Lampiran 1. Prosedur Analisa Karakteristik Tepung Empulur Sagu

LAMPIRAN

Lampiran 1. Prosedur Analisa Karakteristik Tepung Empulur Sagu 1. Analisa Proksimat a. Kadar Air (AOAC 1999) Sampel sebanyak 2 g ditimbang dan ditaruh di dalam cawan aluminium yang telah diketahui bobot keringnya. ahan kemudian dikeringkan di dalam oven pada suhu 100 o C selama 5 jam. Sampel kemudian didinginkan dalam desikator. obot akhir ditimbang dan diulang hingga konstan. Kadar Air (%) = A x 100% Keterangan: A = bobot awal sampel (g) = bobot akhir sampel (g) b. Kadar Abu (AOAC 1999) Sampel sebanyak 3-5 g ditimbang dan ditaruh di cawan porselen yang telah diketahui bobot keringnya. Sebelum diabukan, sampel terlebih dahulu dipanaskan di atas pemanas destruksi hingga berbentuk arang dan tidak berasap lagi. Sampel kemudian diabukan dalam tanur listrik pada suhu 550 o C hingga berbentuk warna abu-abu. Sampel kemudian didinginkan dalam desikator. Sampel ditimbang bobot akhirnya dan diulangi hingga bobot konstan. Kadar Abu (%) = bobot abu setelah pengabuan (g) x 100% bobot awal sampel (g) c. Kadar Lemak (Metode Soxhlet) Labu dikeringkan dengan oven bersuhu 100-102 o C selama ± 15 menit kemudian didinginkan di dalam desikator dan ditimbang. Sampel ditimbang sebanyak ± 5 g kemudian dibungkus dengan kertas saring dan dimasukkan ke dalam alat ekstraksi soxhlet kemudian direfluks selama 5-6 jam. Pelarut dalam labu lemak didestilasi dan ditampung hasilnya. Labu lemak yang berisi hasil ekstraksi dipanaskan di dalam oven 105 o C. Setelah pelarut menguap semua, labu lemak diangkat dan didinginkan di dalam desikator kemudian ditimbang. Nilai kadar lemak dapat diperoleh dengan perhitungan sebagai berikut : Kadar Lemak (%) = berat lemak (g) x 100% berat sampel d. Kadar Protein (AOAC 1999) Sebanyak 0.1 g contoh dimasukkan ke dalam labu Kjedahl lalu ditambahkan 2.5 ml H 2 SO 4 pekat, 1 g katalis dan beberapa butir batu didih. Larutan didesktruksi hingga menghasilkan larutan jernih kemudian didinginkan. Larutan hasil destruksi dipindahkan ke alat destilasi dan ditambahkan 15 ml NaOH 50%. Labu erlenmeyer yang berisi 25 ml HCl 0.02 N dan 2-4 tetes indikator mengsel (campuran metal merah 0.02% dalam alkohol dan metal biru 0.02% dalam alkohol 2:1) diletakkan di bawah kondensor. Ujung tabung kondensor harus terendam dalam larutan HCl. Destilasi dilakukan sampai volume larutan 52

dalam erlenmeyer mencapai 2 kali volume awal. Ujung kondensor dibilas dengan akuades (ditampung dalam erlenmeyer). Larutan yang berada di dalam erlenmeyer dititrasi dengan NaOH 0.02 N hingga diperoleh perubahan warna dari hijau menjadi ungu. Setelah itu dilakukan pula penetapan blanko. Kadar Protein (%) = (a-b) x N x 0.014 x 6.25 x 100% W Keterangan: a= ml NaOH untuk titrasi blanko b = ml NaOH untuk titrasi contoh N = normalitas NaOH W = bobot contoh (g) e. Kadar Serat Kasar (AOAC 1999) Sebanyak 2 g contoh dimasukkan ke dalam erlenmeyer 500 ml dan ditambahkan 100 ml H 2 SO 4 0.325 N. Campuran dihidrolisis dalam otoklaf selama 15 menit pada suhu 105 o C dan didinginkan kemudian ditambahkan NaOH 1.25 N sebanyak 50 ml. Sampel dihidrolisis kembali dalam otoklaf selama 15 menit. Sampel disaring tersebut dicuci berturut-turut dengan air panas, 25 ml H 2 SO 4 0.325 N lalu dengan air panas dan terakhir menggunakan alkohol 25 ml. Kertas saring tersebut dikeringkan dalam oven bersuhu 105 o C selama 1 jam dan dilanjutkan sampai bobot tetap. Kadar Serat (%) = (a-b)/c x 100% Keterangan: a = bobot residu serat dalam kertas saring (g) b = bobot kertas saring kering (g) c = bobot bahan awal (g) f. Kadar Karbohidrat (by difference) Kadar Karbohidrat (% b/b) = 100% - (kadar air + kadar abu + kadar lemak + kadar protein + kadar serat kasar) 53

2. Analisa Komponen Serat a. Penetapan NDF (Neutral Detergent Fiber) (Van Soest 1969 dalam Apriantono et al.1969) Sampel sebanyak 0.5 g (A), dimasukkan ke dalam gelas piala berukuran 250 ml serta ditambahkan dengan larutan NDF. Larutan NDF terdiri atas bahan kimia sebagai berikut : akuades 1 l; Natrium Sulfat 30 g; EDTA 18.81 g; Natrium orat 10 H 2 O 6.81 g; di-na-hpo 4 anhidrat 4.5 g dan 2- etoksi etanol murni 10 ml. Sampel yang mengandung pati ditambahkan dengan α-amilase 30 ml dalam bufer fosfat ph 7 0.067 N selama 16 jam dalam inkubator 40 o C. Sampel kemudian ditambahkan larutan NDF disaring pada filter glass dengan bantuan pompa vakum, dibilas bergantian dengan air panas dan aseton. Hasil penyaringan tersebut dikeringkan dalam oven 105 o C hingga stabil, setelah itu dimasukkan dalam desikator selama satu jam, kemudian dilakukan penimbangan (). Filter glass diabukan pada tanur dengan suhu 450-500 o C sampai diperoleh bobot setimbang, kemudian ditimbang (C). Kadar NDF (%) = (-C)/A x 100% Keterangan : A = bobot sampel (g) = bobot filter glass dan sampel setelah dioven (g) C = bobot filter glass dan sampel setelah ditanur (g) b. Penetapan ADF dan Hemiselulosa (Van Soest 1969 dalam Apriantono et al.1969) Sampel sebanyak 1 g (A), dimasukkan ke dalam gelas piala serta ditambahkan dengan 50 ml larutan ADF. Larutan ADF terdiri atas 1 liter H 2 SO 4 1 N dan 20 g CTA (chetyle trimethyl ammonium bromide). Sampel yang telah ditambahkan larutan tersebut dipanaskan selama satu jam di atas pendingin balik. Penyaringan dilakukan dengan bantuan pompa vakum dengan menggunakan filter glass. Pencucian dilakukan bergantian dengan aseton dan air panas. Hasil penyaringan tersebut dikeringkan di dalam oven 105 o C hingga stabil, setelah itu dimasukkan ke dalam desikator selama satu jam, kemudian dilakukan penimbangan (). Filter diabukan pada tanur dengan suhu 450-500 o C sampai diperoleh bobot setimbang, kemudian ditimbang (C). Kadar ADF (%) = (-C)/A x 100% Keterangan : A = bobot sampel (g) = bobot filter glass dan sampel setelah dioven (g) C = bobot filter glass dan sampel setelah ditanur (g) c. Kadar Selulosa Residu ADF (C) yang berada di dalam filter glass diletakkan di atas nampan yang berisi air setinggi kira-kira 1 cm. Kemudian ditambahkan H 2 SO 4 setinggi ¾ bagian filter glass dan dibiarkan selama 3 jam sambil diaduk-aduk. Penyaringan dengan filter glass dibantu dengan pompa vakum. Pencucian dilakukan dengan aseton dan air panas. Dilakukan pengeringan dan memasukkan hasil penyaringan 54

tersebut ke dalam oven. Setelah itu dimasukkan lagi ke dalam desikator untuk melakukan pendinginan dan ditimbang (D). Kadar Selulosa = (D-C)/A x 100% Keterangan : A = bobot sampel (g) C = bobot filter glass dan residu ADF awal (g) D = bobot filter glass dan residu ADF setelah dioven (g) 55

Lampiran 2. Prosedur Karakterisasi Kondisi Optimum Enzim 1. Penentuan Kondisi Optimum Enzim α-amilase dan Dextrozyme Prosedur untuk penentuan kondisi optimum kerja enzim α-amilase yang meliputi ph dan suhu optimum dilakukan pada rentang ph 5 hingga 6 (5, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, dan 6) terhadap substrat soluble starch dan dalam rentang waktu inkubasi 10 hingga 60 menit. Pembentukan gula pereduksi dari hasil hidrolisis enzim α-amilase diukur menggunakan metode DNS. Penentuan kondisi optimum enzim dextrozyme dilakukan berdasarkan penelitian Akyuni (2004). 0.5 ml enzim α-amilase Ditambah 0.5 ml soluble starch 0.15% Diinkubasi pada suhu 95 o C (10, 20, 30, 40, 50, dan 60 menit) Ditambah 1 ml DNS Dipanaskan pada air mendidih selama 5 menit Didinginkan dan dibaca menggunakan spektrofotometer pada 550 nm 56

2. Penentuan Kondisi Optimum Enzim Selulase Penentuan kondisi optimum enzim selulase dilakukan pada ph 5 yaitu pengenceran pada bufer ph 5 dan substrat yang digunakan adalah CMC. Aktivitas enzim dihitung melalui pembentukan gula pereduksi (DNS) pada rentang waktu 10, 20, 30 menit inkubasi. Untuk blanko digunakan akuades sedangkan untuk perlakuan kontrol digunakan substrat dan enzim yang langsung ditambahkan DNS (0 menit). 0.5 ml 0.5 enzim ml enzim selulase Ditambah 0.5 ml soluble CMC starch 0.15% 0.15% Diinkubasi pada suhu 95 60 o C selama (10, 20, 3 dan menit 30 menit) Ditambah 1 ml DNS Dipanaskan pada air mendidih selama 5 menit Didinginkan dan dibaca menggunakan spektrofotometer pada 550 nm 57

3. Penentuan Kondisi Optimum Enzim Xilanase Penentuan kondisi optimum enzim xilanase dilakukan pada pengenceran dengan bufer ph 6 dengan substrat yang digunakan adalah xilan (birchwood). Aktivitas enzim dihitung melalui pembentukan gula pereduksi (DNS) pada rentang waktu 10 hingga 60 menit inkubasi. Untuk blanko digunakan akuades sedangkan untuk perlakuan kontrol digunakan substrat dan enzim yang langsung ditambahkan DNS (0 menit). 0.5 ml 0.5 enzim ml enzim xilanase Ditambah 0.5 ml ml soluble xilan starch 0.15% 0.15% Diinkubasi pada suhu 6095 o C o C (10, selama 20, 30, 3 menit 40, 50, dan 60 menit) Ditambah 1 ml DNS Dipanaskan pada air mendidih selama 5 menit Didinginkan dan dibaca menggunakan spektrofotometer pada 550 nm 58

Lampiran 3. Prosedur Pembuatan Pereaksi DNS dan ufer ph 1. Pereaksi DNS Sebanyak 19.8 g NaOH, 306 g K Na Tartarat, 8.3 g Sodium Metabisulfit, 10.6 g DNS, dan 7.8 g Fenol (telah dicairkan pada suhu 50 o C) dicampur dengan 1416 ml akuades. Semua bahan dicampur hingga homogen. Setelah campuran homogen, sebanyak 3 ml ditritrasi dengan HCl 0.1 N dengan menggunakan indikator PP. Apabila ml HCl untuk titrasi lebih dari 6 ml maka untuk setiap penambahan ml HCl 0.1 N, ditambahkan dengan 2 g/ml NaOH. 2. ufer ph (ufer Sitrat-Fosfat) a. ufer sitrat-fosfat untuk ph 4.5 (100 ml) asam sitrat 0.1 M : 27.8 ml Na 2 HPO 4 : 22.2 ml ditambahkan akuades steril hingga volume larutan mencapai 100 ml b. ufer sitrat-fosfat untuk ph 5 (100 ml) asam sitrat 0.1 N : 24.3 ml Na 2 HPO 4 : 25.7 ml ditambahkan akuades steril hingga volume larutan mencapai 100 ml c. ufer sitrat-fosfat untuk ph 5.2 (100 ml) asam sitrat 0.1 N : 23.3 ml Na 2 HPO 4 : 26.7 ml ditambahkan akuades steril hingga volume larutan mencapai 100 ml d. ufer sitrat-fosfat untuk ph 5.4 (100 ml) asam sitrat 0.1 N : 22.2 ml Na 2 HPO 4 : 27.8 ml ditambahkan akuades steril hingga volume larutan mencapai 100 ml e. ufer sitrat-fosfat untuk ph 5.6 (100 ml) asam sitrat 0.1 N : 21.0 ml Na 2 HPO 4 : 29.0 ml ditambahkan akuades steril hingga volume larutan mencapai 100 ml f. ufer sitrat-fosfat untuk ph 5.8 (100 ml) asam sitrat 0.1 N : 19.7 ml Na 2 HPO 4 : 30.3 ml ditambahkan akuades steril hingga volume larutan mencapai 100 ml g. ufer sitrat-fosfat untuk ph 6.0 (100 ml) asam sitrat 0.1 N : 17.9 ml Na 2 HPO 4 : 32.1 ml ditambahkan akuades steril hingga volume larutan mencapai 100 ml 59

Lampiran 4. Prosedur Pengukuran Gula Pereduksi dengan Metode DNS (Apriyanto et al. 1989) dan Kurva Standar Glukosa Untuk Gula Pereduksi 1. Prosedur Pengukuran Gula Pereduksi Pengukuran gula pereduksi dengan menggunakan metode DNS dilakukan dengan cara mencampurkan 1 ml filtrat dari sampel yang akan diuji dengan 1 ml larutan pereaksi DNS kemudian dipanaskan pada air mendidih selama 5 menit. Setelah itu, didinginkan lalu dibaca menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm. Pembacaan pada spektrofotometer memberikan nilai dalam satuan absorbansi sehingga untuk mengetahui konsentrasi gula pereduksi di dalam sampel tersebut, terlebih dahulu dibuat kurva standar glukosa. Untuk pembuatan kurva standar glukosa, digunakan glukosa standar (0, 100, 150, 200, dan 250 ppm). Masing-masing diambil 1 ml sesuai dengan prosedur pengukuran gula pereduksi di atas. Hasil pembacaan pada spektrofotometer dikumpulkan dan dicari persamaannya, dari persamaan inilah dapat diketahui konsentrasi gula pereduksi di dalam sampel. 2. Kurva Standar Glukosa untuk Gula Pereduksi ppm Abs 100 0.158 100 0.178 150 0.433 150 0.436 200 0.678 200 0.702 250 1.035 250 1.004 60

Lampiran 5. Prosedur Pengukuran Total Gula dengan Metode Fenol (Apriyanto et al. 1989) dan Kurva Standar Glukosa Untuk Total Gula 1. Prosedur Pengukuran Total Gula Pengukuran total gula dengan menggunakan metode Fenol dilakukan dengan cara mencampurkan 1 ml filtrat dari sampel yang akan diuji dengan 0.5 ml Fenol 5% dan 2.5 ml H 2 SO 4 pekat kemudian dipanaskan pada air mendidih selama 15 menit. Setelah itu, didinginkan lalu dibaca menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm. Pembacaan pada spektrofotometer memberikan nilai dalam satuan absorbansi sehingga untuk mengetahui jumlah total di dalam sampel tersebut, terlebih dahulu dibuat kurva standar glukosa. Untuk pembuatan kurva standar glukosa, digunakan glukosa standar (0, 10, 20, 30, 40, dan 50 ppm). Masingmasing diambil 1 ml sesuai dengan prosedur pengukuran gula pereduksi di atas. Hasil pembacaan pada spektrofotometer dikumpulkan dan dicari persamaannya, dari persamaan inilah dapat diketahui jumlah total gula yang terdapat di dalam sampel. 2. Kurva Standar Glukosa untuk Total Gula ppm Abs 10 0.147 10 0.163 20 0.316 20 0.324 30 0.495 30 0.513 40 0.659 40 0.654 50 0.803 50 0.823 61

Lampiran 6. Prosedur Analisa Kejernihan Filtrat Hidrolisat (Sunarti et al. 2011) Prosedur analisa kejernihan filtrat dari hasil hidrolisis adalah sebagai berikut : Sampel dicelupkan ke dalam air mendidih selama 30 menit Tabung sampel dikocok setiap 5 menit Sampel didinginkan kemudian dibaca nilai trasmitannya (%) menggunakan spektrofotometer pada λ 650 nm 62

Lampiran 7. Prosedur Analisa Kaldu Fermentasi 1. ph (AOAC 1999) Pengukuran ph dilakukan dengan menggunakan ph-meter. agian elektroda pada ph-meter terlebih dahulu dicuci dengan akuades, lalu dimasukkan ke dalam sampel. Nilai ph sampel ditetapkan setelah nilai yang ditampilkan oleh alat menunjukkan nilai konstan. 2. Total Asam (Dewipadma 1978 dalam Derosya 2010) Total asam ditentukan dengan cara titrasi dan dinyatakan sebagai asam laktat. Sampel diambil sebanyak 1 ml kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer 50 ml. Selanjutnya ditambahkan dengan 9 ml akuades dan dipanaskan untuk menghilangkan CO 2 yang terdapat di dalam sampel. Campuran didinginkan kemudian dititrasi dengan NaOH 0.1 N dengan indikator fenolftalein. Total Asam (g/) = ml NaOH x N NaOH x 9 x faktor pengenceran ml contoh 3. Kadar Etanol Penentuan kadar etanol dilakukan dengan metode Gas Chromtography (GC). Metode yang digunakan untuk menentukan kadar etanol ialah dengan membandingkan waktu retensi contoh dengan waktu retensi standar etanol. Konsentasi standar etanol yang diinjeksikan adalah 1% (v/v). Kadar etanol yang terdapat di dalam contoh dihitung dengan menggunakan persamaan sebagai berikut : Kadar Etanol (%) = luas area contoh x [standar] luas area standar 63

Lampiran 8. Uji Homogenitas Total Gula, Gula Pereduksi, Derajat Polimerisasi, dan Dextrose Equivalent 1. Likuifikasi a. Total Gula d Jumlah Kuadrat F Hitung Pr>F Kuadrat Tengah Total Gula 8 9398.50 1174.81 13.31 0.0004 Perlakuan Rata-rata N Grup Duncan AU7 157.634 2 A P3U7 99.098 2 AU3 96.250 2 P3U3 93.697 2 AU1 85.871 2 P3U1 84.514 2 P5U1 82.607 2 P5U3 81.603 2 P5U7 79.710 2 64

b. Gula Pereduksi d Jumlah Kuadrat F Hitung Pr>F Kuadrat Tengah Gula Pereduksi 8 686.48 85.81 16.65 0.0002 Perlakuan Rata-rata N Grup Duncan P3U7 40.890 2 A P5U7 35.410 2 P3U3 34.950 2 P5U3 29.620 2 C C P5U1 27.640 2 C C AU1 27.240 2 C C P3U1 25.020 2 D C D C AU3 24.135 2 D C D AU7 19.935 2 D 65

c. Derajat Polimerisasi d Jumlah Kuadrat F Hitung Pr>F Kuadrat Tengah Total Gula 8 33.69 4.21 31.48 <.0001 Perlakuan Rata-rata N Grup Duncan AU7 7.0185 2 A AU3 3.9940 2 P3U1 3.3985 2 C C AU1 3.1760 2 C D C D P5U1 2.9975 2 C E D C E D P5U3 2.7660 2 C E D C E D P3U3 2.6830 2 C E D E D P3U7 2.4245 2 E D E P5U7 2.2505 2 E 66

d. Dekstrose Ekivalen d Jumlah Kuadrat F Hitung Pr>F Kuadrat Tengah Total Gula 8 1413.18 176.65 21.51 <.0001 Perlakuan Rata-rata N Grup Duncan P5U7 44.437 2 A A P3U7 41.385 2 A P3U3 37.409 2 C C P5U3 36.251 2 C D C D P5U1 33.447 2 C D C D AU1 31.671 2 E C D E D P3U1 29.585 2 E D E AU3 25.110 2 E AU7 12.948 2 F 67

2. Sakarifikasi a. Total Gula d Jumlah Kuadrat F Hitung Pr>F Kuadrat Tengah Total Gula 3 364.82 121.61 15.75 0.0111 b. Gula Pereduksi Perlakuan Rata-rata N Grup Duncan P 5 U 7 T 110.16 2 A P 5 U 7 K 102.42 2 P 5 U 1 T 98.44 2 C C P 5 U 1 K 91.48 2 C d Jumlah Kuadrat F Hitung Pr>F Kuadrat Tengah Total Gula 3 679.08 226.36 14.01 0.0137 Perlakuan Rata-rata N Grup Duncan P 5 U 7 T 78.02 2 A P 5 U 7 K 60.48 2 P 5 U 1 T 56.94 2 P 5 U 1 K 54.52 2 68

c. Derajat Polimerisasi d Jumlah Kuadrat F Hitung Pr>F Kuadrat Tengah Total Gula 3 0.28 0.095 3.89 0.1112 d. Dekstrose Ekivalen Perlakuan Rata-rata N Grup Duncan P 5 U 1 K 1.89 2 A A P 5 U 1 T 1.67 2 A A P 5 U 7 K 1.64 2 A P 5 U 7 T 1.36 2 d Jumlah Kuadrat F Hitung Pr>F Kuadrat Tengah Total Gula 3 446.29 148.76 4.41 0.0927 Perlakuan Rata-rata N Grup Duncan P 5 U 7 T 73.86 2 A A P 5 U 7 K 61.32 2 A A P 5 U 1 T 60.24 2 A P 5 U 1 K 53.11 2 69

Lampiran 9. Aktivitas Enzim α-amilase, Selulase, dan Xilanase 1. Aktivitas Alfa Amilase pada berbagai ph (5, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, dan 6) dan suhu 95 o C Waktu (menit) Aktivitas (U/ml) 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 0 0 0 0 0 0 0 10 1.11 84.44 34.44 153.33 441.11 674.44 20 18.33 16.11 17.22 117.78 190.56 218.33 30 15.19 34.07 475.19 117.78 255.19 187.78 40 0.83 15.83 15.56 351.67 251.94 181.94 50 0.44 46.89 16.00 70.44 233.33 85.11 60 6.85 175.37 11.67 120.74 189.07 156.85 2. Aktivitas Selulase pada ph 5 dan suhu 60 o C Waktu (menit) Aktivitas (U/ml) 0 0 10 440.56 20 318.33 30 251.85 3. Aktivitas Xilanase pada ph 6 dan suhu 50 o C Waktu (menit) Aktivitas (U/ml) 0 0 10 173.33 20 178.89 30 182.22 40 146.11 50 134.22 60 117.04 70