Pola Pita DNA Klon Kelapa Sawit (Elaeis guineensis Jacq.) Berdasarkan Marka Simple Sequence Repeats (SSR) DNA Band Pattern of Oil Palm Clone (Elaeis guineensis Jacq.) Based on Simple Sequence Repeats (SSR) Markers Dian Arvita, Lollie Agustina P. Putri*, Eva Sartini Bayu Program Studi Agroekoteknologi, Fakultas Pertanian, USU, Medan, 20155 *Corresponding author: lollie_agustina@yahoo.com ABSTRACT The aim of the research was to find out band pattern of oil palm clone based on Simple Sequence Repeats used marker FR 0783, FR 0779, FR 3663, and FR 3745. The research was conduted in Plant Tissue Culture Laboratory, Faculty of Agriculture, University of Sumatera Utara and Bio Molecular Laboratory of SSPL (Socfindo Seed Production and Laboratories) Bangun Bandar, Dolok Masihul, Serdang Bedagai Sumatera Utara, from March 2016 to June 2016. The materials of the research from Germplasm BTC 60 Clone of PT.Socfindo. There were thirty accessions of oil palm clone were observed. DARwin 6.0 and Microsoft Excel 2007 was used to calculate and descriptive analysis. The results of the research showed using four SSR primers could obtained 9 DNA bands from the amplification of 30 oil palm clone. The size of DNA bands were varied and the percentage of polymorphic bands were also varied from 0% to 100% which FR 0779 is a monomorphic primer at 320 bp and 243 bp, FR 3663 is a monomorphic primer at 242 bp. While, FR 0783 is a polymorphic primer at 335 bp, 272 bp, 351 bp and 300 bp, FR 3745 is a polymorphic primer at 317 bp and 264 bp. FR 3745 showed difference band pattern of DNA for sample 18 and FR 0783 sample 29. Keyword : Band pattern, oil palm clone, SSR ABSTRAK Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pola pita DNA pada klon kelapa sawit PT.Socfindo berdasarkan marka Simple Sequence Repeats dengan menggunakan primer FR 0783, FR 0779, FR 3663, dan FR 3745. Penelitian ini telah dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara dan Laboratorium Bio Molekuler SSPL (Socfindo Seed Production and Laboratories) Bangun Bandar, Dolok Masihul, Serdang Bedagai Sumatera Utara pada bulan Maret - Juni 2016. Bahan tanaman yang digunakan pada penelitian berasal dari klon BTC 60 plasma nutfah PT.Socfindo. Individu yang diamati meliputi 30 aksesi klon kelapa sawit. Perhitungan dan analisis deskriptif pada penelitian ini menggunakan software DARwin 6.0 dan Microsoft Excel 2007. Hasil penelitian menunjukkan bahwa 4 primer SSR tersebut menghasilkan 9 pola pita DNA. Ukuran pita DNA yang dihasilkan bervariasi dan persentasi pita yang polimorfik juga bervariasi antara 0% dan 100% dimana FR 0779 pada 320 bp dan 243 bp serta FR 3663 pada 242 bp sedangkan primer polimorfis ditunjukkan oleh FR 0783 pada 335 bp, 272 bp, 351 bp dan 300 bp serta FR 3745 pada 317 bp dan 264 bp. Primer FR 3745 dapat menunjukkan perbedaan pola pita DNA pada sampel No. 18 serta primer FR 0783 yaitu pada sampel No. 29. Kata Kunci : Klon kelapa sawit, pola pita, SSR 599
PENDAHULUAN Kelapa sawit merupakan tanaman penghasil minyak nabati utama di Indonesia, dan memegang peranan penting dalam perekonomian Indonesia diantaranya iklim, tenaga kerja, dan kesediaan lahan yang masih cukup banyak. Menurut data statistik Direktorat Jendral Perkebunan (2016) luas areal perkebunan kelapa sawit sebesar 11.672.861 Ha dan jumlah produksi kelapa sawit pada tahun 2016 mencapai 33.500.691 ton. Produksi minyak kelapa sawit Indonesia tahun 2014 mencapai 31.5 juta ton dan pada tahun 2015 produksi minyak sawit mencapai 32,5 juta ton dimana jumlah tersebut menunjukkan telah terjadi peningkatan yang stabil selama 20 tahun terakhir sebesar 11% setiap tahunnya. Permintaan konsumsi minyak kelapa sawit dunia terus meningkat (GAPKI, 2016). Upaya peningkatan produktifitas CPO melalui pemuliaan tanaman yang berkesinambungan. Usaha merakit bahan (Afifah, 2012). tanaman kelapa sawit unggul ditentukan ketersediaan bahan dasar plasma nutfah dan variabilitas genetiknya. Untuk menjaga suplai produksi kelapa sawit tetap stabil diperlukan bibit dalam jumlah yang banyak (Putri, 2010). Perbanyakan tanaman dapat dilakukan secara generatif namun akan menghasilkan tanaman yang beragam karena kelapa sawit merupakan tanaman yang menyerbuk silang. Salah satu teknologi alternatif yang menjanjikan adalah kultur jaringan. Melalui teknologi ini telah banyak tanaman yang dapat diperbanyak secara masal, seragam dan dengan waktu relatif singkat (Mariska et al., 2013). Akan tetapi penggunaan teknik kultur in vitro dapat pula menghasilkan klon tanaman dengan penyimpangan sifat yang disebut dengan variasi somaklonal (Kiswanto et al., 2008). Perubahan sifat genetik disebabkan oleh frekuensi dan umur kalus, jenis eksplan dan kecepatan proliferasi kalus, serta zat pengatur tumbuh. Penggunaan media dasar dapat berpengaruh terhadap keberhasilan kultur jaringan (Tasma et al., 2013). Pemahaman mengenai keragaman genetik dan hubungan dengan materi plasma nutfah kelapa sawit sangat penting dalam menyeleksi materi bahan tanam unggul (Sayekti et al., 2015). Penanda molekuler lebih tepat untuk melihat keragaman genetis karena tidak dipengaruhi lingkungan. Penanda molekuler dan perbedaan dalam DNA muncul dari mutasi pada tingkat DNA yang dapat membedakan antar individu baik antar spesies maupun dalam spesies yang sama (Zidenga, 2004). Marka Simple Sequence Repeats (SSR) dapat digunakan dalam studi genetik karena berbagai keunggulan, diantaranya lokasi marka yang menyebar di seluruh genom tanaman, bersifat kodominan dan mudah diamplifikasi dengan teknik Polymaerase Chain Reaction (PCR). Untuk saat ini marka SSR merupakan marka paling prospektif (Arumsari, 2013). SSR sering disebut mikrosatelit. SSR merupakan alat bantu yang sangat akurat untuk membedakan genotipe, evaluasi kemurnian benih, pemetaan, dan seleksi genotip. Tujuan penelitian ini untuk menganalisis pola pita DNA klon tanaman kelapa sawit (Elaeis guineensis Jacq.) dengan menggunakan marka SSR (Simple Sequence Repeats). BAHAN DAN METODE Penelitian ini telah dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara, Medan dan di Laboratorium Bio Molekuler SSPL Bangun Bandar PT. Socfin Indonesia, Desa Martebing, Kecamatan Dolok Masihul, Kabupaten Serdang Bedagai, Sumatera Utara yang dimulai bulan Maret 2016 sampai dengan bulan Juni 2016. 600
Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun kelapa sawit asal klon BTC 60 sebanyak 30 sampel yang berasal dari PT. SOCFINDO, amplop coklat, plastik, label nama, alumunium foil, Polyvinylpolypyrolidone (PVPP) (Promega 77627), nitrogen cair, buffer ekstraksi Cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) 5%, NaCl, Tris, HCl, NaOH, tabung Eppendorf (tube) 2ml dan 1,5ml, tube PCR (100 µl), aquades, aquabidest, isopropanol, Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Kloroform-iso amil alkohol (KIAA), β-mercaptoethanol, etanol 70%, etanol absolute, es batu,buffer TE, larutan TBE 1x, larutan TAE 1x, agarose (Promega, V3121), etidium bromide, Benchtop 100bp DNA ladder (Promega, 100bp Ladder, Go Green Taq Master Mix (Promega, M7122), loading dye, nuclease free water (ddh2o), dan 4 primer SSR (FR 0783, FR 0779, FR 3663, FR 3745) Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah mortar, alu, gunting, spatula, mikropipet (Eppendorf Research Plus), rak tube, tips, waterbath, sentrifus (Tomy MX-Series), kulkas, freezer, timbangan analitik, hotplate, vortex (Biosan Basic Plus V-1), labu erlenmeyer, magnetic stirrer, microwave, ph meter, handspoon, alat-alat gelas (beaker glass, gelas ukur), pengaduk, pipet kristal, nanospektrometer (Eppendorf Biospectrometer), microwave, cetakan agarose, bak elektroforesis, power supply, UV Transilluminator dan Gel- Documentation (UVITEC Cambridge 20 UV), PCR/thermal cycler (Mastercycler Nexus Gradient), komputer, kamera, dan alat tulis. Untuk menentukan keragaman genetik produk PCR SSR berdasarkan muncul tidaknya pita DNA. Pita yang muncul pada gel diasumsikan sebagai alel SSR. Keragaman alel SSR ditentukan dari perbedaan migrasi alel pada gel masingmasing individu sampel. Ukuran fragmen basa (pasangan basa = bp) produk PCR ditentukan dengan menggunakan software UVITEC Cambridge Fire Reader. Fragmen DNA yang digunakan sebagai standar ukuran yaitu Bench Top DNA Ladder. Data gambar hasil elektroforesis yang dimasukkan ke dalam program akan dideteksi muncul tidaknya bands dan dinilai berdasarkan marker s value yang telah dimasukkan. Analisis ketidaksamaan menggunakan software DARwin 5.05 (Perrier dan Jacquemoud-Collet, 2006). HASIL DAN PEMBAHASAN Persentase pita polimorfik disajikan pada Tabel 1 dan hasil visualisasi elektroforegram berdasarkan 4 marka SSR disajikan pada Gambar 1 sampai dengan 4. Tabel 1. Persentase polimorfik No. Nama Primer Ukuran Pita Pita % Pita Pita (bp) Polimorfik Monomorfik Polimorfik 1. FR 0783 272-351 4 4 0 100% 2. FR 0779 243-320 2 0 2 0% 3. FR 3663 242 1 0 1 0% 4. FR 3745 264-317 2 2 0 100% Total 9 6 3 200% Rata-Rata 2,25 1,5 0,75 50% 601
M 1 2 3 4 5 6 7 M 8 9 10 11 12 13 14 15 300 bp M 16 17 18 19 20 21 22 M 23 24 25 26 27 28 29 30 351 bp 300 bp Gambar 1. Elektroforegram amplifikasi 30 DNA klon kelapa sawit BTC 60 Socfindo dengan menggunakan primer FR 0783, Keterangan: M = Marker Ladder ; Angka yang tertera merupakan kode sampel M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 M 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Gambar 2. Elektroforegram amplifikasi 30 DNA klon kelapa sawit BTC 60 Socfindo dengan menggunakan primer FR 0779. Keterangan: M = Marker Ladder ; Angka yang tertera merupakan kode sampel 602
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 800 bp 300 bp M 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Gambar 3. Elektroforegram amplifikasi 30 DNA klon kelapa sawit BTC 60 Socfindo dengan menggunakan primer FR 3663. Keterangan: M = Marker Ladder ; Angka yang tertera merupakan kode sampel M 12 28 19 171815 1127 1 22 7 16 8 2 21 13 4 24 5 14 6 3 M 10 29 20 30 26 23 25 9 1500bp 1000bp 500bp 1500bp 500bp 317 bp 200bp A Gambar 4. Elektroforegram amplifikasi 30 DNA klon kelapa sawit BTC 60 Socfindo dengan menggunakan primer FR 3745. Keterangan: M = Marker Ladder ; A : tidak teramplifikasi; Angka yang tertera merupakan kode sampel 603
Analisis Radial Neighbour-Joining Tree (NJtree) menunjukkan titik asal sebaran klon berdasarkan empat marka SSR yang telah diuji pada penelitian ini. Hasil analisis Radial Neighbour-Joining Tree (NJtree) dapat dilihat pada Gambar 5. 29 Gambar 5. 0 0.1 28 16 12 24 26 12 27 67 34 5 11 25 22 23 20 19 30 15 13 14 8 9 21 17 Profil Radial Neighbour-Joining Tree (NJtree) dari 30 DNA klon kelapa sawit BTC 60 Socfindo yang dianalisis berdasarkan 10 66 18 matrix dissimilarity simple matching dengan menggunakan marka SSR. Hasil amplifikasi dengan menggunakan 4 primer SSR dapat diketahui sebanyak 3 primer yaitu FR 0783, FR 0779, FR 3663 dapat mengamplifikasi 30 aksesi tanaman kelapa sawit. Namun, terdapat 1 primer yaitu FR 3745 yang tidak dapat mengamplifikasi DNA pada 30 aksesi yaitu aksesi nomor 10 (Gambar 4). Hal ini sesuai dengan pernyataan Zulfahmi (2013) yang menyatakan bahwa perbedaan pola pita pada masing-masing primer akan dapat memberikan informasi terkait dengan keragaman genetik klon tanaman yang diuji. Pada Tabel 1 dapat terlihat bahwa pola pita yang dihasilkan oleh 4 primer yang digunakan menghasilkan pola pita yang bervariasi. Ukuran pita-pita yang dihasilkan bervariasi antara 242 351 bp. Total pola pita dari keempat primer sebanyak 9 dengan rata-rata 2,25 pita per primer. Pita polimorfik yang dihasilkan sebanyak 6 pita dan total pita monomorfik sebanyak 3 pita. Persentase pita polimorfik bervariasi antara 0% sampai 100% dengan rata-rata 50% untuk semua primer. Persentase polimorfis sebesar 100% yaitu pada primer FR 0783 dan FR 3745. Jumlah pita tertinggi dan ukuran pasangan basa tertinggi yaitu 4 pita dengan ukuran sebesar 351 bp terdapat pada primer FR 0783 sedangkan jumlah pola pita terendah dan ukuran pasang basa terendah terdapat pada primer FR 3663 yaitu sebanyak 1 pita dengan ukuran 242 bp. Putri (2010) menyatakan bahwa keunggulan dari marka DNA yaitu dapat menunjukkan polimorfisme pita DNA dalam jumlah banyak, konsistensi, dan tidak dipengaruhi lingkungan yang mampu menetapkan variabilitas genetik populasi. 604
Berdasarkan hasil penelitian ini dapat diketahui bahwa individu 18 memiliki perbedaan alel dengan 29 sampel lainnya yang teridentifikasi oleh primer FR 3745 dengan ukuran alel yang berbeda tersebut adalah 317 bp (Gambar 4). Keberadaan alel yang berbeda juga ditunjukkan oleh sampel 29 pada primer FR 0783 dengan ukuran alel sebesar 351 bp dan 300 bp (Gambar 1). Hal ini membuktikan bahwa individu nomor 18 tersebut memiliki perbedaan genetik dengan sampel lainnya sehingga primer FR 3745 dan FR 0783 dapat mendeteksi keragaman alel. Hal ini sesuai dengan pernyataan Sayekti et al (2015) yang menyatakan bahwa primer SSR dapat mendeteksi keragaman alel pada level yang tinggi dan variatif yang dapat digunakan untuk menganalisis perbedaan genetik individu. Hasil penelitian selanjutnya menunjukkan bahwa primer FR 0783, FR 0779, dan FR 3745 (Gambar 1, 2 dan 4) bersifat heterozigot. Primer heterozigot merupakan primer yang mampu menunjukkan alel yang berasal dari tetuanya, alel seperti ini juga dikatakan dengan alel kodominan. Hal ini membuktikkan bahwa SSR mampu mengidentifikasi keberadaan alel kodominan. Hal ini sesuai dengan pernyataan Arumsari (2013) yang menyatakan bahwa SSR bersifat kodominan, dan memiliki tingkat polimorfisme yang tinggi. Berdasarkan hasil penelitian dapat diketahui bahwa primer yang bersifat homozigot teridentifikasi di primer FR 3663 dengan ukuran 242 bp (Gambar 3) dan teramplifikasi pada seluruh sampel tanaman yang diuji. Primer homozigot merupakan primer yang dapat dijadikan sebagai marker pada klon BTC 60 sehingga dapat mengidentifikasi klon tersebut. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Mulsanti (2013) yang menyimpulkan bahwa primer homozigot dapat dijadikan sebagai penanda untuk membedakan suatu varietas dengan varietas lainnya. Berdasarkan Gambar 5. dapat diketahui bahwa dari 30 sampel klon yang telah diuji ada 27 sampel yang mengumpul pada satu titik, hal ini menunjukkan bahwa sampel yang digunakan berasal dari klon yang sama, dan ada 3 klon (10, 18 dan 29) yang kemungkinan berasal dari tetua klon yang berbeda. Analisis jarak genetik menunjukkan bahwa terjauh adalah jarak genetik antara sampel 29 dengan sampel 10 yaitu sebesar 0.500, jarak genetik antara sampel 29 dan sampel 18 adalah sebesar 0.374 serta jarak genetik antara sampel 18 dan sampel 10 adalah sebebsar 0.250. SIMPULAN Primer SSR menghasilkan 9 pola pita DNA, ukuran pita DNA bervariasi dan persentasi pita yang polimorfik juga bervariasi antara 0% dan 100% dimana FR 0779 pada 320 bp dan 243 bp serta FR 3663 pada 242 bp sedangkan primer polimorfis ditunjukkan oleh FR 0783 pada 335 bp, 272 bp, 351 bp dan 300 bp serta FR 3745 pada 317 bp dan 264 bp. Primer FR 3745 dapat menunjukkan perbedaan pola pita DNA pada sampel 18 serta primer FR 0783 yaitu pada sampel 29. UCAPAN TERIMA KASIH Penulis mengucapkan terima kasih kepada Direktorat Riset dan Pengabdian Masyarakat, Direktorat Jenderal Penguatan Riset dan Pengembangan Kementerian Riset Teknologi dan Pendidikan Tinggi sesuai dengan Surat Perjanjian Penugasan Pelaksanaan Program Penelitian Nomor : 017/SP2H/LT/DRPM/II/2016 atas bantuan biaya penelitian Hibah PUPT pada tahun 2016 dan penulis juga mengucapkan terima 605
kasih kepada PT. Socfin Indonesia atas bantuan teknisnya dan pengujian di laboratorium. DAFTAR PUSTAKA Afifah, E.N. 2012. Penggunaan penanda molekuler untuk mempercepat dan mempermudah perbaikan kualitas tanaman the. Jurnal Budidaya Pertanian UGM. 1-19. Arumsari, S. 2013. Analisis diversitas genetik aksesi kelapa sawit kamerun berdasarkan marka SSR. Jurnal Litri, 19 (4): 194-202. Direktorat Jendral Perkebunan. 2016. Statistik perkebunan Indonesia komoditas kelapa sawit 2014-2016. Jurnal Direktorat Jendral Perkebunan Kementrian Pertanian. 1 : 1-69. GAPKI. 2016. Indonesia dan perkebunan kelapa sawit dalam isu lingkungan global. Gabungan Pengusaha Kelapa Sawit Indonesia. Jurnal GAPKI. 1: 1-56. Kiswanto, J.H., Purwanta. dan Wijayanto, B. 2008. Teknologi budidaya kelapa sawit. Balai Besar Pengkajian dan Pengembangan Teknologi Pertanian, Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian, http://cybex.deptan.go.id [10 Februari 2016]. Mariska, I., Hutami, S., Sukmadjaja, D., Kosmiatin, M., Rahayu, S. dan Utami, S. 2013. Inovasi kultur jaringan tanaman kelapa sawit. Jurnal Agroinovasi Badan Litbang Pertanian. 2-16. Mulsanti, I.W., Memen, S., Wahyuni, S. dan Dwinita, W.U. 2013. Identifikasi galur tetua padi hibrida dengan marka SSR spesifik dan pemanfatannya dalam uji kemurniaan benih. Jurnal Balai Besar Penelitian Padi. 1: 1-8. Perreira and Jacquemoud-Collet. 2014. Software DARwin (Dissimiliarity Analysis Representation for Windows). Diakses dari: http://darwin.cirad.fr Last update 2016/3/12. Putri, L.A.P. 2010. Pendugaan parameter genetik dan karakterisasi molekuler keragaman genetika dengan marka mikrosatelit (SSR) pada kelapa sawit. [Disertasi]. Bogor: Institut Pertanian Bogor, Program Pascasarjana. Sayekti, U., Widyastuti, U. dan Mathius, N.T. 2015. Keragaman genetik kelapa sawit (Elaeis gueenensis Jacq.) asal Angola menggunakan marka SSR. Jurnal Agron Indonesia. 43(2) : 140-146. Tasma, I.M., Warsun, A., Satyawan, D., Syafaruddin. dan Martono, B. 2013. Analisis kekerabatan kelapa sawit (Elaeis gueenensis Jacq.) asal Kamerun berdasarkan marka mikrosatelit. Jurnal Litri. 19(4): 194-202. Zidenga, T. 2004. DNA-bqsecl methods in sorghum diversity studies and improvement.www.isb.\t.edu. (serial online). Diakses tanggal 3 Februari 2016. Zulfahmi. 2013. Penanda DNA untuk analisis genetik tanaman. Jurnal Agroekotknlogi UIN. 3(2): 41-52. 606