8 III. BAHAN DAN METODE 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Ilmu Penyakit Tumbuhan, Bidang Proteksi Tanaman, Jurusan Agroteknologi, Fakultas Pertanian Universitas Lampung dari April Agustus 2014. 3.2 Bahan dan Alat Bahan yang digunakan antara lain; media PDA (Potato dextrose agar), media PDB (Potato dextrose broth), biakan patogen S. rolfsii, isolat Trichoderma sp., NaOCl, alkohol, asam laktat, dan lain-lain. Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain shaker, rotamixer, cawan petri dengan diameter 9 cm, cork borer, alumunium foil, plastik wrap, plastik tahan panas, tabung erlenmeyer, dan lainlain. 3.3 Metode Penelitian Rancangan percobaan yang digunakan dalam sub penelitian uji antagonisme metode kultur ganda dan uji filtrat adalah rancangan acak lengkap dan data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan sidik ragam dan perbedaan nilai tengah antar perlakuan akan diuji dengan uji BNT pada α 0,05.
9 3.4 Pelaksanaan Penelitian 3.4.1 Isolasi dan perbanyakan S. rolfsii Jamur S. rolfsii diisolasi dari bagian tanaman kedelai yang terserang S. rolfsii. Bagian tanaman yang sakit dipotong dengan ukuran 0,5 cm. Potongan tersebut lalu direndam dalam akuades lalu direndam lagi dalam larutan NaOCl (klorok) selama 30 detik. Setelah direndam, potongan tersebut dibilas kembali dalam akuades dan ditiriskan diatas tisu. Setelah ditiriskan, potongan tersebut diletakkan di atas permukaan media PDA dalam cawan petri. 3.4.2 Peremajaan dan pembuatan filtrat Trichoderma sp. Sebanyak 4 isolat Trichoderma sp. yaitu T. koningii, T. koningii, T. harzianum, dan Trichoderma sp. yang digunakan dalam percobaan ini didapatkan dari koleksi di Laboratorium Penyakit Tanaman Bidang Proteksi Tanaman Jurusan Agroteknologi Universitas Lampung yang diperoleh dari hasil isolasi tanah rizosfer tanaman cabai. Keempat isolat Trichoderma sp. yang digunakan berasal dari pengelompokkan 11 isolat yang dibedakan dari warna dan pola koloni jamur. Biakan Trichoderma sp. terlebih dahulu diremajakan pada media PDA sebelum digunakan dalam pengujian. Peremajaan dilakukan dengan cara meletakkan potongan berbentuk cakram Trichoderma berukuran 4 mm ke dalam media PDA baru dan kemudian diinkubasi selama 7 hari. Setelah tumbuh, Trichoderma sp. diperbanyak pada media PDA baru dan selanjutnya digunakan untuk pengujian.
10 Untuk mendapatkan filtrat Trichoderma, jamur ini terlebih dahulu dibiakkan pada media cair potato dextrose broth (PDB). Komposisi media cair yang digunakan sama dengan komposisi media PDA, tetapi tanpa menggunakan agar. Sebanyak 5 potongan cakram Trichoderma sp. dimasukkan dalam 500 ml media cair yang sudah disiapkan dalam tabung Erlenmeyer, kemudian diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang dengan pencahayaan matahari. Setelah 7 hari, media cair tesebut disaring untuk memisahkan struktur jamur dengan cairannya. Filtrat tersebut selanjutnya digunakan dalam pengujian. 3.4.3 Pengujian antagonisme dengan metode kultur ganda Pengujian dengan metode kultur ganda dilakukan untuk mengetahui kemampuan Trichoderma sp. dalam kemampuan parasitisme, persaingan ruang dan nutrisi, serta antibiosis dan lisis. Biakan Trichoderma sp. yang telah diinkubasi selama 4 hari kemudian dipindahkan ke dalam media PDA yang baru dengan menggunakan cork borer berdiameter 4 mm. Isolat patogen yang telah diinkubasi selama 4 hari kemudian dipindahkan ke media PDA yang sama dengan Trichoderma sp. Potongan cakram Trichoderma sp. diletakkan 3 cm dari tepi cawan, sedangkan potongan cakram isolat patogen diletakkan 3 cm dari tepi cawan pada bagian sisi depan cuplikan Trichoderma sp, kemudian diinkubasi. Peubah yang diamati adalah jari-jari pertumbuhan koloni patogen. Pengukuran jari-jari pertumbuhan koloni patogen dilakukan dengan cara mengukur jari-jari pertumbuhan koloni yang tumbuh ke arah biakan Trichoderma sp. sebagai data perlakuan dan ke arah tepi cawan sebagai data kontrol. Pengukuran jari-jari dilakukan setiap hari sampai pertumbuhan koloni pada kontrol mencapai tepi
11 cawan. Setelah data jari-jari didapatkan kemudian dihitung persentase penghambatan Trichoderma sp. terhadap pertumbuhan koloni patogen dengan rumus (Nduagu et al., 2008) : K 0 K 1 P = x 100% K 0 P adalah persentase penghambatan, K 0 = jari-jari koloni patogen ke arah tepi cawan petri (kontrol), dan K 1 = jari-jari koloni patogen ke arah biakan Trichoderma sp. Untuk mengetahui ada tidaknya lisis dan antibiosis dilakukan pengamatan pada titik pertemuan patogen dan Trichoderma sp. yang ditunjukkan adanya batas yang jelas antara koloni patogen dan Trichoderma sp. atau adanya warna kuning atau coklat yang dilihat dari bagian bawah cawan. Berikut ini merupakan tata letak uji antagonisme metode kultur ganda. K0 3 cm P K1 T 3 cm 3 cm Gambar 1. Tata letak jamur Trichoderma sp. dan S. rolfsii pada uji antagonisme dalam cawan petri.(p = biakan S. rolfsii, T = biakan Trichoderma sp.).
12 3.4.4 Pengujian filtrat Trichoderma sp. terhadap pertumbuhan S. rolfsii. Pada pengujian ini, media yang digunakan adalah campuran filtrat Trichoderma dan media PDA dengan perbandingan 1:1. Sebanyak 25 ml filtrat Trichoderma dicampur dengan 25 ml media PDA yang belum jadi, lalu diotoklaf pada suhu 121 o C selama 10 menit. Untuk perlakuan kontrol, media yang digunakan hanya media PDA tanpa filtrat Trichoderma. Setelah selesai diotoklaf dan cukup dingin, media uji tersebut dituang dalam cawan petri dan dibiarkan membeku. Setelah beku, sebanyak 1 sklerotia S. rolfsii diletakkan tepat ditengah cawan lalu diinkubasi pada suhu ruang dengan pencahayaan matahari. Perlakuan pada percobaan ini adalah filtrat dari 4 isolat Trichoderma sp. ditambah dengan 1 perlakuan kontrol. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 5 kali. Peubah yang diamati adalah pertumbuhan koloni jamur S. rolfsii. Pengamatan dilakukan setiap hari dengan mengukur pertumbuhan koloni S.rolfsii. Pengukuran dihentikan apabila pada perlakuan kontrol pertumbuhan koloni S.rolfsii telah mencapai tepi cawan petri. 3.4.5 Pengujian filtrat Trichoderma sp. terhadap perkecambahan sklerotia S. rolfsii. Pada pengujian ini, sklerotia dari S. rolfsii terlebih dahulu direndam dalam filtrat Trichoderma terbaik. Perendaman dalam filtrat dilakukan selama 10 menit, selanjutkan ditiriskan pada kertas tisu lalu diinokulasikan pada media PDA dan inkubasi pada suhu ruang dengan pencahayaan matahari.. Media PDA yang
13 digunakan adalah media PDA tanpa dicampur filtrat Trichoderma. Untuk perlakuan kontrol, sklerotia dari S. rolfsii direndam dalam aquades steril. Setiap perlakuan terdiri atas 5 cawan Petri dan setiap cawan petri terdiri atas 10 sklerotia. Pengamatan dilakukan setiap hari dengan menghitung jumlah sklerotia yang brkecambah dan tidak berkecambah. Selain itu juga diamati perkembangan koloni Sclerotium yang terbentuk.