MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Nutrisi Ternak Perah, Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Pengujian kadar eugenol dilakukan di Laboratorium Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik, Bogor. Pengujian proporsi molar VFA dilakukan di Pusat Penelitian dan Pengembangan Ternak, Kementrian Pertanian, Bogor. Penelitian dilakukan pada bulan Februari Agustus 2011. Materi Bahan Bahan yang digunakan untuk pembuatan sampel ransum perlakuan adalah rumput gajah kering, konsentrat, tepung ampas teh, tepung daun kembang sepatu, dan minyak daun cengkeh. Bahan-bahan yang digunakan di dalam analisis Laboratorium adalah Larutan McDougal sebagai saliva buatan, larutan pepsin, larutan Na 2 CO 3, asam borat, H 2 SO 4 pekat, HgCl 2, larutan media gas test (larutan mineral makro dan mikro, larutan buffer rumen, resazurin, dan larutan pereduksi). Rumput gajah diperoleh dari Laboratorium Agrostologi Kandang B, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Bahan konsentrat terdiri dari 34,25% pollard; 23,33% bungkil kelapa; 25,07% onggok; 5,26% tetes; 0,64% bungkil kedelai; 3,24% CaCO3, 1,31% Urea, 0,66% Premix. Ampas teh diperoleh dari PT. Sosro, Bekasi. Daun kembang sepatu diperoleh dari PUSPITEK Serpong, Tanggerang. Cairan rumen diperoleh dari Rumah Potong Hewan Bubulak, Bogor. Alat Peralatan yang digunakan untuk preparasi bahan berupa pengeringan dan pembuatan tepung adalah terpal, mesin giling diskmill (Merek Yasuka) tipe FFC-15 dengan ukuran screen 1 mm dan speed 3000 rpm. Proses pencampuran bahan konsentrat dilakukan secara manual dengan tidak menggunakan mesin mixer berdasarkan formulasi yang telah dibuat. Pada proses penimbangan bahan, timbangan yang digunakan adalah timbangan analitik dengan ketelitian empat desimal (Merek Adam). Pada pengujian laboratorium dengan metode in vitro digunakan peralatan sebagai berikut : termos, kain penyaring, corong, tabung 17
Erlenmeyer, pipet volumetrik, bulp, kertas ph, ph meter, tabung fermentor dan tutup karet, tabung reaksi, syringe Hohenheim 100 ml, tabung gas CO 2, penjepit, shaker waterbath, waterbath, cawan porselen, kertas saring whatman No.41, eksikator, sudip, alumunium foil, cawan Conway, pompa vacuum, magnetic stirrer, buret, vortex, kondensor, sentrifuge, oven 105 o C, tanur (oven 600 o C). Prosedur Penelitian ini merupakan penelitian lanjutan yang telah menghasilkan kombinasi terbaik antara ampas teh (Camelia sinensis) dan daun kembang sepatu (Hibiscus rosasinensis). Kombinasi ampas teh dengan level 2 mg/ml dan daun kembang sepatu 0,3 mg/ml dapat meningkatkan produksi total VFA, menurunkan protozoa, populasi bakteri proteolitik dan selulolitik serta menurunkan produksi metan Hidayah et al. dan Utami et al. (data belum dipublikasi). Pada penelitian lanjutan ini dilakukan percobaan in vitro dengan menambahkan minyak cengkeh pada kombinasi ampas teh dan daun kembang sepatu tersebut. Preparasi Bahan Penelitian Rumput gajah, ampas teh dan daun kembang sepatu dibersihkan, dikeringkan selama 5-6 jam dibawah sinar matahari. Daun dan ampas yang sudah kering digiling dengan menggunakan mesin penggiling diskmill. Minyak cengkeh diperoleh dari agen penjual minyak cengkeh dengan kadar eugenol 55,14 %. Daun cengkeh berasal dari perkebunan cengkeh daerah Banten. Penyulingan dilakukan dengan pemanasan uap dalam peralatan stainless steel. Prosedur Pengujian Fermentasi in vitro Pengambilan Cairan Rumen. Termos yang dipakai untuk tempat cairan rumen diisi dengan air panas sehingga suhunya mencapai 39 o C kemudian ditutup. Cairan rumen diambil dari sapi yang di potong di Rumah Potong Hewan (RPH) Bubulak. Cairan rumen yang diperoleh kemudian disaring dengan menggunakan kain kasa dan dimasukkan kedalam termos. Sebelum digunakan, air panas (39 o C) yang ada di dalam termos dibuang terlebih dahulu dan segera ditutup. Hal ini dilakukan bertujuan menjaga agar cairan rumen tetap dalam kondisi anaerob dan memiliki suhu sama 18
dengan kondisi rumen sebenarnya, termos harus segera ditutup rapat dan dialiri gas CO 2 sebelum digunakan. Pembuatan Larutan McDougal (Saliva Buatan). Untuk membuat larutan 6 liter, sebanyak 5 liter air destilasi dimasukkan ke dalam labu takar yang bervolume 6 liter kemudian dimasukkan bahan-bahan sebagai berikut NaHCO 3 (58,8 gram), Na 2 HPO 4.7H 2 O (42 gram), KCL (3,42 gram), NaCl (2,82 gram), MgSO 4.7H 2 O (0,72 gram) dan CaCl 2 (0,24 gram). Semua bahan tersebut dilarutkan kecuali CaCl 2, setelah semua bahan larut ditambahkan CaCl 2. Kemudian leher labu di cuci dengan air destilasi hingga permukaan air mencapai tanda tera. Campuran lalu dikocok agar homogen dan dialiri dengan gas CO 2 secara perlahan-lahan. Fermentasi Pakan. Tabung fermentor yang telah diisi dengan 0,5 gram sampel ransum perlakuan ditambahkan 10 ml cairan rumen dan 40 ml larutan McDougal. Bahan sampel terdiri dari padatan tepung dan cairan minyak. Bahan berupa tepung dengan konsentrasi paling sedikit diaduk bersama dengan minyak kemudian ditambah dengan bahan tepung dengan konsentrasi yang lebih besar. Tabung fermentor dikocok dengan cara mengaliri gas CO 2 selama 30 detik (ph 6,5-6,9) dan ditutup dengan karet berventilasi. Tabung dimasukkan kedalam shaker water bath dengan suhu 39 o C, dilakuan fermentasi selama 4 jam untuk sampel VFA/NH 3 dan fermentasi 48 jam untuk sampel KCBK/KCBO. Untuk menghentikan fermentasi tutup karet berventilasi dibuka dan ditetesi 2 tetes HgCl 2 untuk menghentikan aktivitas mikroba. Prosedur Pengukuran KCBK dan KCBO (Tilley & Terry, 1963) Pembuatan Larutan Pepsin. Sebanyak 2,8 gram pepsin (1:7000) dilarutkan dalam 850 ml air bebas ion, kemudian ditambahkan 17,8 ml HCL pekat dan campuran dimasukkan ke dalam labu takar. Air ditambahkan hingga permukaan mencapai tanda tera. Pengukuran KCBK dan KCBO. Sampel dalam tabung fermentor yang sudah diinkubasi 48 jam dan ditetesi HgCl 2 disentrifuge dengan kecepatan 2500 rpm selama 20 menit. Supernatan dan endapan dipisahkan, kemudian endapan yang 19
terbentuk ditambah 50 ml larutan pepsin-hcl 0,2%. Campuran tersebut diinkubasi selama 48 jam tanpa tutup karet. Setelah 48 jam campuran endapan-pepsin disaring menggunakan kertas saring whatman No.41 dengan bantuan pompa vacuum. Hasil saringan (residu) dimasukkan kedalam cawan porselen yang sebelumnya sudah diketahui bobot kosongnya. Bahan kering diperoleh dengan cara mengeringkan sampel dalam oven 105 0 C selama 24 jam. Selanjutnya bahan dalam cawan dipijarkan atau diabukan dalam tanur listrik selama 6 jam pada suhu 450-600 0 C. Sebagai blanko digunakan residu asal fermentasi tanpa sampel ransum perlakuan. Koefisien Cerna Bahan Kering (KCBK) dan Koefisien Cerna Bahan Organik (KCBO) diitung dengan rumus : %KCBK = BKsampel(g)-(BKresidu(g)-BKblanko(g) BKsampel x 100% %KCBO = BOsampel(g)-BOresidu(g)-BOblanko(g) BOsampel x 100% Prosedur Pengukuran Konsentrasi NH 3 (General Laboratory Procedures, 1966) Pengukuran produksi NH 3 menggunakan metode Mikrodifusi Conway (General Laboratory Procedures, 1966). Sebelum digunakan bibir cawan Conway diolesi dengan vaselin. Supernatan yang dihasilkan dari proses fermentasi dengan inkubasi 4 jam diambil 1 ml, kemudian ditempatkan pada salah satu ujung alur cawan Conway, pada ujung satunya dimasukkan 1 ml Na 2 CO 3 jenuh. Antara supernatan dan Na 2 CO 3 tidak boleh bercampur. Larutan asam borat berindikator sebanyak 1 ml ditempatkan dalam cawan kecil yang terletak ditengah cawan Conway, kemudian cawan Conway langsung ditutup rapat hingga kedap udara. Setelah itu cawan Conway digoyang-goyangkan hingga supernatan dan NaCO 3 tercampur rata, kemudian dibiarkan dalam suhu ruang selama 24 jam. Setelah 24 jam asam borat berindikator dititrasi dengan H 2 SO 4 0,005 N sampai terjadi perubahan warna dari merah menjadi biru. Produksi NH 3 dihitung dengan rumus : NH 3 (mm) = ml H 2 SO 4 x NH 2 SO 4 x 1000 g sampel x BKsampel 20
Prosedur Pengukuran Konsentrasi VFA Total dan Parsial Volatile Fatty Acid (VFA) merupakan hasil fermentasi kabohidrat atau protein oleh mikroba dalam rumen. VFA terdiri dari asam asetat, propionat, butirat, iso butirat, valerat, dan iso valeratdengan menggunakan alat Gas Cromatography (GC). Sampel VFA parsial yang digunakan berasal dari proses fermentasi dengan inkubasi 4 jam yang diambil sebanyak 1,5 ml ke dalam tabung eppendof dan memiliki ph 3 (ditambahkan 1 tetes H 2 SO 4 pekat) dengan tujuan untuk menstabilkan sampel. Selanjutnya dilakukan proses proteinase dengan cara menambahkan 30 mg asam sulfosalisinat pada setiap sampel kemudian disentrifuge selama 10 menit pada 1200 rpm pada suhu 7 o C. Selanjutnya sampel diinjeksikan sebanyak 0,6 µl. Pengujian proporsi molar VFA menggunakan metode Gas Cromatography (GC). Pengujian dilakukan di Pusat Penelitian dan Pengembangan Ternak, Kementrian Pertanian, Bogor. Kandungan VFA total sampel dapat diketahui dengan cara menjumlahkan data VFA parsial yang telah diperoleh, sedangkan kandungan VFA parsial diperoleh dengan menghitung data dengan menggunakan rumus berikut. mmol sampel : area contoh X 1000 area standar X bobot molekul Bobot molekul terdiri dari bobot molekul asetat, propionat, butirat, iso-butirat, valerat, dan iso-valerat. Prosedur Pengukuran Gas Test (Close & Menke, 1986) Pembuatan Larutan Media. Untuk pembuatan larutan media diperlukan : 0,1 ml larutan mineral mikro (13,2 gr CaCl 2 2H 2 O + 10 gr MnCl 2 4H 2 O + 1,0 gr CoCl 2 6H 2 O + 8,0 gr FeCl 3 6H 2 O + aquades hingga volumenya 100 ml). 200 ml larutan buffer rumen (4,0 gr NH 4 HCO 3 + 35,0 gr NaHCO 3 + aquades hingga volumenya 1000 ml). 200 ml larutan makro (5,7 gr Na 2 HPO 4 anhydrous + 6,2 g KHPO 4 anhydrous + 0,6 g MgSO 4.7H 2 O, dan ditambah dengan aquadest hingga mencapai volume 1000 ml). 1,0 ml larutan resazurin 0,1% (w/v). 21
40 ml larutan pereduksi (4,0 ml NaOH 1 N + 625 mg Na 2 S.9H 2 ) ditambah 95 ml aquades. Larutan tersebut dicampur menjelang akan digunakan dan dijaga pada temperatur 39 o C. Persiapan Sampel Gas Test. Piston syringe diberi vaselin, kemudian 230 mg pakan blok perlakuan yang sudah dihaluskan dimasukkan ke dalam syringe dan piston kemudian dipasang. Larutan media yang sudah diaduk dan dialiri gas CO 2 ditempatkan dalam waterbath 39 o C. Selanjutnya, cairan rumen sebagai sumber inokulum diambil dan disaring. Satu bagian cairan rumen dicampur dengan 2 bagian media dan diaduk dengan magnetic stirer lalu disimpan dalam waterbath dan dialiri gas CO 2. Sebanyak 30 ml campuran cairan rumen dan media dimasukkan kemasingmasing syring menggunakan spuit. Udara yang ada didalam syring dikeluarkan dan klep syringe ditutup. Posisi piston pada waktu sebelum inkubasi dicatat (Gb 0 ). Piston diinkubasi dalam waterbath selama 48 jam dan pencatatan posisi piston dilakukan pada jam ke 2, 4, 6, 8, 12, 24, dan 48. Total produksi gas (misalnya pada jam ke-24) diukur dengan rumus : Gb (ml/200 mg BK, 24 jam) = ((Gb24-Gb0) - (Gb24 blanko-gb0 blanko)*200*((fh+fc)/2)/bk bahan) Asumsi nilai FH = 1 dan FC = 1 Rancangan Percobaan dan Analisis Data Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan 4 perlakuan dengan 5 ulangan. Model matematika yang digunakan dalam analisa adalah (Steel & Torrie, 1993) : Y ij = µ + β i + τ j + ε ij Keterangan : Y ij : nilai pengamatan perlakuan ke-i, blok ke-j µ : rataan umum β i : efek perlakuan ke-i τ j : efek blok ke-j ε ij : galat perlakuan ke-i dan blok ke-j 22
Perlakuan Perlakuan yang digunakan antara lain : A1 A2 A3 A4 : Hijauan : Konsentrat (Kontrol) : Kontrol + 2 mg/ml Ampas Teh (AT) + 0,3 mg/ml Daun Kembang Sepatu (DKS) (Suplemen I) : Kontrol + Suplemen I + 0,02 mg/ml Minyak Cengkeh (MC) : Kontrol + Suplemen I + 0,04 mg/ml Minyak Cengkeh (MC) Peubah yang Diamati Peubah yang diamati adalah sebagai berikut : 1. Kecernaan Bahan kering (KCBK) 2. Kecernaan Bahan Organik (KCBO) 3. VFA total dan proporsi VFA parsial 4. Konsentrasi ammonia (NH 3 ) 5. Produksi Gas Total Analisis Data Data yang diperoleh dianalisa dengan menggunakan analysis of variance (ANOVA) yang dilakukan dengan software SPSS versi 16.0. Apabila terdapat perbedaan yang nyata antar perlakuan dilanjutkan dengan uji jarak Duncan (Steel dan Torrie, 1993). 23