MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Genetika Molekuler, Bagian Pemuliaan dan Genetika Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini telah dilaksanakan pada September 2011 sampai dengan Februari 2012. Ternak Materi Sampel darah sapi lokal Indonesia yang digunakan sebanyak 283 sampel yang terdiri dari sampel sapi bali, sapi madura, sapi aceh, sapi pesisir, dan sapi katingan. Jumlah sampel dari masing-masing sapi lokal Indonesia yang digunakan dalam penelitian ini disajikan pada Tabel 2. Tabel 2. Jumlah Sampel Ternak Sapi Indonesia Ternak Sapi n Tahun Koleksi Asal Sapi Pesisir 50 2006 Kab. Pesisir Selatan Sapi Aceh 15 2010 Kab. Aceh Besar Sapi Bali 100 Sapi Katingan 50 2010 Balai Pembibitan Ternak Unggul Sapi Bali 2010 Daerah Aliran Sungai Katingan Sapi Madura 68 2011 Pulau Kangean Total 283 Keterangan: n = jumlah individu Alat dan Bahan Pengambilan sampel darah dilakukan menggunakan bahan dan alat antara lain alkohol, es, dan kapas, jarum vacutainer, tabung vacum 10 ml dan termos es. Bahan dan alat yang digunakan dalam proses amplifikasi DNA adalah sampel DNA yang telah diekstraksi dari darah sebelumnya, primer (forward dan reverse), taq polymerase, buffer, MgCl 2, dan dntp, Pipet mikro, tabung 0,5 ml dan 1,5 ml, serta mesin Applied Biosystem PCR thermalcycler.
Bahan dan alat yang digunakan pada tahap elektroforesis dan genotyping antara lain produk PCR, gel agarose 1,5%, loading dye, buffer, dan enzim restriksi (MspI), elektroforesis tray vertikal, inkubator, serta UV-Transilluminator. Prosedur Pengambilan Sampel Darah Sampel darah diambil dari sapi bali, sapi madura, sapi aceh, sapi katingan dan sapi pesisir melalui vena jugularis dan ditambahkan alkohol absolut selanjutnya dibawa ke Laboratorium Genetika Molekuler Ternak. Isolasi DNA Isolasi DNA dilakukan dari sampel darah dengan menggunakan Genomic DNA mini kit Geneaid (Lampiran 1) yang dimodifikasi untuk penggunaan sampel darah yang disimpan dalam alkohol. Amplifikasi Gen Calpastatin Sekuen primer yang digunakan berdasarkan Palmer et al. (1998), yaitu primer forward 5 TGGGGCCCAATGACGCCATCGATG 3 yang terletak di ekson 1C dan primer reverse 5 GGTGGAGCAGCAC TTCTGATCACC 3 yang terletak di ekson 1D (Gambar 3), dengan panjang produk PCR 624 pb. 1 3 tggggcccaa tgatgccatc gatgccttgt catccgactt cacctgcagt tcccctacag 61 ctgatgcaaa gaaaactgag aaagaggtat ggtttttaat gcccttaggg aagcttgtta 121 gaaactacct cccactttaa gacaacaact tttttttaaa cttcattttt cacttcactg 181 cgtcttcatt gctgtgttcg ggctttctct agttggggca agcgaggcct gttctctatt 241 tgcaattttt aggcttctgc agggggctcc tcttgttgct gggc cggggc tctaggtgca 301 caggcttcat ttgttgtggc tcgagggctc taaaccacag gctcattggt cttggcgcac 361 gggcatggtt accccaatgc atttgggatc tcccctggcc agggagcaaa cctgtttccc 421 ctgcattgca aggcggcctc ttaaccgctg gccaccaggg aagccccaaa atgccaaggc 481 tttttacttc tggttcttac cgtttggttc atatttttcc ttcatctgcc agtcaaacct 541 tcttctgtat tttattttcc agaaatctac agaagaggct ttaaaagctc agtcagctgg 601 ggtgatcaga agtgctgctc cacc 5 Keterangan: : Primer forward : Primer reverse Ccgghhhhhh : Situs pemotongan Gambar 3. Tempat Penempelan Primer dan Situs Pemotongan MspI. Nomor akses GenBank: AF117813. 12
Amplifikasi gen calpastatin dilakukan dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan mesin Applied Biosystem PCR thermalcycler. Amplifikasi gen calpastatin ini menggunakan campuran yang terdiri dari sampel DNA yang telah diekstraksi dari darah, primer (forward dan reverse), taq polymerase, buffer, MgCl 2, dan dntps. Proses amplifikasi terjadi dalam empat tahap di dalam mesin Applied Biosystem PCR thermalcycler. Kondisi PCR yang digunakan berdasarkan Palmer et al., (1998) yaitu denaturasi pada suhu 95 ºC selama satu menit, penempelan pada suhu 62 ºC selama satu menit, serta pemanjangan molekul DNA yang terjadi pada suhu 72 ºC selama dua menit sebanyak 35 siklus. Elektroforesis Produk PCR Elektroforesis produk PCR dilakukan menggunakan 5 µl produk PCR pada gel agarose 1,5% dengan tegangan sebesar 100 volt yang dilakukan selama 60 menit. Pembuatan gel yaitu dengan mencampurkan agarose 0,45 g, 0,5 TBE 30 ml, dan 2,5 µl EtBr. Produk PCR sebanyak 5 µl dicampur dengan loading sebanyak 1 µl. Gel agarose setelah dielektroforesis dilihat panjang pita DNA dengan menggunakan UV- Transilluminator. Genotyping Produk PCR sebanyak 5 µl didistribusikan ke dalam Eppendorf 0,5 ml lalu ditambahkan 0,3 µl enzim restriksi MspI, dan 0,7 µl buffer tango. Sampel DNA setelah dipotong dengan enzim restriksi MspI kemudian dielektroforesis pada agarose 2% dengan tegangan 100 volt selama 60 menit. Selanjutnya dilakukan visualisasi di bawah mesin UV-Transilluminator. Pita DNA yang muncul pada tahap ini dibandingkan dengan marker untuk mengetahui panjang pita tersebut. Genotipe gen calpastatin ditentukan berdasarkan panjang pita DNA yang muncul (Gambar 4). Penentuan genotipe gen calpastatin berdasarkan beberapa penelitian yang telah dilakukan dapat dilihat pada Tabel 3. 13
Gambar 4. Penentuan Genotipe Gen Calpastatin (Palmer et al., 1998). M = marker; 1, 3, 5 = Pemotongan dengan enzim MspI; 2, 4, 6 = Pemotongan dengan enzim NcoI. Tabel 3. Penentuan Genotipe pada Gen CAST Menurut Beberapa Penelitian Ternak Metode Genotyping Sumber Domba Dorset RFLP-MspI Panjang produk PCR : 622pb Domba Lokal Indonesia RFLP-MspI MM : 336 dan 286 pb MN : 622, 336, dan 286 pb Panjang produk PCR : 622 pb MN : 622, 336, 286 pb Domba Karakul RFLP-MspI Panjang produk PCR : 622 pb MM : 336 dan 286 pb MN : 622, 336, dan 286 pb Palmer et al. (1998) Sumantri et al. (2008) Shahroudi et al. (2006) 14
Rancangan dan Analisis Data Keragaman gen calpastatin setiap bangsa sapi lokal Indonesia dianalisis menggunakan pendekatan nilai frekuensi alel, frekuensi genotipe, dan nilai heterozigositas. Frekuensi alel gen calpastatin dihitung berdasarkan rumus (Nei dan Kumar, 2000) : X i = Frekuensi genotipe dihitung berdasarkan rumus (Nei dan Kumar, 2000) : X ii = x ii = frekuensi genotipe ke-ii x i = frekuensi alel ke-i n ii = jumlah individu bergenotipe ii n ij = jumlah individu bergenotipe ij N = jumlah individu sampel 1996) : Nilai heterozigositas pengamatan (H o ) dihitung menggunakan rumus (Weir, H o = heterozigositas pengamatan (populasi) n ij = jumlah individu heterozigot N = jumlah individu yang diamati (Weir, 1996) : Nilai heterozigositas harapan (H e ) dihitung dengan menggunakan rumus H e = nilai heterozigositas harapan P 1i = frekuensi alel ke-i pada lokus I n = jumlah alel pada lokus ke-i 15