embrio tersebut berkecambah (COPELAND,1977) Kecepatan kecambah digunakan sebagai penilaian Vigor yang dirumuskan sebagai berikut : I.V : I.V = Indeks Vigor 2. Daya kecambah (%) G = Jumlah benih yang berkecambah pada hari tertentu D = Waktu yang bersesuaian dengan jumlah tersebut n = Jumlah hari pada perhitungan akhir Dihitung jumlah embrio yang berkecambah selama satu bulan pada masingmasing perlakuan dan dihitung nilai rata-rata masing-masing kemudian dipersenkan (Mashud, 1999) Daya Kecambah (% ) = Jumlah embrio yang berdaya kecambah x 100% Jumlah seluruh embrio pada perlakuan 20
3.5 Pelaksanaan Penelitian Pelaksanaan Penelitian terdiri atas beberapa tahap yaitu : a) Persiapan Alat dan Bahan Peralatan dan bahan bahan yang akan digunakan perlu disiapkan terlebih dahulu sebelum penelitian dimulai seperti tabung kultur dan peralatan gelas yang akan digunakan dalam kultur embrio dan bahan-bahan seperti alkohol, tisu dan alumunium foil. Alat dan bahan yang digunakan dalam keadaan aseptik. b) Pemilihan Sumber Eksplan di Lapang Buah kelapa GSK dipilih yang segar, bebas hama dan penyakit dan berumur 9 bulan. c) Pengambilan Embrio Kelapa Langkah awal yang harus kita lakukan untuk pengambilan embrio kelapa yaitu melakukan pengupasan buah, pembelahan menjadi dua bagian. Selanjutnya dengan menggunakan Cock borer embrio kelapa diambil dalam bentuk silinder endosperm. Gambar 3 : Embrio kelapa dalam bentuk silinder endosperm 21
d) Sterilisasi Sterlisasi Alat Sterilisasi alat dilakukan dengan dua cara yaitu sterilisasi basah yang menggunakan autoclave dan sterilisasi kering yang menggunakan oven. Untuk oven menggunakan temperatur 105 0 C dan autoclave menggunakan temperatur 121 0 C selama 3 jam dengan tekanan tinggi Sterilisasi media Untuk sterilisasi media, langkah awal hampir sama dengan sterilisasi alat, yaitu dengan menyiapkan media yang akan disterilkan, kemudian media disteril basah menggunakan autoclave. Sterilisasi Silinder Endosperm dan Embrio Sterilisasi silinder endosperm yang berisi embrio dilakukan diluar Laminar Air Flow (LAF), dengan cara dicuci dengan air mengalir, direndam dalam alkohol 95% selama 30 menit, kemudian dengan bayclean 20% selama 20 menit. Silinder endosperm yang steril ini dimasukan dalam beker gelas dan dimasukan ke dalam LAF, dibilas dan diambil embrionya. Embrio-embrio ini direndam dalam bayclean 10% selama 1 menit, kemudian dibilas dengan aquades steril, embrio siap di kulturkan dalam media Y3. e) Pembuatan Larutan Stok Pembuatan Larutan Stok Makro. Stok Makro terdiri atas NH 4 Cl (5,35 g), KNO 3 (20,20 g), MgSO 4. 7H 2 O (2,47 g), CaCl 2. 2H 2 O (2,97 g), KCl (14,92 g), semua bahan dilarutkan dalam aquades dan digenapkan menjadi 1000 ml untuk stok 100 ml/liter. 22
Pembuatan Larutan Stok Mikro. Stok Mikro terdiri atas KI (0,83 g), H 3 BO 3 (0,31 g), MnSO 4.4H 2 O (1,12g), 2nSO 4.7H 2 O (0,72g), CuSO 4. 5H 2 O (0,025g), CoCl2. 6H 2 O (0,024g), Na2MoO4.2H2O ( 0,024g), NiCl. 6H 2 O (0,0024 g), semua bahan dilarutkan dalam aquades dan digenapkan menjadi 100 ml untuk stok 1 ml/ liter. Pembuatan Stok Vitamin. Menimbang Pyridoxin HCl (0,005 g), Thiamine HCl (0,005g), Nicotinic Acid (0,05 g), Biotin (0,005 g), Folic acid (0,005 g), Glycine (0,1 g), semua bahan ditimbang dilarutkan dalam aquades dan digenapkan menjadi 100 ml untuk stok 1 ml/liter. Pembuatan Stok Na2 EDTA Stok terdiri atas FeSO4. 7H2O (0,417 g) dan Na2 EDTA (0,558). Kedua jenis bahan tersebut, dilarutkan dalam aquades sebanyak 500 ml, kemudian dipanaskan dan diaduk menggunakan magnetik stirer hingga semua bahan larut, volume digenapkan dengan aquades menjadi 1000 ml (1 liter) untuk stok 100 ml/liter. f) Pembuatan Larutan Giberelic acid a. Timbang Giberelic acid kadar 90% sebanyak 1 gram b. Masukan ke dalam tabung reaksi c. Tambahkan alkohol 70% atau 90% sebanyak 20-50 ml d. Aduk hingga larut e. Tuangkan di tempat yang lebih besar, Tambahkan air sampai volumenya mencapai 1 liter (jika digunakan alkohol 20 ml air ditambahkan 980 ml) f. Larutan giberelic acid yang dihasilkan adalah konsentrasi 900 ppm 23
g) Pembuatan Larutan KOH dan Larutan HCL a. Menimbang KOH 5,61 gram/ 100 ml aquades b. Diambil HCL 37 % sebanyak 8,31 ml/ 100 ml aquades h) Pembuatan Media. Mencampurkan stok hara makro, mikro, vitamin dan Na2 EDTA dengan hati-hati, kemudian tambahkan agar-agar, arang aktif dan zat pengatur tumbuh. Dalam penelitian ini menggunakan media GA3 dengan konsentrasi/ l media adalah 0 ppm, 40 ppm, 50 ppm, 60 ppm, 70 ppm, 80 ppm. Media dimasukan ke dalam tabung kultur dengan volume 10 ml/tabung untuk kultur awal. Kemudian dilakukan penanaman embrio dalam media secara aseptik dalam tabung kultur, jika embrio sudah berkecambah disubkulturkan ke media dengan volume 25 ml/tabung. i) Penanaman Embrio Kelapa GSK Setelah semua peralatan dan media Y3 steril, dilakukan penanaman embrio ke dalam media Y3. Penanaman embrio ini dilakukan dalam kondisi steril dalam LAF, untuk menghindari kontaminasi. Satu tabung berisi satu embrio, selanjutnya tabung yang berisi embrio ini diletakkan dalam ruangan kultur dengan penyinaran teratur. 24
3.6 Lay Out Percobaan ULANGAN P2 P1 P3 P0 P3 P1 U PERLAKUAN P3 P5 P4 P4 P2 P5 S P0 P1 P4 P2 P0 P5 25
3.7 Analisis Data Data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis sidik ragam (ANOVA) dengan Rumus Variannya sebagai berikut: Yij = µ + Pi + єij i = 1, 2, 3,,p dan j = 1, 2, 3,,u Dimana Yij : Pengamatan perlakuan ke-i dan ulangan ke-j µ : Rataan Umum Pi : Pengaruh perlakukan ke-i dan Єij : Galat perlakuan ke-i dan ulangan ke-j Kriteria Uji Lanjut : 1. Jika F hitung < F tabel maka H0 diterima H1 ditolak, perlakuan tidak berpengaruh nyata 2. Jika F hitung > F tabel maka H0 ditolak H1 diterima, perlakuan berpengaruh nyata Jika hipotesis diterima, maka akan dilanjutkan dengan uji lanjut BNT (Beda nyata terkecil). 26