ANALISIS GEN PENYANDI HEMAGLUTININ VIRUS HIGHLY PATHOGENIC AVIAN INFLUENZA SUBTIPE H5N1 ISOLAT UNGGAS AIR

ANALISIS GEN PENYANDI HEMAGLUTININ VIRUS HIGHLY PATHOGENIC AVIAN INFLUENZA SUBTIPE H5N ISOLAT UNGGAS AIR ABSTRACT Avian influenza viruses (AIV) subtype H5N isolated from waterfowls in West Java pose the known characteristic of highly pathogenic strains, with polybasic amino acid sequence of cleavage site QRERRRKKR and QRESRRKKR. This research aimed to analyze the important domains of hemagglutinin (HA) gene of those isolates. Fragment of HA gene was amplified using RT-PCR method with specifically-designed primer pairs and sequenced using dideoxy termination method with ABI automatic sequencer (Applied Biosystems). Multiple alignment of nucleotide and deduced amino acid sequences were analyzed using ClustalW of MEGA-3. program. Some of biological domains of HA, i.e. antigenic sites, receptor binding pocket, and glycosylation sites of the isolates were polymorphic. The viruses also pose conserved glutamine (Q) and glisin (G) residues at the known receptor binding site, at the position and 4 respectively. All findings clearly show that waterfowl might act as evolution site of the virus, while it preserves the avian receptor specificity. Key words: antigenic sites, glycosylation sites, receptor binding pocket, AIV H5N, waterfowls ABSTRAK Virus avian influenza (VAI) subtipe H5N yang diisolasi dari unggas air di Jawa Barat bersifat patogenik dengan pola asam amino daerah pemotongan HA QRERRRKKR dan QRESRRKKR. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis domain-domain penting gen penyandi hemaglutinin (HA) isolat-isolat tersebut. Fragmen gen HA diamplifikasi dengan metode RT-PCR menggunakan pasangan primer yang didisain khusus, dan disekuensing dengan metode dideoksi dengan ABI automatic sequencer (Applied Biosystems). Runutan nukleotida hasil sekuensing dan asam amino turunannya disepadankan dengan ClustalW dari program MEGA 3.. Domain asam amino daerah antigenik, posisi glikosilasi dan kantong pengikat reseptor virus yang dianalisis menunjukkan adanya polimorfisme. Sedangkan domain residu pengikat reseptor, semua isolat mempunyai glutamin (Q) dan glisin (G) berturut-turut pada asam amino nomor dan 4. Temuan-temuan tersebut menunjukkan dengan jelas bahwa unggas air berperan sebagai tempat evolusi virus AI, namun spesifisitas reseptor avian α-,3neuacgal masih tetap dipertahankan. Kata kunci: daerah antigenik, posisi glikosilasi, kantong pengikat reseptor, VAI H5N, unggas air

7 PENDAHULUAN Patogenesitas virus avian influenza (VAI) secara molekuler ditentukan berdasarkan sekuen asam amino daerah pemotongan (cleavage site) HA. Daerah pemotongan hemaglutinin (HA) bersifat spesifik dan spesifisitas jenis protease membatasi distribusi jaringan yang dapat diinfeksi virus ini (Munch et al. 00). Meskipun VAI H5N secara molekuler bersifat patogenik, namun patogenesitasnya berbeda-beda pada setiap spesies hospes bahkan pada spesies hospes yang sama (Hulse et al. 004). Selain ditentukan oleh sekuen asam amino daerah pemotongan HA, patogenesitas virus ditentukan oleh residu asam amino pada beberapa domain HA (Plotkin & Dushoff 003; Hulse et al. 004). Domain-domain dimaksud antara lain adalah daerah antigenik, kantong pengikat reseptor, residu pengikat reseptor dan posisi glikosilasi. Daerah antigenik dan posisi glikosilasi fungsinya berkaitan erat dengan pertahanan terhadap respon imun hospes, sementara kantong pengikat reseptor dan posisi glikosilasi fungsinya berkaitan dengan daya adaptasi pada hospes dan patogenesitas strain (Hulse et al. 004; Gambaryan et al. 006; Smith et al. 006a; Stevens et al. 006). Daerah antigenik adalah asam amino sebagai target pengenalan dan netralisasi oleh antibodi. Substitusi asam amino pada daerah antigenik meningkatkan potensi terjadinya hanyutan antigenik (antigenic drift), karena berkaitan dengan mekanisme virus untuk menghindar dari respon imun hospes. Substitusi ini disebabkan tekanan seleksi untuk menghindar dari respon antibodi hospes, termasuk penghindaran pengenalan antibodi yang terbentuk akibat vaksinasi (Plotkin & Dushoff 003; Smith et al. 004; Campitelli et al. 006). Posisi glikosilasi adalah sekuen asam amino yang berpotensi sebagai tempat penempelan oligosakarida. Penempelan oligosakarida ini sangat penting dalam orientasi pelipatan HA untuk berikatan dengan reseptor sel atau antibodi. Substitusi asam amino pada posisi glikosilasi merupakan strategi virus untuk mask (menutup) atau unmask (membuka) daerah antigenik dari pengenalan antibodi sel hospes (Rajakumar et al. 990; Hoffmann et al 005; Campitelli et al. 006; Stevens et al. 006). Penambahan glikan pada posisi berdekatan dengan asam amino residu pengikat reseptor dapat mengubah efisiensi ikatan HA pada

7 reseptor sel (Mishin et al. 005). Sekuen asam amino yang berpotensi sebagai posisi penempelan oligosakarida adalah sekuen asam amino dengan pola NXT dan NXS (Hoffman et al. 005; Smith et al. 006a; Stevens et al. 006). Residu pengikat reseptor adalah asam amino yang berikatan secara langsung dengan reseptor sel hospes. Substitusi asam amino pada residu pengikat reseptor menyebabkan perubahan spesifisitas reseptor. Bagian dari HA yang berikatan dengan reseptor adalah asam amino nomor dan 4 (penomoran menurut H5). Glikoprotein HA virus influenza strain manusia yang mempunyai asam amino leusin pada posisi dan serin pada 4 hanya dapat berikatan dengan asam sialat α-,6neuacgal. Sementara HA virus influenza strain unggas yang mempunyai asam amino glutamin pada posisi dan glisin pada 4 hanya dapat berikatan dengan asam sialat α-,3neuacgal (Vines et al. 998; Zhou et al. 999; Suzuki et al. 000; Leung 007). Kantong pengikat reseptor adalah asam amino yang terlibat mempertahankan integritas struktur residu pengikat reseptor. Substitusi asam amino kantong pengikat reseptor menyebabkan perubahan pelipatan protein sehingga mengubah afinitas ikatan virus pada reseptor (Harvey et al. 004; Gambaryan et al. 006; Auewarakul et al. 007). VAI strain avian yang mengalami perubahan afinitas pada reseptor hospes berpeluang memunculkan strain virus yang berafinitas tinggi pada sel mamalia (Campitelli et al. 006). Adaptasi selalu dilakukan virus influenza, baik adaptasi terhadap tekanan imun maupun adaptasi pada spesies hospes baru (Taubenberger et al. 005). Adaptasi merupakan kekuatan utama dari evolusi. Perbedaan spesies hospes dan perbedaan tekanan menyebabkan pebedaan kecepatan evolusi virus influenza (Brown et al. 00). Keberadaan daerah antigenik, kantong pengikat reseptor dan posisi glikosilasi menyebabkan subunit HA mempunyai tingkat substitusi nonsinonim lebih tinggi dibanding substitusi sinonim (Plotkin & Dushoff 003). Kecepatan mutasi substitusi nonsinonim gen HA sebesar 5,7 x0-3 per posisi per tahun (Bush et al. 999). Meskipun tingkat mutasi HA paling tinggi dibanding protein lain, namun pada bagian-bagian tertentu dari HA bersifat stabil pada semua influenza A (Wagner et al. 005). Disamping domain-domain di atas, terdapat suatu domain yang dikenal sebagai peptida fusi. Domain ini berperan pada fusi membran saat infeksi virus

73 influenza ke dalam sel hospes, sehingga berperan dalam patogenesis virus. Domain ini diketahui bersifat stabil pada semua influenza A (Cross et al. 00). Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis domain-domain penting gen penyandi hemaglutinin virus HPAI H5N isolat unggas air, seperti daerah antigenik, kantong pengikat reseptor, residu pengikat reseptor, posisi glikosilasi dan peptida fusi. Primer yang digunakan adalah dua pasang primer yang didisain khusus untuk mengamplifikasi nukleotida nomor sampai dengan nomor 00 dari gen HA. METODE PENELITIAN RNA dari 9 isolat VAI subtipe H5N asal unggas air di Jawa Barat diekstraksi dengan Trizol LSReagent (Invitrogen) sesuai manual. RT-PCR dilakukan dengan menggunakan Superscript TM III One-step RT-PCR system. Reaksi PCR dibuat sebanyak 50 μl dengan komposisi 5 μl x reaction mix, μl primer forward (0 μm), μl primer reverse (0 μm), μl Superscript III RT/Platinum Taq Mix, 3 μl sampel RNA dan ultrapure H O sampai volume 50 μl. Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen H5 adalah pasang primer yang didisain khusus, yaitu primer HA0-HA645 yang mengamplifikasi nukleotida -645, dan primer HA548-HA5 yang mengamplifikasi nukleotida 548-5 (Tabel 0). Program PCR untuk primer HA0-HA645 adalah 45 o C reaksi RT 60 menit, predenaturasi 95 o C 5 menit, 35 siklus terdiri dari denaturasi 95 o C 30 detik, anneling 55 o C 30 detik, ekstensi 7 o C 40 detik, dan post ekstensi 7 o C 0 menit. Program PCR untuk primer HA548-HA5 menggunakan suhu anneling 5 o C. Isolat yang tidak dapat diamplifikasi dengan primer HA0-HA645, dilakukan amplifikasi menggunakan primer H5-55F-H5-699R dengan anneling 50 o C. Adanya pita DNA spesifik hasil PCR diidentifikasi dengan elektroforesis pada gel agarose %.

74 Tabel 0. Sekuen nukleotida primer untuk mengamplifikasi gen HA Primer Sekuen basa Fragmen gen Produk (bp) a HA0: 5 ATGGAGAAAATAGTGCTTCTTCTTGC 3 HA645: 5 GGAAATATAGGTGGTTGGGTTTTG 3 a HA548F: 5 CCAACCRAGARGATCTTTTGG 3* HA5R: 5 AYRGCCTCAAACTGAGTGTTC 3* 3 b H5-55F: 5 ACACATGCYCARGACATACT 3* H5-699R: 5 CTYTGRTTYAGTGTTGATGT 3* H5 (basa -645) H5 (bada 548-5) H5 (basa 55-699) 645 667 545 * Y=(CT), R=(AG) b Lee et al. (00) a didisain oleh Dr. Drh. IGN Mahardika & Drh. R. Susanti, MP PCR dengan pasangan primer H5-55F dan H5-699R menghasilkan pita DNA target dan pita-pita nonspesifik, sehingga dilakukan purifikasi dengan Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) sesuai manual. Pita DNA target pada gel elektroforesis dipotong dan dimasukkan pada tabung 5 ml, kemudian ditambah membrane binding solution sebanyak 0µl/0mg gel. Setelah divortek, diinkubasi pada suhu 50-65 o C sampai gel terlarut sempurna. Larutan gel dimasukkan pada SV minicolumn (pada tabung koleksi), diinkubasi pada suhu kamar selama menit, dan disentrifuse pada 6000 g selama menit. Tabung koleksi dan larutan isinya dibuang, SV minicolumn dipindahkan pada tabung koleksi baru. Pada SV minicolumn dimasukkan 700 ul membrane wash solution, kemudian disentrifus 6000 g selama menit. Larutan di dalam tabung koleksi dibuang, SV minicolumn kembali dimasukkan pada tabung koleksi. Pada SV minocolumn dimasukkan 500 µl membrane wash solution, kemudian disentrifus pada 6000 g selama menit. Larutan di dalam tabung koleksi dibuang, SV minicolumn kembali dimasukkan pada tabung koleksi, kemudian disentrifus pada 6000 g selama menit. SV minicolumn dipindahkan ke tabung,5 ml yang bersih, kemudian dimasukkan 50 µl nuclease free water. Setelah diinkubasi pada suhu kamar selama menit, SV minocolumn disentrifus 6000 g selama menit. DNA hasil purifikasi yang terdapat pada tabung,5 ml selanjutnya disimpan pada suhu -0 o C. Sekuensing dilakukan di st BASE Malaysia dengan metode dideoksi menggunakan ABI automatic sequencer (Applied Biosystems). Runutan

75 nukleotida gen hemaglutinin hasil sekuensing dan turunan asam aminonya disepadankan dengan program ClustalW (MEGA 3.) (Kumar et al. 004), dan didokumentasikan di GenBank. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil PCR gen HA pada 9 isolat VAI subtipe H5N menggunakan primer HA0-HA645 yang mengamplifikasi nukleotida sampai 645, dan primer HA548- HA5 yang mengamplifikasi nukleotida 548 sampai 5, berturut-turut terlihat pada Gambar 8 dan Gambar 9. Sebanyak 4 isolat VAI H5N (IPB6-RS, IPB7-RS, IPB8-RS, IPB9-RS) tidak dapat diamplifikasi dengan primer HA0-HA645, sehingga dilakukan amplifikasi dengan primer H5-55F-H5-699R (Gambar 0). bp M P 3 000 650 000 850 650 500 400 300 00 00 645bp Gambar 8. Elektroforegram RT-PCR dengan primer HA0dan HA645 (produk 645bp). Sumur M: DNA ladder 00bp. Sumur P: Kontrol positif VAI subtipe H5. Sumur -3:VAI isolat unggas air subtipe H5N

76 bp M P 3 4 5 6 7 8 9 0 000 650 000 850 650 500 400 300 00 00 667 bp Gambar 9. Elektroforegram RT-PCR dengan primer HA548 dan HA5 (produk 667bp). Sumur M: DNA ladder 00bp. Sumur P: Kontrol positif VAI subtipe H5. Sumur -: VAI isolat unggas air subtipe H5N bp 000 650 000 850 650 500 400 300 00 00 M 3 4 5 P 545 bp Gambar 0. Elektroforegram RT-PCR dengan primer H5-55F dan H5-699R (produk 545bp). Sumur M: DNA ladder 00bp. Sumur P: Kontrol positif VAI subtipe H5. Sumur -5: VAI isolat unggas air subtipe H5N Sekuen nukleotida penyandi protein HA dari 9 virus AI subtipe H5N isolat unggas air dalam penelitian ini dapat diakses di GenBank dengan nomor akses EF64665-EF64673. Sekuen nukleotida unggas air yang disepadankan dengan nukleotida Gs/GD//96 (Lampiran dan 3) menunjukkan bahwa jumlah kodon substitusi bervariasi dari 3 sampai 50, dan jumlah substitusi nonsinonim bervariasi dari 5-8 (Tabel ). Tingkat mutasi yang tinggi akibat lemahnya mekanisme proofreading dari RdRp, menyebabkan perubahan nukleotida terjadi terus menerus. Kecepatan mutasi HA lebih tinggi dibanding NA karena NA bukan

77 merupakan determinan antigenik utama dan jumlah NA pada permukaan virion hanya /5 jumlah HA (Plotkin & Dushoff 003). Protein internal tidak berperan dalam pengikatan dengan reseptor sel hospes dan tersembunyi dari antibodi, sehingga protein ini lebih stabil dibanding glikoprotein permukaan (Plotkin & Dushoff 003; Berkhoff et al. 005). Struktur dan fungsi protein internal juga sangat mendasar sehingga tidak menguntungkan virus jika mutasi terjadi secara cepat. Hal ini menyebabkan VAI menghadapi konflik intragenom tentang kecepatan mutasi. Gen tertentu dan residu spesifik dalam genom tersebut mengalami seleksi untuk berubah. Sementara gen lain mengalami seleksi pemurnian untuk tidak berubah (Plotkin & Dushoff 003). Substitusi nonsinonim disebabkan oleh tekanan seleksi tergantung frekuensi, artinya semakin sering mengalami tekanan semakin tinggi kecepatan untuk substitusi nonsinonim (Plotkin & Dushoff 003). Adanya tekanan seleksi akan menyebabkan munculnya varian dengan tingkat efektivitas replikasi yang tinggi (Jong et al. 000). Lima virus AI subtipe H5N isolat unggas air (IPB-RS s/d IPB5-RS), mengalami substitusi nonsinonim 3 asam amino kantong pengikat reseptor. Sebanyak substitusi nonsinonim pada isolat IPB6-RS, 0 diantaranya merupakan daerah antigenik, posisi glikosilasi dan kantong pengikat reseptor. Dari 7-8 substitusi nonsinonim pada 3 isolat virus (IPB7-RS, IPB8-RS dan IPB9-RS), 6 substitusi diantaranya merupakan daerah antigenik, posisi glikosilasi dan kantong pengikat reseptor. Tabel. Jumlah substitusi sinonim dam nonsinonim gen hemaglutinin virus avian influenza subtipe H5N isolat unggas air No Isolat Jumlah kodon yang terbaca Jumlah Substitusi Jumlah Substitusi Sinonim Jumlah Substitusi Nonsinonim IPB-RS (Entok) 440 3 8 5 IPB-RS (Angsa) 440 5 9 6 3 IPB3-RS (Itik) 439 3 8 5 4 IPB4-RS (Angsa) 398 4 9 6 5 IPB5-RS (Entok) 388 4 7 7 6 IPB6-RS (Itik) 398 39 8 7 IPB7-RS (Angsa) 395 50 3 8 8 IPB8-RS (Itik) 398 48 3 7 9 IPB9-RS (Itik) 398 47 30 7

78 Virus AI subtipe H5N garis Asia menunjukkan jumlah asam amino yang mengalami seleksi positif meningkat dari tahun ke tahun, terutama pada daerah antigenik, posisi glikosilasi dan kantong pengikat reseptor. Hal ini kemungkinan berhubungan dengan peningkatan patogenesitas dan kemampuan virus untuk transmisi ke manusia (Campitelli et al. 006). Mekanisme virus untuk menghindar dari sistem imun hospes merupakan tekanan untuk mutasi secara gradual sehingga muncul strain-strain virus baru yang secara imunologik berbeda (hanyutan antigenik) (Munch et al. 00; Smith et al. 004). Hanyutan antigenik berjalan lambat namun progresif dan cenderung menimbulkan penyakit yang terbatas pada suatu kawasan tertentu (Tumpey et al. 00; Swayne & Suarez 003). Seperti organisme lainnya, substitusi sinonim pada virus influenza juga berkaitan dengan kelimpahan trna (Plotkin & Dushoff 003; Lavler & Kotlar 005; Wu & Freeland 005). Semakin banyak trna, kecepatan translasi semakin cepat. Namun, mengingat translasi mrna virus menggunakan mekanisme translasi sel hospes, substitusi sinonim ini lebih dikarenakan seleksi penyesuaian terhadap penggunaan kodon (codon usage) sel hospes (Garmory et al. 003). Daerah antigenik (antigenic sites) Sekuen nukleotida gen hemaglutinin dan turunan asam aminonya dari 9 VAI subtipe H5N isolat unggas air terlihat pada Gambar -9. Asam amino daerah antigenik pada 5 isolat VAI unggas air (IPB-RS s/d IPB5-RS) sama dengan isolat Gs/GD//96. Isolat VAI IPB6-RS mengalami substitusi nonsinonim pada 4 asam amino daerah antigenik (N45D, S84N, H38Q dan R40S), sementara 3 isolat VAI unggas air lainnya (IPB7-RS, IPB8-RS dan IPB9-RS) mengalami substitusi nonsinonim pada 8 asam amino daerah antigenik (N45D, S84N, A86T, N4D, H38L, R40S, S4P dan K89R) (Tabel ).

79 Tabel. Asam amino daerah antigenik pada hemaglutinin virus avian influenza subtipe H5N isolat unggas air Isolat 4 5 8 3 8 4 8 6 4 Daerah antigenik * 3 3 4 5 9 7 8 0 Gs/GD//96 N A S A S N H S Y H R S S K K S A IPB-RS (entok) N A S A S N H S Y H R S S K K S A IPB-RS (angsa) N A S A S N H S Y H R S S K K S A IPB3-RS (itik) N A S A S N H S Y H R S S K K S A IPB4-RS (angsa) N A S A S N H S Y H R S S K K S A IPB5-RS (entok) N A S A S N H S Y H R S S K K S A IPB6-RS (itik) D A N A S N H S Y Q S S S K K S A IPB7-RS (angsa) D A N T S D H S Y L S P S R K S A IPB8-RS (itik) D A N T S D H S Y L S P S R K S A IPB9-RS (itik) D A N T S D H S Y L S P S R K S A * Penomoran menurut H5. (Guan et al. 004; Hoffman et al. 005; WHO 005b; Campitelli et al. 006; Smith et al. 006a) 4 5 5 8 9 3 6 3 Substitusi asam amino pada daerah antigenik meningkatkan potensi terjadinya hanyutan antigenik, karena berkaitan dengan mekanisme virus untuk menghindar dari respon imun hospes. Substitusi ini disebabkan tekanan seleksi untuk menghindar dari respon antibodi hospes, termasuk penghindaran pengenalan antibodi yang terbentuk akibat vaksinasi atau infeksi sebelumnya (Plotkin & Dushoff 003; Smith et al. 004; Campitelli et al. 006). Substitusi asam amino pada daerah antigenik merupakan salah satu pendorong evolusi gen hemaglutinin (Shih et al. 007). Substitusi asam amino 38 dan 40 juga berhubungan dengan patogenesitas virus, karena asam amino ini juga terlibat dalam ikatan dengan reseptor (Hulse et al. 004). Substitusi N4S, L38Q dan K89R pada genotipe Z kemungkinan berhubungan dengan adaptasi virus pada mamalia (Guan et al. 004). Daerah antigenik pada asam amino 89 (R atau K) pada isolat unggas air dalam penelitian ini sama dengan isolat Hongkong, Vietnam dan Singapura (Hoffman et al. 005). Daerah antigenik pada asam amino 45, 84, 86, 4, 38, 40 dan 4 pada isolat unggas air dalam penelitian ini menunjukkan adanya polimorfisme. Daerah antigenik A-E pada asam amino 86, 38, 40 dan 4 isolat unggas dan manusia di Indonesia dan Vietnam mengalami seleksi positif (Smith et al. 006a). Analisis sekuen asam amino subunit HA pada virus

80 influenza A tahun 968-005 berhasil mengidentifikasi 95 substitusi pada 63 asam amino, dan 57 substitusi diantaranya adalah asam amino daerah antigenik (Shih et al. 007). Posisi glikosilasi (glycosilation sites) Posisi glikosilasi dari VAI H5N isolat unggas air menunjukkan bahwa asam amino nomor 84-86 dan 54-56 pada 5 isolat unggas air (IPB-RS s/d IPB5-RS) tidak berpotensi sebagai tempat penempelan oligosakarida. Asam amino isolat unggas air IPB6-RS mengalami substitusi pada A56T, sehingga terbentuk sekuen N-S-T pada asam amino 54-56 yang berpotensi sebagai posisi glikosilasi. Akibat substitusi pada A86T dan A56T pada 3 VAI isolat unggas air (IPB7-RS, IPB8-RS, IPB9-RS) menginduksi munculnya posisi glikosilasi pada asam amino 84-86 dan 54-56 (Tabel 3). Tabel 3. Sekuen asam amino hemaglutinin virus avian influenza subtipe H5N isolat unggas air yang berpotensi sebagai posisi glikosilasi Posisi glikosilasi* Isolat 0-3- 5 84-86 54-56 65-67 93-95 86-88 Gs/GD//96 NNS NVT - - NNT NPT NSS IPB-RS (entok) NNS NVT - - NNT NPT NSS IPB-RS (angsa) NNS NVT - - NNT NPT NSS IPB3-RS (itik) NNS NVT - - NNT NPT NSS IPB4-RS (angsa) NNS NVT - - NNT NPT NSS IPB5-RS (entok) - - NNT NPT NSS IPB6-RS (itik) - NST NNT NPT NSS IPB7-RS (angsa) NPT NST NNT NPT NSS IPB8-RS (itik) NPT NST NNT NPT NSS IPB9-RS (itik) NPT NST NNT NPT NSS * Penomoran menurut H5. (Matrosovich et al. 999; WHO 005b; Campitelli et al. 006; Gambaryan et al. 006; Smith et al. 006a; Stevens et al. 006).

8 Posisi glikosilasi pada asam amino posisi 54-56 dan 93-95 berdekatan dengan daerah antigenik dan residu pengikat reseptor, sehingga mempengaruhi afinitas ikatan pada reseptor dan mekanisme virus menghindar respon imun hospes (Matrosovich et al. 999; WHO 005b; Campitelli et al. 006; Gambaryan et al. 006; Smith et al. 006a). Substitusi pada A56T pada VAI H5N garis Asia dihubungkan dengan adaptasi virus pada hospes unggas darat dan meningkatkan virulensi pada unggas darat ini (WHO 005b; Smith et al. 006a; Stevens et al. 006). Posisi glikosilasi pada asam amino 84-86 merupakan mekanisme VAI untuk menghindar pengenalan daerah antigenik oleh antibodi (WHO 005b; Smith et al. 006a). Kantong pengikat reseptor (receptor binding pocket) Kantong pengikat reseptor adalah asam amino yang terlibat mempertahankan integritas struktur residu pengikat reseptor. Secara struktural, terdapat 3 elemen dasar kantong pengikat reseptor VAI H5N yaitu α-helix (asam amino HA 88-90), loop-30 (asam amino HA 34-38) dan loop-0 (asam amino HA -8) (Stevens et al. 006). Substitusi asam amino kantong pengikat reseptor menyebabkan perubahan struktur sekunder protein sehingga mempengaruhi afinitas ikatan virus pada reseptor (Harvey et al. 004; Gambaryan et al. 006; Auewarakul et al. 007). Virus AI strain avian yang mengalami perubahan afinitas pada reseptor hospes berpeluang memunculkan strain virus yang berafinitas tinggi pada reseptor sel mamalia (Campitelli et al. 006). Virus AI subtipe H5N isolat unggas air (IPB-RS, IPB-RS, IPB3-RS, IPB4-RS dan IPB5-RS), mengalami 3 substitusi nonsinonim pada asam amino kantong pengikat reseptor (L75M, EK dan P7S). VAI H5N isolat IPB6- RS mengalami 7 substitusi nonsinonim asam amino kantong pengikat reseptor (D94N, T08I, D6E, H38Q, R40S, EK dan P7S). Tiga VAI H5N isolat unggas air (IPB7-RS, IPB8-RS, IPB9-RS) mengalami substitusi nonsinonim pada 0 asam amino pembentuk kantong pengikat reseptor (D94S, T08I, N4D, D6E, H38L, R40S, D83N, K89R, EK dan P7S) (Tabel 4).

8 Tabel 4. Asam amino pembentuk kantong pengikat reseptor pada hemaglutinin virus avian influenza subtipe H5N isolat unggas air Isolat 9 4 9 7 0 8 4 6 9 3 0 3 3 8 Kantong pengikat reseptor * 4 0 4 9 Gs/GD//96 D D T N D S G S H R W I L H D E T K L E P K G Q S G A IPB-RS (entok) D D T N D S G S H R W I M H D E T K L K S K G Q S G A IPB-RS (angsa) D D T N D S G S H R W I M H D E T K L K S K G Q S G A IPB3-RS (itik) D D T N D S G S H R W I M H D E T K L K S K G Q S G A IPB4-RS (angsa) D D T N D S G S H R W I M H D E T K L K S K G Q S G A IPB5-RS (entok) D D T N D S G S H R W I M H D E T K L K S K G Q S G A IPB6-RS (itik) N D I N E S G S Q S W I L H D E T K L K S K G Q S G A IPB7-RS (angsa) S D I D E S G S L S W I L H N E T R L K S K G Q S G A IPB8-RS (itik) S D I D E S G S L S W I L H N E T R L K S K G Q S G A IPB9-RS (itik) S D I D E S G S L S W I L H N E T R L K S K G Q S G A * Penomoran menurut H5. (Hulse et al. 004; WHO 005b; Campitelli et al. 006; Gambaryan et al. 006; Smith et al. 006a; Stevens et al. 006). 5 7 5 7 9 8 3 8 6 8 8 8 9 9 0 7 8 3 4 6 3 Patogenesitas VAI H5N pada hospes sangat dipengaruhi oleh susunan asam amino kantong pengikat reseptor. VAI H5N dengan asam amino D97, I08, E6, L38, K dan S7 menunjukkan fenotipe highly pathogenic, sementara asam amino T08, D6, H/Q38 menunjukkan fenotipe patogenik moderat (Hulse et al. 004). Tiga VAI H5N isolat unggas air (IPB7-RS, IPB8-RS dan IPB9-RS) kemungkinan mempunyai fenotipe patogenik tinggi, karena mempunyai asam amino kantong pengikat reseptor khas D97, I08, E6, L38, K dan S7 (Tabel 4). Sementara 5 VAI H5N isolat unggas air lainnya (IPB-RS s/d IPB5-RS) mempunyai asam amino khas (T08, D6, H38) penanda fenotipe patogenik moderat. Fenotipe patogenesitas VAI H5N isolat unggas air dalam penelitian ini perlu dikaji lebih lanjut dengan uji biologis. Residu pengikat reseptor (receptor binding sites) Residu pengikat reseptor pada VAI H5N isolat unggas air dalam penelitian ini adalah glutamin (Q) dan glisin (G) berturut-turut pada asam amino nomor dan 4 (Tabel 4). Residu pengikat reseptor seperti itu dianggap spesifik berikatan dengan reseptor avian α-,3neuacgal (Gambaryan et al. 006; Smith et al. 006a; Leung 007).

83 Peptida fusi (fusion peptide) Peptida fusi adalah peptida yang berperan pada fusi membran saat infeksi virus influenza ke dalam sel hospes. Sekuen asam amino peptida fusi yang terdapat pada ujung N subunit HA dari VAI H5N isolat unggas air dalam penelitian ini terdiri dari 3 asam amino kaya glisin, yaitu GLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYG. Sekuen peptida fusi VAI H5N isolat unggas air dalam penelitian ini sama dengan isolat VAI H5N penyebab wabah di Asia. Jika dibandingkan dengan peptida fusi virus influenza penyebab pandemi flu di Hongkong tahun 968 (GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG), peptida fusi ini hanya mengalami substitusi 3 asam amino selama hampir 40 tahun (Cross et al. 00; Smith et al. 006a). Peptida ini bersifat stabil pada semua influenza A (Cross et al. 00). Adanya variasi domain-domain spesifik daerah antigenik, posisi glikosilasi dan kantong pengikat reseptor pada VAI H5N isolat unggas air dalam penelitian ini, mengindikasikan bahwa unggas air merupakan tempat evolusi bagi virus ini. Liu (007) menyatakan bahwa virus influenza tidak selamanya bersifat stasis secara evolusioner pada hospes alami, dan biologi virus dapat berubah secara dramatis pada unggas air domestik. VAI subtipe H5N pada unggas air di Cina secara progresif menunjukkan peningkatan patogenesitas pada hewan model mencit (Chen et al. 004). Strurm-Ramirez et al (005) juga melaporkan bahwa VAI H5N isolat itik di Asia tahun 00-004 tidak hanya bereplikasi pada saluran pencernaan tetapi juga pada saluran respirasi bagian atas. Dengan demikian, evolusi biologis secara in vivo VAI H5N isolat unggas air dalam penelitian ini perlu diteliti lebih lanjut.

84 SIMPULAN Domain asam amino daerah antigenik, posisi glikosilasi dan kantong pengikat reseptor virus avian influenza subtipe H5N isolat unggas air yang dianalisis menunjukkan adanya polimorfisme. Sedangkan pada domain residu pengikat reseptor, semua isolat mempunyai glutamin (Q) dan glisin (G) berturutturut pada asam amino nomor dan 4. Temuan-temuan tersebut menunjukkan dengan jelas bahwa unggas air berperan sebagai tempat evolusi virus AI, namun spesifisitas reseptor avian α-,3neuacgal masih tetap dipertahankan. SARAN Perlu segera dilakukan penelitian lebih lanjut evolusi biologis virus avian influenza subtipe H5N isolat unggas air secara in vivo.

85 HA ATG GAG AAA ATA GTG CTT CTT CTT GCA ATA GTC AGT CCT GTT AAA AGT GAT CAG ATT TGC M E K I V L L L A I V S P V K S D Q I C 4 ATT GGT TAC CAT GCA AAC AAC TCG ACA GAG CAG GTT GAC ACA ATA ATG GAA AAG AAC GTT I G Y H A N N S T E Q V D T I M E K N V 4 ACT GTT ACA CAT GCC CAA GAC ATA CTG GAA AAG ACA CAC AAC GGG AAG CTC TGC GAT CTA T V T H A Q D I L E K T H N G K L C D L 44 AAT GGA GTG AAG CCT CTC ATT TTG AGA GAT TGT AGT GTA GCT GGA TGG CTC CTC GGA AAC N G V K P L I L R D C S V A G W L L G N 64 CCT ATG TGT GAC GAA TTC ATC AAT GTG CCG GAA TGG TCT TAC ATA GTG GAG AAG GCC AGT P M C D E F I N V P E W S Y I V E K A S 84 CCA GCC AAT GAC CTC TGT TAC CCA GGG GAT TTC AAC GAC TAT GAA GAA CTG AAA CAC CTA P A N D L C Y P G D F N D Y E E L K H L 04 TTG AGC AGC ACA AAC CAT TTT GAG AAA ATT CAG ATC ATC CCC AAA AGT TCT TGG TCC AAT L S S T N H F E K I Q I I P K S S W S N 4 CAT GAT GCC TCA TCA GGG GTG AGC TCA GCA TGT CCA TAC CAT GGG AGG TCC TCC TTT TTC H D A S S G V S S A C P Y H G R S S F F 44 AGA AAT GTG GTA TGG CTT ATC AAA AAG AAC AGT GCA TAC CCA ACA ATA AAG AGG AGC TAC R N V V W L I K K N S A Y P T I K R S Y 64 AAT AAT ACC AAC CAA GAA GAT CTT TTG GTA ATG TGG GGG ATT CAC CAT CCT AAT GAT GCG N N T N Q E D L L V M W G I H H P N D A 84 GCA GAG CAG ACA AAG CTC TAT CAA AAC CCA ACC ACC TAT ATT TCC ATT GGG ACA TCA ACA A E Q T K L Y Q N P T T Y I S I G T S T 04 CTA AAC CAG AGA TTG GTA CCA AAA ATA GCT ACT AGA TCC AAA GTA AAC GGG CAA AGT GGA L N Q R L V P K I A T R S K V N G Q S G 4 AGG ATG GAG TTC TTC TGG ACA ATT TTA AAA CCT AAT GAT GCA ATC AAC TTC GAG AGT AAT R M E F F W T I L K P N D A I N F E S N 44 GGA AAT TTC ATT GCT CCA GAA TAT GCA TAC AAA ATT GTC AAG AAA GGG GAC TCA GCA ATT G N F I A P E Y A Y K I V K K G D S A I 64 ATG AAA AGT GAA TTG GAA TAT GGT AAC TGC AAC ACC AAG TGT CAA ACT CCA ATG GGG GCG M K S E L E Y G N C N T K C Q T P M G A 84 ATA AAC TCT AGT ATG CCA TTC CAC AAC ATA CAC CCT CTC ACC ATC GGG GAA TGC CCC AAA I N S S M P F H N I H P L T I G E C P K 304 TAT GTG AAA TCA AAC AGA TTA GTC CTT GCG ACT GGA CTC AGA AAT ACC CCT CAA AGA GAG Y V K S N R L V L A T G L R N T P Q R E 34 HA AGA AGA AGA AAA AAG AGA GGA CTA TTT GGA GCT ATA GCA GGT TTT ATA GAG GGA GGA TGG R R R K K R G L F G A I A G F I E G G W 4 CAG GGA ATG GTA GAT GGT TGG TAT GGG TAC CAC CAT AGC AAT GAG CAG GGG AGT GGG TAC Q G M V D G W Y G Y H H S N E Q G S G Y 34 GCT GCA GAC AAA GAA TCC ACT CAA AAG GCA ATA GAT GGA GTC ACC AAT AAG GTC AAC TCA A A D K E S T Q K A I D G V T N K V N S 54 ATT ATT GAC AAA ATG AAC ACT CAG GTT GAA GGC TAT I I D K M N T Q V E G Y 66 : daerah antigenic : residu pengikat reseptor :kantong pengikat reseptor : daerah pemotongan : batas subunit HA : peptida fusi Garis bawah: posisi glikosilasi : signal promoter Gambar. Gen penyandi hemaglutinin dan turunan asam aminonya virus isolat A/muscovy duck/klapanunggal/ipb-rs/006(h5n)

86 HA ATG GAG AAA ATA GTG CTT CTT CTT GCA ATA GTC AGT CTT GTT AAA AGT GAT CAG ATT TGC M E K I V L L L A I V S L V K S D Q I C 4 ATT GGT TAC CAT GCA AAC AAC TCG ACA GAG CAG GTT GAC ACA ATA ATG GAA AAG AAC GTT I G Y H A N N S T E Q V D T I M E K N V 4 ACT GTT ACA CAT GCC CAA GAC ATA CTG GAA AAG ACA CAC AAC GGG AAG CTC TGC GAT CTA T V T H A Q D I L E K T H N G K L C D L 44 AAT GGA GTG AAG CCT CTC ATT TTG AGA GAT TGT AGT GTA GCT GGA TGG CTC CTC GGA AAC N G V K P L I L R D C S V A G W L L G N 64 CCT ATG TGT GAC GAA TTC ATC AAT GTG CCG GAA TGG TCT TAC ATA GTG GAG AAG GCC AGT P M C D E F I N V P E W S Y I V E K A S 84 CCA GCC AAT GAC CTC TGT TAC CCA GGG GAT TTC AAC GAC TAT GAA GAA CTG AAA CAC CTA P A N D L C Y P G D F N D Y E E L K H L 04 TTG AGC AGC ACA AAC CAT TTT GAG AAA ATT CAG ATC ATC CCC AAA AGT TCT TGG TCC AAT L S S T N H F E K I Q I I P K S S W S N 4 CAT GAT GCC TCA TCA GGG GTG AGC TCA GCA TGT CCA TAC CAT GGG AGG TCC TCC TTT TTC H D A S S G V S S A C P Y H G R S S F F 44 AGA AAT GTG GTA TGG CTT ATC AAA AAG AAC AGT GCA TAC CCA ACA ATA AAG AGG AGC TAC R N V V W L I K K N S A Y P T I K R S Y 64 AAT AAT ACC AAC CAA GAA GAT CTT TTG GTA ATG TGG GGG ATT CAC CAT CCT AAT GAT GCG N N T N Q E D L L V M W G I H H P N D A 84 GCA GAG CAG ACA AAG CTC TAT CAA AAC CCA ACC ACC TAT ATT TCC ATT GGG ACA TCA ACA A E Q T K L Y Q N P T T Y I S I G T S T 04 CTA AAC CAG AGA TTG GTA CCA AAA ATA GCT ACT AGA TCC AAA GTA AAC GGG CAA AGT GGA L N Q R L V P K I A T R S K V N G Q S G 4 AGG ATG GAG TTC TTC TGG ACA ATT TTA AAA CCT AAT GAT GCA ATC AAC TTC GAG AGT AAT R M E F F W T I L K P N D A I N F E S N 44 GGA AAT TTC ATT GCT CCA GAA TAT GCA TAC AAA ATT GTC AAG AAA GGG GAC TCA GCA ATT G N F I A P E Y A Y K I V K K G D S A I 64 ATG AAA AGT GAA TTG GAA TAT GGT AAC TGC AAC ACC AAG TGT CAA ACT CCA ATG GGG GCG M K S E L E Y G N C N T K C Q T P M G A 84 ATA AAC TCT AGT ATG CCA TTC CAC AAC ATA CAC CCT CTC ACC ATC GGG GAA TGC CCC AAA I N S S M P F H N I H P L T I G E C P K 304 TAT GTG AAA TCA AAC AGA TTA GTC CTT GCG ACT GGG CTC AGA AAT AGC CCT CAA AGA GAG Y V K S N R L V L A T G L R N S P Q R E 34 HA AGA AGA AGA AAA AAG AGA GGA CTA TTT GGA GCT ATA GCA GGT TTT ATA GAG GGA GGA TGG R R R K K R G L F G A I A G F I E G G W 4 CAG GGA ATG GTA GAT GGT TGG TAT GGG TAC CAC CAT AGC AAT GAG CAG GGG AGT GGG TAC Q G M V D G W Y G Y H H S N E Q G S G Y 34 GCT GCA GAC AAA GAA TCC ACT CAA AAG GCA ATA GAT GGA GTC ACC AAT AAG GTC AAC TCA A A D K E S T Q K A I D G V T N K V N S 54 ATT ATT GAC AAA ATG AAC ACT CAG GTT GAG GCT I I D K M N T Q V E A 65 : daerah antigenik : residu pengikat reseptor :kantong pengikat reseptor :daerah pemotongan : batas subunit HA :peptida fusi Garis bawah: posisi glikosilasi :signal promoter Gambar. Gen penyandi hemaglutinin dan turunan asam aminonya virus isolat A/goose/Bojonggenteng/IPB-RS/006(H5N)

87 HA GAG AAA ATA GTG CTT CTT CTT GCA ATA GTC AGT CTT GTT AAA AGT GAT CAG ATT TGC ATT E K I V L L L A I V S L V K S D Q I C I 5 GGT TAC CAT GCA AAC AAC TCG ACA GAG CAG GTT GAC ACA ATA ATG GAA AAG AAC GTT ACT G Y H A N N S T E Q V D T I M E K N V T 5 GTT ACA CAT GCC CAA GAC ATA CTG GAA AAG ACA CAC AAC GGG AAG CTC TGC GAT CTA AAT V T H A Q D I L E K T H N G K L C D L N 45 GGA GTG AAG CCT CTC ATT TTG AGA GAT TGT AGT GTA GCT GGA TGG CTC CTC GGA AAC CCT G V K P L I L R D C S V A G W L L G N P 65 ATG TGT GAC GAA TTC ATC AAT GTG CCG GAA TGG TCT TAC ATA GTG GAG AAG GCC AGT CCA M C D E F I N V P E W S Y I V E K A S P 85 GCC AAT GAC CTC TGT TAC CCA GGG GAT TTC AAC GAC TAT GAA GAA CTG AAA CAC CTA TTG A N D L C Y P G D F N D Y E E L K H L L 05 AGC AGC ACA AAC CAT TTT GAG AAA ATT CAG ATC ATC CCC AAA AGT TCT TGG TCC AAT CAT S S T N H F E K I Q I I P K S S W S N H 5 GAT GCC TCA TCA GGG GTG AGC TCA GCA TGT CCA TAC CAT GGG AGG TCC TCC TTT TTC AGA D A S S G V S S A C P Y H G R S S F F R 45 AAT GTG GTA TGG CTT ATC AAA AAG AAC AGT GCA TAC CCA ACA ATA AAG AGG AGC TAC AAT N V V W L I K K N S A Y P T I K R S Y N 65 AAT ACC AAC CAA GAA GAT CTT TTG GTA ATG TGG GGG ATT CAC CAT CCT AAT GAT GCG GCA N T N Q E D L L V M W G I H H P N D A A 85 GAG CAG ACA AAG CTC TAT CAA AAC CCA ACC ACC TAT ATT TCC ATT GGG ACA TCA ACA CTA E Q T K L Y Q N P T T Y I S I G T S T L 05 AAC CAG AGA TTG GTA CCA AAA ATA GCT ACT AGA TCC AAA GTA AAC GGG CAA AGT GGA AGG N Q R L V P K I A T R S K V N G Q S G R 5 ATG GAG TTC TTC TGG ACA ATT TTA AAA CCT AAT GAT GCA ATC AAC TTC GAG AGT AAT GGA M E F F W T I L K P N D A I N F E S N G 45 AAT TTC ATT GCT CCA GAA TAT GCA TAC AAA ATT GTC AAG AAA GGG GAC TCA GCA ATT ATG N F I A P E Y A Y K I V K K G D S A I M 65 AAA AGT GAA TTG GAA TAT GGT AAC TGC AAC ACC AAG TGT CAA ACT CCA ATG GGG GCG ATA K S E L E Y G N C N T K C Q T P M G A I 85 AAC TCT AGT ATG CCA TTC CAC AAC ATA CAC CCT CTC ACC ATC GGG GAA TGC CCC AAA TAT N S S M P F H N I H P L T I G E C P K Y 305 GTG AAA TCA AAC AGA TTA GTC CTT GCG ACT GGA CTC AGA AAT ACC CCT CAA AGA GAG AGA V K S N R L V L A T G L R N T P Q R E R 35 HA AGA AGA AAA AAG AGA GGA CTA TTT GGA GCT ATA GCA GGT TTT ATA GAG GGA GGA TGG CAG R R K K R G L F G A I A G F I E G G W Q 5 GGA ATG GTA GAT GGT TGG TAT GGG TAC CAC CAT AGC AAT GAG CAG GGG AGT GGG TAC GCT G M V D G W Y G Y H H S N E Q G S G Y A 35 GCA GAC AAA GAA TCC ACT CAA AAG GCA ATA GAT GGA GTC ACC AAT AAG GTC AAC TCA ATT A D K E S T Q K A I D G V T N K V N S I 55 ATT GAC AAA ATG AAC ACT CAG GTT GAG GCT I D K M N T Q V E A 65 :daerah antigenik : residu pengikat reseptor :kantong pengikat reseptor :daerah pemotongan : batas subunit HA : peptida fusi Garis bawah: posisi glikosilasi : signal promoter Gambar 3. Gen penyandi hemaglutinin dan turunan asam aminonya virus isolat A/duck/Leuwiliang/IPB3-RS/006(H5N)

88 HA AAA ATA GTG CTT CTT CTT GCA ATA GTC AGT CTT GTT AAA AGT GAT CAG ATT TGC ATT GGT K I V L L L A I V S L V K S D Q I C I G 6 TAC CAT GCA AAC AAC TCG ACA GAG CAG GTT GAC ACA ATA ATG GAA AAG AAC GTT ACT GTT Y H A N N S T E Q V D T I M E K N V T V 6 ACA CAT GCC CAA GAC ATA CTG GAA AAG ACA CAC AAC GGG AAG CTC TGC GAT CTA AAT GGA T H A Q D I L E K T H N G K L C D L N G 46 GTG AAG CCT CTC ATT TTG AGA GAT TGT AGT GTA GCT GGA TGG CTC CTC GGA AAC CCT ATG V K P L I L R D C S V A G W L L G N P M 66 TGT GAC GAA TTC ATC AAT GTG CCG GAA TGG TCT TAC ATA GTG GAG AAG GCC AGT CCA GCC C D E F I N V P E W S Y I V E K A S P A 86 AAT GAC CTC TGT TAC CCA GGG GAT TTC AAC GAC TAT GAA GAA CTG AAA CAC CTA TTG AGC N D L C Y P G D F N D Y E E L K H L L S 06 AGC ACA AAC CAT TTT GAG AAA ATT CAG ATC ATC CCC AAA AGT TCT TGG TCC AAT CAT GAT S T N H F E K I Q I I P K S S W S N H D 6 GCC TCA TCA GGG GTG AGC TCA GCA TGT CCA TAC CAT GGG AGG TCC TCC TTT TTC AGA AAT A S S G V S S A C P Y H G R S S F F R N 46 GTG GTA TGG CTT ATC AAA AAG AAC AGT GCA TAC CCA ACA ATA AAG AGG AGC TAC AAT AAT V V W L I K K N S A Y P T I K R S Y N N 66 ACC AAC CAA GAA GAT CTT TTG GTA ATG TGG GGG ATT CAC CAT CCT AAT GAT GCG GCA GAG T N Q E D L L V M W G I H H P N D A A E 86 CAG ACA AAG CTC TAT CAA AAC CCA ACC ACC TAT ATT TTC ATT GGG ACA TCA ACA CTA AAC Q T K L Y Q N P T T Y I F I G T S T L N 06 CAG AGA TTG GTA CCA AAA ATA GCT ACT AGA TCC AAA GTA AAC GGG CAA AGT GGA AGG ATG Q R L V P K I A T R S K V N G Q S G R M 6 GAG TTC TTC TGG ACA ATT TTA AAA CCT AAT GAT GCA ATC AAC TTC GAG AGT AAT GGA AAT E F F W T I L K P N D A I N F E S N G N 46 TTC ATT GCT CCA GAA TAT GCA TAC AAA ATT GTC AAG AAA GGG GAC TCA GCA ATT ATG AAA F I A P E Y A Y K I V K K G D S A I M K 66 AGT GAA TTG GAA TAT GGT AAC TGC AAC ACC AAG TGT CAA ACT CCA ATG GGG GCG ATA AAC S E L E Y G N C N T K C Q T P M G A I N 86 TCT AGT ATG CCA TTC CAC AAC ATA CAC CCT CTC ACC ATC GGG GAA TGC CCC AAA TAT GTG S S M P F H N I H P L T I G E C P K Y V 306 AAA TCC AAC CGA TTA GTC CTT GCG ACT GGA CTC AGA AAT ACC CCT CAA AGA GAG AGA AGA K S N R L V L A T G L R N T P Q R E R R 36 HA AGA AAA AAG AGA GGA CTA TTT GGA GCT ATA GCA GGT TTT ATA GAG GGA GGA TGG CAG GGA R K K R G L F G A I A G F I E G G W Q G 6 ATG GTA GAT GGT TGG TAT GGG TAC CAC CAT AGC AAT GAG CAG GGG AGT GGG TAC GCT GCA M V D G W Y G Y H H S N E Q G S G Y A A 36 GAC AAA GAA TCC ACT CAA AAG GCA ATA GAT GGA GTC ACC AAT AAG GTC AAC TCA D K E S T Q K A I D G V T N K V N S 54 :daerah antigenik : residu pengikat reseptor :kantong pengikat reseptor :daerah pemotongan : batas subunit HA :peptida fusi Garis bawah: posisi glikosilasi :signal promoter Gambar 4. Gen penyandi hemaglutinin dan turunan asam aminonya virus isolat A/goose/Leuwiliang/IPB4-RS/006(H5N)

89 HA ACA CAT GCT CAG GAC ATA CTG GAA AAG ACA CAC AAC GGG AAG CTC TGC GAT CTA AAT GGA T H A Q D I L E K T H N G K L C D L N G 46 GTG AAG CCT CTC ATT TTG AGA GAT TGT AGT GTA GCT GGA TGG CTC CTC GGA AAC CCT ATG V K P L I L R D C S V A G W L L G N P M 66 TGT GAC GAA TTC ATC AAT GTG CCG GAA TGG TCT TAC ATA GTG GAG AAG GCC AGT CCA GCC C D E F I N V P E W S Y I V E K A S P A 86 AAT GAC CTC TGT TAC CCA GGG GAT TTC AAC GAC TAT GAA GAA CTG AAA CAC CTA TTG AGC N D L C Y P G D F N D Y E E L K H L L S 06 AGC ACA AAC CAT TTT GAG AAA ATT CAG ATC ATC CCC AAA AGT TCT TGG TCC AAT CAT GAT S T N H F E K I Q I I P K S S W S N H D 6 GCC TCA TCA GGG GTG AGC TCA GCA TGT CCA TAC CAT GGG AGG TCC TCC TTT TTC AGA AAT A S S G V S S A C P Y H G R S S F F R N 46 GTG GTA TGG CTT ATC AAA AAG AAC AGT GCA TAC CCA ACA ATA AAG AGG AGC TAC AAT AAT V V W L I K K N S A Y P T I K R S Y N N 66 ACC AAC CAA GAA GAT CTT TTG GTA ATG TGG GGG ATT CAC CAT CCT AAT GAT GCG GCA GAG T N Q E D L L V M W G I H H P N D A A E 86 CAG ACA AAG CTC TAT CAA AAC CCA ACC ACC TAC ATT TCC GTT GGA ACA TCA ACA ATA AAT Q T K L Y Q N P T T Y I S V G T S T I N 06 CAA AGG TTG GTA CCA AAA ATA GCT ACT AGA TCC AAA GTA AAC GGG CAA AGT GGA AGG ATG Q R L V P K I A T R S K V N G Q S G R M 6 GAG TTC TTC TGG ACA ATT TTA AAA CCT AAT GAT GCA ATC AAC TTC GAG AGT AAT GGA AAT E F F W T I L K P N D A I N F E S N G N 46 TTC ATT GCT CCA GAA TAT GCA TAC AAA ATT GTC AAG AAA GGG GAC TCA GCA ATT ATG AAA F I A P E Y A Y K I V K K G D S A I M K 66 AGT GAA TTG GAA TAT GGT AAC TGC AAC ACC AAG TGT CAA ACT CCA ATG GGG GCG ATA AAC S E L E Y G N C N T K C Q T P M G A I N 86 TCT AGT ATG CCA TTC CAC AAC ATA CAC CCT CTC ACC ATC GGG GAA TGC CCC AAA TAT GTG S S M P F H N I H P L T I G E C P K Y V 306 AAA TCA AAC AGA TTA ATC CTT GCG ACT GGA CTC AGA AAT ACC CCT CAA AGA GAG AGA AGA K S N R L I L A T G L R N T P Q R E R R 36 HA AGA AAA AAG AGA GGA CTA TTT GGA GCT ATA GCA GGT TTT ATA GAG GGA GGA TGG CAG GGA R K K R G L F G A I A G F I E G G W Q G 6 ATG GTA GAT GGT TGG TAT GGG TAC CAC CAT AGC AAT GAG CAG GGG AGT GGG TAC GCT GCA M V D G W Y G Y H H S N E Q G S G Y A A 36 GAC AAA GAA TCC ACT CAA AAG GCA ATA GAT GGA GTC ACC AAT AAG GTC AAC TCG D K E S T Q K A I D G V T N K V N S 54 :daerah antigenik : residu pengikat reseptor :kantong pengikat reseptor :daerah pemotongan : batas subunit HA : peptida fusi Garis bawah: posisi glikosilasi Gambar 5. Gen penyandi hemaglutinin dan turunan asam aminonya virus isolat A/muscovy duck/cileungsi/ipb5-rs/006(h5n)

90 HA ACA CAT GCT CAA GAC ATA CTG GAA AAG ACA CAC AAC GGG AAG CTC TGC GAT CTA GAT GGA T H A Q D I L E K T H N G K L C D L D G 46 GTG AAG CCT CTA ATT TTG AGA GAT TGT AGT GTA GCT GGA TGG CTC CTC GGA AAC CCA ATG V K P L I L R D C S V A G W L L G N P M 66 TGT GAC GAA TTC ATC AAT GTG CCG GAA TGG TCT TAC ATA GTG GAG AAG GCC AAT CCA GCC C D E F I N V P E W S Y I V E K A N P A 86 AAT GAC CTC TGT TAC CCA GGG AAT TTC AAC GAC TAT GAA GAA CTG AAA CAC CTA TTG AGC N D L C Y P G N F N D Y E E L K H L L S 06 AGA ATA AAC CAT TTT GAG AAA ATT CAA ATC ATC CCC AAA AGT TCT TGG TCC AAT CAT GAA R I N H F E K I Q I I P K S S W S N H E 6 GCC TCA TCA GGG GTG AGC TCA GCA TGT CCA TAC CAG GGA AGT TCC TCC TTT TTT AGA AAT A S S G V S S A C P Y Q G S S S F F R N 46 GTG GTA TGG CTT ATC AAA AAG AAC AGT ACA TAC CCA ACA ATA AAG AGG AGC TAC AAT AAT V V W L I K K N S T Y P T I K R S Y N N 66 ACC AAC CAA GAA GAT CTT TTG GTA CTG TGG GGA ATT CAC CAT CCT AAT GAT GCG GCA GAG T N Q E D L L V L W G I H H P N D A A E 86 CAG ACA AAG CTA TAT CAA AAC CCA ACC ACC TAT ATT TCC GTT GGA ACA TCA ACA CTA AAC Q T K L Y Q N P T T Y I S V G T S T L N 06 CAA AGA TTG GTA CCA AAA ATA GCT ACT AGA TCC AAA GTA AAC GGG CAA AGT GGA AGG ATG Q R L V P K I A T R S K V N G Q S G R M 6 GAG TTC TTC TGG ACA ATT TTA AAA CCT AAT GAT GCA ATC AAC TTC GAG AGT AAT GGA AAT E F F W T I L K P N D A I N F E S N G N 46 TTC ATT GCT CCA GAA TAT GCA TAC AAA ATT GTC AAG AAA GGG GAC TCA GCA ATT ATG AAA F I A P E Y A Y K I V K K G D S A I M K 66 AGT GAA TTG GAA TAT GGT AAC TGC AAC ACC AAG TGT CAA ACT CCA ATG GGG GCG ATA AAC S E L E Y G N C N T K C Q T P M G A I N 86 TCT AGT ATG CCA TTC CAC AAC ATA CAC CCT CTC ACC ATC GGG GAA TGC CCC AAA TAT GTG S S M P F H N I H P L T I G E C P K Y V 306 AAA TCA AAC AGA TTA GTC CTT GCG ACT GGG CTC AGA AAT AGC CCT CAA AGA GAG AGA AGA K S N R L V L A T G L R N S P Q R E R R 36 HA AGA AAA AAG AGA GGA CTA TTT GGA GCT ATA GCA GGT TTT ATA GAA GGA GGA TGG CAG GGG R K K R G L F G A I A G F I E G G W Q G 6 ATG GTA GAT GGT TGG TAT GGG TAC CAC CAT AGC AAT GAG CAG GGG AGT GGG TAC GCT GCA M V D G W Y G Y H H S N E Q G S G Y A A 36 GAC AAA GAA TCC ACT CAA AAG GCA ATA GAT GGA GTC ACC AAT AAG GTC AAC TCA ATT ATT D K E S T Q K A I D G V T N K V N S I I 56 GAC AAA ATG AAC ACT CAG GTT GAG GCT ATA AAA D K M N T Q V E A I K 67 :daerah antigenik : residu pengikat reseptor :kantong pengikat reseptor :daerah pemotongan : batas subunit HA : peptida fusi Garis bawah: posisi glikosilasi Gambar 6. Gen penyandi hemaglutinin dan turunan asam aminonya virus isolat A/duck/Nagrak/IPB6-RS/006(H5N)

9 HA ACA CAT GCT CAA GAC ATA CTG GAA AAG ACA CAC AAC GGG AAG CTC TGC GAT CTA GAT GGA T H A Q D I L E K T H N G K L C D L D G 46 GTG AAG CCT CTA ATT TTA AGA GAT TGT AGT GTA GCT GGA TGG CTC CTC GGG AAC CCA ATG V K P L I L R D C S V A G W L L G N P M 66 TGT GAC GAA TTC ATC AAT GTA CCG GAA TGG TCT TAC ATA GTG GAG AAG GCC AAT CCA ACC C D E F I N V P E W S Y I V E K A N P T 86 AAT GAC CTC TGT TAC CCA GGG AGT TTC AAC GAC TAT GAA GAA CTG AAA CAC CTA TTG AGC N D L C Y P G S F N D Y E E L K H L L S 06 AGA ATA AAC CAT TTT GAG AAG ATT CAA ATC ATC CCC AAA AGT TCT TGG TCC GAT CAT GAA R I N H F E K I Q I I P K S S W S D H E 6 GCC TCA TCA GGA GTG AGC TCA GCA TGT CCA TAC CTG GGA AGT CCC TCC TTT TTT AGA AAT A S S G V S S A C P Y L G S P S F F R N 46 GTG GTA TGG CTT ATC AAA AAG AAC AGT ACA TAC CCA ACA ATA AAG AAA AGC TAC AAT AAT V V W L I K K N S T Y P T I K K S Y N N 66 ACC AAC CAA GAA GAT CTT TTG GTA CTG TGG GGA ATT CAC CAT CCT AAT AAT GCG GCA GAG T N Q E D L L V L W G I H H P N N A A E 86 CAG ACA AGG CTA TAT CAA AAC CCA ACC ACC TAT ATT TCC ATT GGG ACA TCA ACA CTA AAC Q T R L Y Q N P T T Y I S I G T S T L N 06 CAA AGA TTG GTA CCA AAA ATA GCT ACT AGA TCC AAA GTA AAC GGG CAA AGT GGA AGG ATG Q R L V P K I A T R S K V N G Q S G R M 6 GAG TTC TTC TGG ACA ATT TTA AAA CCT AAT GAT GCA ATC AAC TTC GAG AGT AAT GGA AAT E F F W T I L K P N D A I N F E S N G N 46 TTC ATT GCT CCA GAA TAT GCA TAC AAA ATT GTC AAG AAA GGG GAC TCA GCA ATT ATG AAA F I A P E Y A Y K I V K K G D S A I M K 66 AGT GAA TTG GAA TAT GGT AAC TGC AAC ACC AAG TGT CAA ACT CCA ATG GGG GCG ATA AAC S E L E Y G N C N T K C Q T P M G A I N 86 TCT AGT ATG CCA TTC CAC AAC ATA CAC CCT CTC ACC ATC GGG GAA TGC CCC AAA TAT GTG S S M P F H N I H P L T I G E C P K Y V 306 AAA TCA AAC AGA TTA GTC CTT GCG ACT GGA CTC AGA AAT ACC CCT CAA AGA GAG AGA AGA K S N R L V L A T G L R N T P Q R E R R 36 HA AGA AAA AAG AGA GGA CTA TTT GGA GCT ATA GCA GGT TTT ATA GAG GGA GGA TGG CAG GGA R K K R G L F G A I A G F I E G G W Q G 6 ATG GTA GAT GGT TGG TAT GGG TAC CAC CAT AGC AAT GAG CAG GGG AGA GGG TAC GCT GCA M V D G W Y G Y H H S N E Q G R G Y A A 36 GAC AAA GAA TCC ACT CAA AAG GCA ATA GAT GGA GTC ACC AAT AAG GTC AAC TCA ATT ATT D K E S T Q K A I D G V T N K V N S I I 56 GAC AAA ATG AAC ACC D K M N T 60 :daerah antigenik : residu pengikat reseptor :kantong pengikat reseptor :daerah pemotongan : batas subunit HA : peptida fusi Garis bawah: posisi glikosilasi Gambar 7. Gen penyandi hemaglutinin dan turunan asam aminonya virus isolat A/goose/Klapanunggal/IPB7-RS/006(H5N)

9 HA ACA CAT GCT CAG GAC ATA CTG GAA AAG ACA CAC AAC GGG AAG CTC TGC GAT CTA GAT GGA T H A Q D I L E K T H N G K L C D L D G 46 GTG AAG CCT CTA ATT TTA AGA GAT TGT AGT GTA GCT GGA TGG CTC CTC GGG AAC CCA ATG V K P L I L R D C S V A G W L L G N P M 66 TGT GAC GAA TTC ATC AAT GTA CCG GAA TGG TCT TAC ATA GTG GAG AAG GCC AAT CCA ACC C D E F I N V P E W S Y I V E K A N P T 86 AAT GAC CTC TGT TAC CCA GGG AGT TTC AAC GAC TAT GAA GAA CTG AAA CAC CTA TTG AGC N D L C Y P G S F N D Y E E L K H L L S 06 AGA ATA AAC CAT TTT GAG AAG ATT CAA ATC ATC CCC AAA AGT TCT TGG TCC GAT CAT GAA R I N H F E K I Q I I P K S S W S D H E 6 GCC TCA TCA GGA GTG AGC TCA GCA TGT CCA TAC CTG GGA AGT CCC TCC TTT TTT AGA AAT A S S G V S S A C P Y L G S P S F F R N 46 GTG GTA TGG CTT ATC AAA AAG AAC AGT ACA TAC CCA ACA ATA AAG AAA AGC TAC AAT AAT V V W L I K K N S T Y P T I K K S Y N N 66 ACC AAC CAA GAA GAT CTT TTG GTA CTG TGG GGA ATT CAC CAT CCT AAT AAT GCG GCA GAG T N Q E D L L V L W G I H H P N N A A E 86 CAG ACA AGG CTA TAT CAA AAC CCA ACC ACC TAT ATT TCC ATT GGG ACA TCA ACA CTA AAC Q T R L Y Q N P T T Y I S I G T S T L N 06 CAG AGA TTG GTA CCA AAA ATA GCT ACT AGA TCC AAA GTA AAC GGG CAA AGT GGA AGG ATG Q R L V P K I A T R S K V N G Q S G R M 6 GAG TTC TTC TGG ACA ATT TTA AAA CCT AAT GAT GCA ATC AAC TTC GAG AGT AAT GGA AAT E F F W T I L K P N D A I N F E S N G N 46 TTC ATT GCT CCA GAA TAT GCA TAC AAA ATT GTC AAG AAA GGG GAC TCA GCA ATT ATG AAA F I A P E Y A Y K I V K K G D S A I M K 66 AGT GAA TTG GAA TAT GGT AAC TGC AAC ACC AAG TGT CAA ACT CCA ATG GGG GCG ATA AAC S E L E Y G N C N T K C Q T P M G A I N 86 TCT AGT ATG CCA TTC CAC AAC ATA CAC CCT CTC ACC ATC GGG GAA TGC CCC AAA TAT GTG S S M P F H N I H P L T I G E C P K Y V 306 AAA TCA AAC AGA TTA GTC CTT GCG ACT GGA CTC AGA AAT ACC CCT CAA AGA GAG AGA AGA K S N R L V L A T G L R N T P Q R E R R HA AGA AAA AAG AGA GGA CTA TTT GGA GCT ATA GCA GGT TTT ATA GAG GGA GGA TGG CAG GGA R K K R G L F G A I A G F I E G G W Q G 6 ATG GTA GAT GGT TGG TAT GGG TAC CAC CAT AGC AAT GAG CAG GGG AGT GGG TAC GCT GCA M V D G W Y G Y H H S N E Q G S G Y A A 36 GAC AAA GAA TCC ACT CAA AAG GCA ATA GAT GGA GTC ACC AAT AAG GTC AAC TCA ATT ATT D K E S T Q K A I D G V T N K V N S I I 56 GAC AAA ATG AAC ACT CAG GTT GAG GCT ATA D K M N T Q V E A I 66 :daerah antigenik : residu pengikat reseptor :kantong pengikat reseptor :daerah pemotongan : batas subunit HA : peptida fusi Garis bawah: posisi glikosilasi Gambar 8. Gen penyandi hemaglutinin dan turunan asam aminonya virus isolat A/duck/Parung/IPB8-RS/006(H5N)

93 HA ACA CAT GCT CAA GAC ATA CTG GAA AAG ACA CAC AAC GGG AAG CTC TGC GAT CTA GAT GGA T H A Q D I L E K T H N G K L C D L D G 46 GTG AAG CCT CTA ATT TTA AGA GAT TGT AGT GTA GCT GGA TGG CTC CTC GGG AAC CCA ATG V K P L I L R D C S V A G W L L G N P M 66 TGT GAC GAA TTC ATC AAT GTA CCG GAA TGG TCT TAC ATA GTG GAG AAG GCC AAT CCA ACC C D E F I N V P E W S Y I V E K A N P T 86 AAT GAC CTC TGT TAC CCA GGG AGT TTC AAC GAC TAT GAA GAA CTG AAA CAC CTA TTG AGC N D L C Y P G S F N D Y E E L K H L L S 06 AGA ATA AAC CAT TTT GAG AAG ATT CAA ATC ATC CCC AAA AGT TCT TGG TCC GAT CAT GAA R I N H F E K I Q I I P K S S W S D H E 6 GCC TCA TCA GGA GTG AGC TCA GCA TGT CCA TAC CTG GGA AGT CCC TCC TTT TTT AGA AAT A S S G V S S A C P Y L G S P S F F R N 46 GTG GTA TGG CTT ATC AAA AAG AAC AGT ACA TAC CCA ACA ATA AAG AAA AGC TAC AAT AAT V V W L I K K N S T Y P T I K K S Y N N 66 ACC AAC CAA GAA GAT CTT TTG GTA CTG TGG GGA ATT CAC CAT CCT AAT AAT GCG GCA GAG T N Q E D L L V L W G I H H P N N A A E 86 CAG ACA AGG CTA TAT CAA AAC CCA ACC ACC TAT ATT TCC ATT GGG ACA TCA ACA CTA AAC Q T R L Y Q N P T T Y I S I G T S T L N 06 CAG AGA TTG GTA CCA AAA ATA GCT ACT AGA TCC AAA GTA AAC GGG CAA AGT GGA AGG ATG Q R L V P K I A T R S K V N G Q S G R M 6 GAG TTC TTC TGG ACA ATT TTA AAA CCT AAT GAT GCA ATC AAC TTC GAG AGT AAT GGA AAT E F F W T I L K P N D A I N F E S N G N 46 TTC ATT GCT CCA GAA TAT GCA TAC AAA ATT GTC AAG AAA GGG GAC TCA GCA ATT ATG AAA F I A P E Y A Y K I V K K G D S A I M K 66 AGT GAA TTG GAA TAT GGT AAC TGC AAC ACC AAG TGT CAA ACT CCA ATG GGG GCG ATA AAC S E L E Y G N C N T K C Q T P M G A I N 86 TCT AGT ATG CCA TTC CAC AAC ATA CAC CCT CTC ACC ATC GGG GAA TGC CCC AAA TAT GTG S S M P F H N I H P L T I G E C P K Y V 306 AAA TCA AAC AGA TTA GTC CTT GCG ACT GGA CTC AGA AAT ACC CCT CAA AGA GAG AGA AGA K S N R L V L A T G L R N T P Q R E R R 36 HA AGA AAA AAG AGA GGA CTA TTT GGA GCT ATA GCA GGT TTT ATA GAG GGA GGA TGG CAG GGA R K K R G L F G A I A G F I E G G W Q G 6 ATG GTA GAT GGT TGG TAT GGG TAC CAC CAT AGC AAT GAG CAG GGG AGT GGG TAC GCT GCA M V D G W Y G Y H H S N E Q G S G Y A A 36 GAC AAA GAA TCC ACT CAA AAG GCA ATA GAT GGA GTC ACC AAT AAG GTC AAC TCA ATT ATT D K E S T Q K A I D G V T N K V N S I I 56 GAC AAA ATG AAC ACT CAG GTT GAG GCA TAT D K M N T Q V E A Y 66 :daerah antigenik : residu pengikat reseptor :kantong pengikat reseptor :daerah pemotongan : batas subunit HA :peptida fusi Garis bawah: posisi glikosilasi Gambar 9. Gen penyandi hemaglutinin dan turunan asam aminonya virus isolat A/duck/Parung/IPB9-RS/006(H5N)