Sterilisasi Alat dan Bahan untuk Pengujian Kesehatan Benih Steril adalah kondisi bebas dari semua mikroorganisme termasuk spora. Sterilisasi adalah proses penghancuran semua mikroorganisme termasuk spora melalui cara fisika atau kimia. Sterilan adalah zat yang mempunyai karakteristik dapat mensterilkan. Kegiatan sterilisasi alat dan bahan merupakan kegiatan rutin yang dilakukan laboratorium kesehatan bakteri dan cendawan Balai Besar PPMB-TPH. Sterilisasi alat dan bahan merupakan salah satu kegiatan yang dilakukan sebelum melaksanakan pengujian kesehatan bakteri dan cendawan. Dalam pengujian kesehatan benih terutama untuk bakteri dan cendawan dibutuhkan alat-alat yang mempunyai spesifikasi khusus. Alat dan bahan pengujian yang digunakan harus sudah steril dengan melalui proses sterilisasi. Untuk sterilisasi alat dan bahan ada 4 metode yang sering digunakan yaitu (1) Sterilisasi kering yaitu sterilisasi dengan menggunakan panas. Prinsipnya adalah protein mikroba pertama-tama akan mengalami dehidrasi sampai kering dan selanjutnya teroksidasi oleh oksigen dari udara sehingga menyebabkan mikrobanya mati. Digunakan pada benda/bahan yang tidak mudah menjadi rusak, tidak menyala, tidak hangus atau tidak menguap pada suhu tinggi. Metode ini efektif untuk mensterilkan alat-alat gelas. Contohnya cawan petri. Selain itu bahan/alat harus dibungkus, disumbat atau ditaruh dalam wadah tertutup untuk mencegah kontaminasi setelah dikeluarkan dari oven yang merupakan alat yang digunakan untuk sterilisasi kering. Cara sterilisasinya dengan membungkus bahan yang akan disterilisasi dengan menggunakan kertas, dan memasukkan kedalam oven yang sudah menyala. Setelah tercapai suhunya, diatur waktu lamanya sterilisasi. Waktu yang dibutuhkan untuk sterilisasi adalah 1 jam dengan suhu 170 0 C, 2 jam dengan suhu 160 0 C, dan 3 jam dengan suhu 150 0 C. Gambar 1. Oven digunakan untuk sterilisasi kering
(2) Sterilisasi basah yaitu sterilisasi dengan menggunakan panas dan uap air. Alat yang digunakan autoclave. Prinsipnya adalah dengan cara mengkoagulasi atau denaturasi protein penyusun tubuh mikroba sehingga dapat membunuh mikroba. Sterilisasi uap dilakukan menggunakan autoclave dengan prinsipnya memakai uap air dalam tekanan sebagai pensterilnya. Temperatur sterilisasi biasanya 121, tekanan yang biasa digunakan antara 15-17,5 psi (pound per square inci) atau 1 atm. Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan jenis. Alat-alat disterilkan selama 20 menit, dan untuk media selama 15 menit. Sterilisasi media yang terlalu lama akan menyebabkan : 1. Penguraian gula. 2. Degradasi vitamin dan asam-asam amino. 3. Inaktifasi sitokinin zeatin riboside. 4. Perubahan ph yang berakibatkan depolimerisasi agar. Bila ada kelembaban (uap air) bakteri akan terkoagulasi dan rusak pada temperatur yang lebih rendah dibandingkan jika tidak ada kelembaban. Mekanisme penghancuran bakteri oleh uap air panas adalah terjadinya denaturasi dan koagulasi beberapa protein esensial dari organisme tersebut. Autoclave adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat & bahan yang menggunakan tekanan 15 psi (1,02 atm) dan suhu 121 0 C. Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan yang lebih besar untuk membunuh sel dibanding dengan udara panas. Biasanya untuk mesterilkan media digunakan suhu 121 0 C dan tekanan 15 lb/in2 (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit. Alasan digunakan suhu 121 0 C atau 249,8 0 F adalah karena air mendidih pada suhu tersebut jika digunakan tekanan 15 psi. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan laut (sea level) air mendidih pada suhu 100 0 C, sedangkan untuk autoclave yang diletakkan di ketinggian sama, menggunakan tekanan 15 psi maka air akan mendidih pada suhu 121 0 C. Semua bentuk kehidupan akan mati jika dididihkan pada suhu 121 0 C dan tekanan 15 psi selama 15 menit. Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoclave lama kelamaan akan mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoclave. Setelah semua udara dalam autoclave diganti dengan uap air, katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoclave naik. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai, maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi. Autoclave tidak boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi. Beberapa media atau bahan yang tidak disterilkan dengan autoclave adalah bahan tidak tahan panas seperti serum, vitamin, antibiotik, dan enzim. Pelarut organik seperti fenol, buffer dengan kandungan detergen. Autoclave digunakan untuk sterilisasi bahan-bahan pengujian dan alat-alat pengujian. Bahan/media yang akan disterilkan dimasukkan ke dalam erlemeyer. Untuk bahan seperti kertas setelah dibungkus menggunakan kertas, dibungkus lagi menggunakan plastik tahan panas. Erlenmeyer hanya boleh diisi media maksimum ¾ dari total volumenya, sisa ruang dibiarkan kosong.
Prosedur sterilisasi dimulai dengan mengecek kondisi air yang ada didalam autoclave sudah sesuai atau belum dan memastikan exhouse apakah sudah posisi tertutup atau belum. Mengecek air pembuangan agar tidak melebihi posisi hight. Setelah bahan-bahan atau alat dimasukkan tutup autoclave dan diatur dengan tekanan 121 0 C dan waktu yang dibutuhkan 15-20 menit. Ditunggu sampai proses sterilisasi selesai dan suhu turun sampai +/- 50 0 C. Tidak membuka autoclave selama suhu masih diatas 50 0 C. Gambar 2. Autoclave dengan bagian-bagiannya (3). Sterilisasi dengan cara pemijaran. Sterilisasi dengan cara pemijaran dilakukan dengan menggunakan panas api pijar dari lampu bunsen. Alat yang disterilisasi dengan menggunakan ini biasanya alat batang penabur, ose, gunting, scalpel. Caranya dengan membakar ose atau batang penabur diatas api lampu bunsen selama beberapa menit. Sebelum dibakar, dimasukkan dulu ke erlemeyer yang berisi alkohol 70%. Setelah dibakar didiamkan dulu beberapa menit sebelum digunakan.
Gambar 3. Sterilisasi dengan menggunakan pemijaran (4). Sterilisasi dengan menggunakan cahaya, sebagai contoh sterilisasi ruangan dengan menggunakan lampu UV. Pemakaian lampu UV dinyalakan 1 jam sebelum digunakan. Lampu dinyalakan selama +/- 15 menit. Untuk menghindari efek samping dari penggunaan lampu UV setelah selesai dimatikan, sebaiknya dipakai setelah minimal ½ jam dimatikan. Gambar 4. Lampu UV untuk sterilisasi ruangan
(5). Sterilisasi dengan menggunakan bahan kimia Alkohol dan NaOCl merupakan bahan kimia yang biasa dilakukan di laboratorium kesehatan. Alkohol digunakan untuk sterilisasi alat dan tangan saat mau melaksanakan pengujian. NaOCl digunakan untuk sterilisasi permukaan benih sebelum dilakukan pengujian kesehatan benih. NaOCl yang digunakan biasanya berkadar 1%. Sterilisasi permukaan benih dilakukan dengan cara merendam benih selama 1-2 menit didalam NaOCl 1% dan dibilas dengan menggunakan air steril. (6) Sterilisasi dengan penyaringan (filter). Sterilisasi ini dilakukan untuk bahan kimia yang tidak bisa kena panas tinggi, seperti antibiotik. Sehingga untuk mensterilkannya dengan menggunakan membran yang ukurannya sangat kecil. Cara penggunaanya larutan dimasukkan ke dalam alat suntik dan dikeluarkan secara bertahap dengan menekan bagian dari jarum suntik. Larutan akan keluar sedikit demi sedikit karena lubang membrannya sangat kecil. Gambar 5. Sterilisasi dengan menggunakan membran Penulis : Sri Rahayu Puji Lestari (PBT Madya, Balai Besar PPMB-TPH)