IDENTIFIKASI DNA BAKTERI MULTIRESISTEN GENUS STREPTOCOCCUS ( ISOLAT WK 45 ) DENGAN METODE PCR MENGGUNAKAN PRIMER UNIVERSAL 16S rrna SKRIPSI Untuk memenuhi sebagian persyaratan Mencapai Derajat Sarjana S-1 HENDRI DINNUR FATCHULLOH 0908010011 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO PURWOKERTO 2013 i
ii
iii
iv
INTISARI HENDRI DINNUR FATCHULLOH. Identifikasi DNA Bakteri Multiresisten Genus Streptococcus (Isolat WK 45) Dengan Metode PCR Menggunakan Primer Universal 16S rrna. Dibawah bimbingan BINAR ASRINING DHIANI dan NUNUK ARIES NURULITA Latar Belakang: Seiring meningkatnya penggunaan antibiotik yang tidak terkontrol maka jumlah bakteri yang resisten terhadap antibiotik semakin bertambah. Dalam upaya penanggulangan dari serangan bakteri resisten, perlu dilakukan deteksi terhadap gen penyandi 16S rrna bakteri karena mutasi pada gen rrna sering dijumpai pada bakteri yang resisten terhadap antibiotik. Salah satu teknik dalam mengidentifikasi 16S rrna bakteri adalah dengan cara menganalisis struktur atau susunan basa DNA. Metode yang digunakan untuk analisis DNA bakteri resisten yaitu dengan amplifikasi DNA melalui metode PCR (Polymerase Chain Reaction). Kemudian hasil amplifikasi dipotong oleh enzim restriksi HindIII untuk memperoleh fragmen DNA. Tujuan Penelitian: Untuk mengidentifikasi hasil pemotongan produk PCR dari 16S rrna bakteri multiresisten antibotik yang diisolasi dari tanah Rumah Sakit di Purwokerto (isolat WK 45) menggunakan enzim restriksi HindIII. Metode Penelitian: Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental yaitu mengidentifikasi produk PCR hasil amplifikasi 16S rrna yang menggunakan primer universal 8F dan 1492R. Hasil amplifikasi produk PCR kemudian dipotong oleh enzim restriksi HindIII. Hasil: Gen 16S rrna bakteri WK 45 genus Streptococcus memiliki ukuran 1600 bp. Berdasarkan data yang diperoleh dari NCBI (National Center for Biotechnology Information) terhadap beberapa bakteri genus Streptococcus, bakteri yang dipotong oleh enzim restriksi HindIII pada gen 16S rrna dengan fragmen pengenal 5 - AAGCTT-3. HindIII dapat memotong gen 16S rrna pada bakteri Streptococcus pneumoniae isolate 19-5-F pada dua tempat pemotongan dan juga ada beberapa contoh bakteri strain lain yang tidak terpotong. Hasil penelitian menunjukkan HindIII tidak berhasil memotong gen 16S rrna, kemungkinan adanya mutasi pada sekuen gen 16S rrna sehingga tidak dikenali lagi oleh HindIII. Kesimpulan: Gen 16S rrna pada bakteri dari isolat WK 45 diduga mengalami mutasi pada daerah pemotongan enzim HindIII. Mutasi tersebut diduga berkaitan dengan resistensi bakteri. Kemungkinan juga bakteri tersebut merupakan bakteri jenis spesies Streptococcus tertentu. Kata Kunci : DNA bakteri multiresisten, Streptococcus, PCR, 16S rrna. v
ABSTRACT HENDRI DINNUR FATCHULLOH. DNA Identification of Multiresistant Bacteria Genus Streptococcus (Isolate WK 45) by PCR Method Using Universal Primer 16S rrna. Under Supervision of BINAR ASRINING DHIANI and NUNUK ARIES NURULITA Background: Increasing number of uncontrolled usage of antibiotic increase the number of antibiotic resistant bacteria. To overcome the antbiotic resistant bacteria, we need to analyze the genes encoding of 16S rrna because mutations within rrna gene is often found in antibiotic resistant bacteria. One of methods which can be used for the analysis of 16S rrna of resistant bacteria is DNA amplification by PCR method. Then the amplification product was cut by HindIII restriction enzyme to obtain DNA fragment. Objective: To analyze the restriction of results PCR product from 16S rrna multiresistant bacteria that isolated from soil Hospital at Purwokerto (Isolate WK 45) using the restriction enzyme HindIII. Methods: The study design was an experimental to identify the PCR product of 16S rrna amplification product using universal primer 8F and 1492R. Result of PCR amplification product then cut by HindIII restriction enzyme. Result: Size of 16S rrna gene bacterial genus Streptococcus WK 45 is ~ 1600 bp. Based from data obtained from the NCBI (National Center for Biotechnology Information) on some bacterial genus Streptococcus, the bacteria to be cut by HindIII restriction enzyme in the 16S rrna gene with fragment identifier 5 -AAGCTT-3. HindIII could cut the 16S rrna gene of bacteria Streptococcus pneumoniae isolate 19-5-F at two site and also there were some examples of bacteria that could not cut by HindIII. The results showed that HindIII could not cut the 16S rrna gene, there was possibility of mutations within 16S rrna gene sequence so that the fragment could not be recognized by HindIII. Conclusion: 16S rrna genes of bacteria from isolate WK 45 might have some mutations in the enzyme HindIII restriction site. Mutations were allegedly associated with bacterial resistance. It was also possible that a particular bacteria was belong to species Streptococcus. Keywords: DNA of multiresistant bacteria, Streptococcus, PCR, 16S rrna. vi
MOTTO Setiap hal yang kau lakukan pasti akan memberikan hasil, maka lakukanlah hal yang baik untuk memperoleh hasil yang baik pula Masa depanmu ditentukan dengan apa yang kau lakukan sekarang vii
HALAMAN PERSEMBAHAN Bismillahirrohmanirrohim... Ya allah... Terima kasih akhirnya engkau memberikan jalan yang terang bagi hambamu ini. setelah sekian lama aku melewaati perjuangan yang penuh dengan cobaan dalam menyelesaikan skripsiku ini... Skripsiku ini kupersembahkan untuk : kedua orang tuaku yang selalu mendo akan putranya agar selalu berhasil dalam setiap hal yang ia lewati... Do a orang tua sangat mustajab, I LOVE YOU untuk bapak dan ibu... Untuk adikku satu-satunya yaitu indra Ayoooo brother, buat bangga bapak ibu,,hahaha Tak lupa juga ku ucapkan terima kasih untuk untsa azizah yang selalu memberikan semangat dalam perjalanan skripsiku. Kamu akan selalu di hati... Yang terakhir juga terima kasih buat temen seperjuangan farin alias bolang, okta, dan servin yang sudah sama berjuang untuk penelitian ini. Dan tentunya buat anak angkatan 2009 yang tak bisa disebutkan satu per satu. viii
KATA PENGANTAR Puji syukur penulis panjatkan kehadirat ALLAH SWT atas segala rahmat, hidayah serta inayahnya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian (skripsi) yang berjudul IDENTIFIKASI DNA BAKTERI MULTIRESISTEN GENUS STREPTOCOCCUS ( ISOLAT 45 ) DENGAN METODE PCR MENGGUNAKAN PRIMER UNIVERSAL 16S rrna. Skripsi ini disusun untuk memenuhi syarat dalam memperoleh gelar S1 di fakultas farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto. Penulis menyadari bahwa tanpa bantuan dari berbagai pihak, penulis tidak dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik. Oleh karena itu pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada : 1. Drs. H. Syamsuhadi Irsyad, S.H., M.H. Rektor Universitas Muhammadiyah Purwokerto 2. Dr. Nunuk Ariesta Nurulita, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi dan dosen pembimbing II, yang telah memberikan petunjuk dan motivasi yang tinggi, sehingga penyusunan skripsi ini dapat terlaksana hingga selesai. 3. Binar Asrining Dhiani, M.Sc., Apt. selaku dosen pembimbing I, yang telah sabar dalam memberikan bimbingan dan motivasi sehingga penyusunan skripsi dapat selesai. 4. Seluruh dosen Fakultas Farmasi UMP yang telah memberikan ilmunya sehingga dapat membantu penulis dalam menyelesaikan penulisan skripsi ini. 5. Seluruh laboran Fakultas Farmasi yang telah memberikan arahan dan bimbingannya. 6. Bapak dan Ibu karyawan TU Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto yang telah membantu dalam hal administrasi. 7. Kedua orang tuaku tercinta yang telah memberikan dukungan moral, material dan spiritual. 8. Teman-teman satu angkatan farmasi 2009 yang telah memberikan arti sebuah kebersamaan. ix
Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini, baik dari materi maupun teknik penyajiannya, mengingat kurangnya pengetahuan dan pengalaman penulis. Oleh karena itu, kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan. Purwokerto, September 2013 Penulis x
RIWAYAT HIDUP A. Data Diri Nama : Hendri Dinnur Fatchulloh Tempat, Tanggal Lahir : Cilacap, 13 Juni 1991 Alamat : Jl. Genteng Kulon No.5 RT 01/07 Desa Panimbang, Kecamatan Cimanggu, Kabupaten Cilacap Jenis Kelamin : laki-laki Kewarganegaraan : Indonesia Agama : Islam Nama Ayah : Wahyanto Nama Ibu : Suprapti B. Pendidikan a. TK Aisyiah, tamat tahun 1997/1998 b. SDN 1 Panimbang, tamat tahun 2002/20003 c. SMP Negeri 1 Majenang, tamat tahun 2005/2006 d. SMK Farmasi Muhammadiyah Cirebon, tamat tahun 2008/2009 e. Universitas Muhammadiyah Purwokerto, Fakultas Farmasi, angkatan 2009 xi
DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL... i HALAMAN PERSETUJUAN... ii HALAMAN PENGESAHAN... iii SURAT PERNYATAAN... iv ABSTRAK...... v ABSTRACT...... vi MOTTO...... vii HALAMAN PERSEMBAHAN... viii KATA PENGANTAR..... ix RIWAYAT HIDUP........ xi DAFTAR ISI... xii DAFTAR TABEL... xiv DAFTAR GAMBAR... xv DAFTAR LAMPIRAN... xvi BAB I PENDAHULUAN... 1 A. Latar Belakang Masalah... 1 B. Rumusan Masalah.... 3 C. Tujuan Penelitian... 3 D. Manfaat Penelitian... 3 BAB II TINJAUAN PUSTAKA... 4 A. Resistensi Bakteri... 4 B. Identifikasi Bakteri.... 4 C. Klasifikasi Bakteri... 6 D. PCR (Polymerase Chain Reaction)... 7 E. Identifikasi PCR 16S rrna... 9 F. Enzim Restriksi... 10 G. Agarose Gel... 11 xii
1. Pemisahan molekul DNA dengan Elektroforesis Gel... 11 2. Penampakan Molekul DNA dalam Gel... 11 3. Perkiraan Ukuran Molekul DNA... 12 BAB III METODE PENELITIAN... 13 A. Jenis dan Rancangan Penelitian... 13 B. Variabel Penelitian... 13 C. Definisi Variabel Operasional... 13 D. Bahan dan Alat... 14 E. Cara Penelitian...... 15 1. Pembuatan Medium Mueller Hinton Agar... 15 2. Pembuatan Medium Nutrient Broth (NB)... 15 3. Pembuatan Suspensi Bakteri... 15 4. Uji Resistensi Bakteri.... 15 5. Identifikasi Bakteri... 16 a. Isolasi Bakteri... 16 b. Amplifikasi DNA Dengan PCR... 17 c. Pemotongan DNA Menggunakan Enzim Restriksi Endonuklease HindIII... 18 d. Agarosa Gel Elektroforesis... 18 e. Analisis Hasil... 18 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN...... 19 A. Uji Resistensi Bakteri... 19 B. Isolasi DNA Bakteri... 20 C. Amplifikasi DNA Dengan PCR... 23 D. Pemotongan DNA Menggunakan Enzim Restriksi Endonuklease.. 25 E. Analisis 16S rrna Bakteri Genus Streptococcus...... 26 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN...... 28 A. Kesimpulan... 28 B. Saran... 28 DAFTAR PUSTAKA...... 29 LAMPIRAN... 33 xiii
DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1. Interpretasi zona hambat Kirby-Bauer terhadap pengujian antibiotik... 16 xiv
DAFTAR GAMBAR halaman Gambar 1 Hasil uji resistensi kultur bakteri WK 45 terhadap antibiotik amoksisilin, kloramfenikol, gentamisin, siprofloksasin dan oksitetrasiklin.... 19 Gambar 2. Isolat DNA bakteri WK 45 hasil isolasi menggunakan peqgold Bacterial DNA Kit.... 22 Gambar 3. Produk PCR hasil amplifikasi 16S rrna bakteri WK 45 menggunakan primer universal 8F dan 1492R... 24 Gambar 4. Fragmen DNA bakteri WK 45 yang telah dipotong oleh enzim restriksi HindIII... 25 xv
DAFTAR LAMPIRAN halaman Lampiran 1. Streptococcus pneumoniae strain: NBRC 102642... 34 Lampiran 2. Streptococcus pneumoniae strain HER 105536... 35 Lampiran 3. Streptococcus pneumoniae isolate 19-5-F... 37 xvi