Lampiran. Persiapan Media Bakteri dan Jamur Media Trypticase Soy Agar (TSA) Sebanyak g bubuk TSA dilarutkan dalam ml akuades yang ditempatkan dalam Erlenmeyer liter dan dipanaskan pada penangas air sambil diaduk hingga larut dan homogen dengan menggunakan batang pengaduk, kemudian disterilkan dengan autoclave pada suhu o C dengan tekanan uap atm selama menit. Setelah itu dimasukkan ke dalam tabung reaksi atau cawan yang telah steril, setelah memadat disimpan dalam lemari es dengan plastik steril. Media Potato Dextrose Agar (PDA) Sebanyak g bubuk PDA dilarutkan dalam ml akuades yang ditempatkan dalam Erlenmeyer liter dan dipanaskan pada penangas air sambil diaduk hingga larut dan homogen dengan menggunakan batang pengaduk, kemudian disterilkan dengan autoclave pada suhu o C dengan tekanan uap atm selama menit. Setelah itu dimasukkan ke dalam tabung reaksi atau cawan yang telah steril, lalu disimpan pada lemari es dengan plastik steril
Lampiran. Sterilisasi Alat dan Bahan Sterilisasi alat dilakukan sebelum semua peralatan digunakan, yaitu dengan cara membungkus semua peralatan dengan menggunakan kertas stensil kemudian di masukkan ke dalam oven dengan suhu o C selama jam. Bahan atau media dimasukkan kedalam autoklaf pada suhu o C dengan tekanan psi (per square inci) selama menit. Untuk alat yang tidak tahan panas tinggi disterilisasi dengan zat kimia berupa alkohol %. Lampiran. Pembuatan Larutan Baku McFarland Larutan baku McFarland terdiri atas dua komponen, yaitu larutan BaCl % dan H SO %. Sebanyak, ml larutan BaCl % dicampurkan dengan 9.9ml larutan H SO % dan dikocok hingga homogen. Kekeruhan larutan diukur pada panjang gelombang nm dengan menggunakan akuades sebagai blangkonya. Nilai absorban larutan baku harus berada di kisaran, sampai dengan.. Larutan baku McFarland, ekuivalen dengan suspensi sel bakteri dengan konsentrasi. CFU/ml.
Lampiran. Proses Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Manggis Kulit buah manggis yang telah kering dan simplisia Penimbangan dan penuangan pelarut Proses penyaringan setelah maserasi dan Pemisahan ekstrak dengan pelarut menggunakan rotary evaporator Proses pemekatan ekstrak dengan water bath
Lampiran. Proses Pengujian Toksisitas A. salina Kista A. salina dan wadah penetasan Proses pemipetan larutan uji dengan mikropipet, Proses pengukuran air ml dan Proses pemasukan A. salina Setelah pengamatan jam
Lampiran. Pembuatan Konsentrasi Larutan Uji Larutan induk adalah konsentrasi %, yaitu dengan perbandingan, gram dalam ml DMSO (b/v). Untuk membuat konsentrasi %, % dan % dilakukan dengan pengenceran sebagai berikut: V N =V N a. Konsentrasi % V x % =, x % V =, ml = μl b. Konsentrasi % V x % =, x % V =, ml = μl c. Konsentrasi % V x % =, x % V =, ml = μl
Lampiran. Analisis Kriteria Bakteri Aeromonas hydrophila Uji motilitas motil dan uji O/F positif fermentative Pewarnaan gram negatif berwarna merah dan berbentuk batang pendek
Lampiran. Analisis Kriteria Bakteri Edwardsiella tarda Uji MR positif VP negative dan Citrat negatif Pewarnaan gram negatif berwarna merah dan berbentuk batang pendek
Lampiran 9. Analisis Kriteria Jamur Saprolegnia sp. Pengujian Jamur secara morfologi Hasil pengamatan mikroskopis
Lampiran. Proses Pengujian Antimikroba Penimbangan ekstrak, Penghomogenan ekstrak dengan vortex dan penyiapan suspensi bakteri Pembandingan dengan Larutan McFarland dan Pengolesan suspense bakteri pada media Perendaman cakram, peletakan cakram pada media uji dan pengukuran zona hambat
Lampiran. Hasil Skrining Fitokimia Kulit Buah Manggis a b c d e f Hasil skrining fitokimia pelarut metanol dengan pereaksi: a. FeCl, b. Wagner, c. Dragendroff, d. Mayer, e. Bouchardat dan f. Aqua a b c d e f Hasil skrining fitokimia pelarut etil asetat dengan pereaksi: a.aqua, b. Wagner, c. Bouchardat, d. Mayer, e. Dragendroff dan f. FeCl a b c d e f Hasil skrining fitokimia pelarut n-heksana dengan pereaksi: a.aqua, b. Wagner, c. Bouchardat, d. Mayer, e. Dragendroff dan f. FeCl
Lampiran. Hasil Pengujian Antimikroba (a) (b) (c) Hasil pengujian antibakteri terhadap bakteri A. hydrophila dengan pelarut (a) metanol (b) etil asetat (c) n-heksana (a) (b) (c) Hasil pengujian antibakteri terhadap bakteri Edwardsiella tarda dengan pelarut (a) metanol (b) etil asetat (c) n-heksana (a) (b) (c) Hasil pengujian antijamur terhadap jamur Saprolegnia sp. dengan pelarut (a) metanol (b) etil asetat (c) n-heksana (d) kontrol negatif (DMSO) (e) kontrol positif (nistatin)
Lampiran. Data Awal Kematian A. salina Pada Berbagai Konsentrasi Perlakuan Ulangan U U U U U Rata-rata Kontrol air laut, Kontrol DMSO, ppm Metanol ppm ppm, ppm, Etil asetat ppm, ppm, ppm, n-heksana ppm ppm,
Lampiran. Contoh Perhitungan Penentuan LC a. Ekstrak Kulit Buah Manggis dengan Pelarut Metanol Pelarut metanol Konsentrasi Total Jumlah Persen Log (ppm) Populasi Kematian Mortalitas Konsentrasi Probit,, 9, LC (ppm), Pada ekstrak dengan konsentrasi ppm Persen mortalitas = Jumlah Artemia Mati Jumlah Populasi x % = x % = % Kurva hubungan log konsentrasi versus nilai probit ekstrak metanol: Nilai Probit 9 Ekstrak Metanol y =,x +,9 R² =,,,,, Log Konsentrasi Dari grafik hubungan antara log konsentrasi (sumbu x) dengan nilai probit sumbu y didapatkan persamaan y =,x +,9 dan R =, Penentuan LC (Konsentrasi yang dapat menyebabkan kematian sebesar %) maka % nilai probit (y) = (dilihat dari tabel probit), x = log konsentrasi.
Perhitungan LC dari persamaan regresi y =,x +,9 dan R =, Adalah sebagai berikut: =,x +,9 x = (,9) /, x =, anti log dari x =, LC =, ppm b. Ekstrak Kulit Buah Manggis dengan Pelarut Etil asetat Pelarut Etil asetat Konsentrasi Total Jumlah Persen Log (ppm) Populasi Kematian Mortalitas Konsentrasi Probit 9,,, LC (ppm), Pada ekstrak dengan konsentrasi ppm Persen mortalitas = Jumlah Artemia Mati Jumlah Populasi x % = x % = % Kurva hubungan log konsentrasi versus nilai probit ekstrak etil asetat:
Nilai Probit Ekstrak Etil asetat y =,x +, R² =,9,,,, Log Konsentrasi Dari grafik hubungan antara log konsentrasi (sumbu x) dengan nilai probit sumbu y didapatkan persamaan y =,x +, dan R =,9 Penentuan LC (Konsentrasi yang dapat menyebabkan kematian sebesar %) maka % nilai probit (y) = (dilihat dari tabel probit), x = log konsentrasi. Perhitungan LC dari persamaan regresi y =,x +, dan R =,9 adalah sebagai berikut: =,x +, x = (,) /, x =,9 anti log dari x =,9 LC =, ppm
c. Ekstrak Kulit Buah Manggis dengan Pelarut n-heksana Pelarut n-heksana Konsentrasi Total Jumlah Persen Log (ppm) Populasi Kematian Mortalitas Konsentrasi Probit,, LC (ppm), Pada ekstrak dengan konsentrasi ppm Persen mortalitas = Jumlah Artemia Mati Jumlah Populasi x % = x % = % Kurva hubungan log konsentrasi versus nilai probit ekstrak n-heksana: Nilai Probit Ekstrak n-heksana y =,x +,9 R² =,99,,,, Log Konsentrasi Dari grafik hubungan antara log konsentrasi (sumbu x) dengan nilai probit sumbu y didapatkan persamaan y =,x +,9 dan R =,99
Penentuan LC (Konsentrasi yang dapat menyebabkan kematian sebesar %) maka % nilai probit (y) = (dilihat dari tabel probit), x = log konsentrasi. Perhitungan LC dari persamaan regresi y =,x +,9 dan R =,99 adalah sebagai berikut: =,x +,9 x = (,9) /, x =,9 anti log dari x =, LC =, ppm
Lampiran. Data Awal Zona Hambat Ekstrak Kulit Buah Manggis a. Aeromonas hydrophila Pelarut Metanol Etil asetat n-heksana Konsentrasi DMSO Kloramfenikol DMSO Kloramfenikol DMSO Kloramfenikol,,,,, Ulangan U U U U U,, 9,,,, 9,,,,,,,,.,,, 9,, 9,, 9,,, 9, Ratarata (mm),,9,,,,,,,,,,,,, b. Edwardsiella tarda Pelarut Metanol Etil asetat n-heksana Konsentrasi DMSO Kloramfenikol DMSO Kloramfenikol DMSO Kloramfenikol Ulangan U U U U U,,,,,, 9,,,,,,,,,,,, Ratarata (mm),,,,,,,,,,,,,,
b. Saprolegnia sp. Pelarut Konsentrasi Ulangan Ratarata (mm) U U U U U Metanol DMSO Nistatin,,,,,,,,,,, Etil asetat DMSO Nistatin 9.,, 9,, 9 9,,,,,, n-heksana DMSO Nistatin,,,,,,,,,,,
Lampiran. Tabel Probit Menurut Vilchez dkk () Persentase Probit 9 -,,9,,,,,,9,,,,,,9,9,,,,,,9,,,9,,,9,,,,,,,9,,,,9,,,,,,,,9,9,9,9,,,,,,,,,,,,,,,,9,,,,,,,,,,,,,,,,,9,9,99,,,,, 9,,,,,,,,,, 99,,,,,,,,,9,,,,,,,,,,9