BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium dan Rumah Kaca Departemen Silvikultur, Fakultas Kehutanan, Institut Pertanian Bogor, mulai bulan Januari 2012 sampai dengan Maret 2012. 3.2 Alat dan Bahan Alat yang digunakan adalah saringan bertingkat, refrigerator, neraca analitik, cawan Petri, labu Erlenmeyer, inkubator, gelas ukur, sendok pengaduk, pipet, pinset spora, jarum ose, Laminar Air Flow Cabinet, bunsen, hot plate, autoklaf, sentrifus, pengaduk magnet, gelas kultur, mesin shaker, gunting, oven, mikroskop stereo, mikroskop binokuler, tabung film, preparat slide, plastik, dan alat hitung, sprayer, bak kecambah, kantong polibag, alat penyiram, kamera, mistar, kaliper, dan alat tulis. Bahan yang digunakan untuk media tanaman digunakan tanah podsolik merah kuning. Untuk perlakuan digunakan isolat bakteri yang berasal dari isolasi bakteri pada spora Gigaspora sp. (B. subtilis) dan Glomus sp. (E. hormaechei), inokulum fungi mikoriza Gigaspora sp. Untuk perbanyakan bakteri, bahan yang dibutuhkan adalah alkohol 75%, alumunium foil, kapas, tisu, kertas label, Nutrient Broth (tanpa agar) 10%, NaCl 0,7%, dan air steril. Untuk bahan yang digunakan dalam pewarnaan dan pengamatan infeksi akar yaitu aquades, KOH 2,5%, HCl 2%, Tryphan blue, glycerin, dan cat kuku. 3.3 Metode Pelaksanaan Penelitian 3.3.1 Persiapan media Media yang digunakan adalah tanah podsolik merah kuning. Sebelum dimasukkan ke dalam polibag, tanah dikeringkan dan diayak menggunakan saringan kemudian disangrai terlebih dahulu agar steril. Tanah steril dimasukkan ke dalam polibag berukuran 10 cm x 15 cm dan polibag diberi label sesuai dengan perlakuan.
10 3.3.2 Persiapan Awal Isolat Bakteri 3.3.2.1 Pembuatan Media Nutrien Agar Media nutrien agar dibuat dengan melarutkan bahan nutrien agar sebanyak 28 g ke dalam 1 L aquades pada gelas ukur dengan kapasitas 1 L. Untuk mempercepat pelarutan, gelas ukur tersebut diletakkan di atas pengaduk magnet. Setelah larut, lalu dituang ke labu Erlenmeyer, kemudian mulut erlenmeyer disumbat dengan kapas yang selanjutnya ditutup dengan alumunium foil kemudian disterilisasi dengan autoklaf (suhu 121 0 C dengan tekanan 1 atm). 3.3.2.2 Penyiapan Media Nutrien Agar Pada Cawan Petri Cawan Petri yang steril digunakan sebagai wadah untuk media nutrien agar. Penuangan media dilakukan di dalam laminar air flow cabinet. Setiap cawan Petri berisi kurang lebih 10 ml. Setelah media membeku cawan Petri dibalik kemudian ditutup agar uap air tidak menetes ke agar untuk menghindari kontaminasi. 3.3.2.3 Peremajaan Bakteri Koloni bakteri pada cawan Petri hasil isolasi bakteri dari spora Gigaspora sp. dan Glomus sp. dipindahkan ke dalam cawan Petri lain yang telah terisi oleh media nutrien agar dengan menggunakan jarum ose. Pemindahan koloni bakteri dilakukan dengan metode pengolesan secara zig zag, lalu diinkubasi ke dalam inkubator pada suhu 30 0 C. 3.3.2.4 Perbanyakan isolat bakteri Media nutrient broth adalah media yang digunakan untuk perbanyakan isolat bakteri, untuk membuat media 1 L dibutuhkan 13 g nutrient broth. Media tersebut dilarutkan dalam gelas ukur dengan bantuan pengaduk magnet hingga media benar-benar larut. Kemudian dimasukan ke dalam labu Erlenmeyer. Erlenmeyer yang berisi media Nutrient Broth dibungkus bagian lehernya dengan alumunium foil untuk disterilisasi dengan cara dimasukkan dalam autoklaf dengan suhu 121 C dan tekanan 1 atm selama 20 menit. Setelah disterilkan dalam autoklaf, media diangkat dan jika sudah dingin, isolat bakteri diinokulasikan ke dalam media Nutrient Broth dengan menggunakan jarum ose. Perbanyakan isolat
11 dilakukan di dalam Laminar Air Flow Cabinet untuk menghindari kontaminasi. Media yang sudah diinokulasi bakteri kemudian diletakkan di atas shaker 80 rpm selama 48 jam. Pertumbuhan bakteri dapat diketahui dengan melihat keruhnya media Nutrient Broth pada Erlenmeyer. 3.3.2.5 Pembuatan larutan isolat bakteri Media cair hasil perbanyakan bakteri yang sudah keruh dituangkan ke dalam tabung sentrifus. Sebelumnya, tabung sentrifus dibilas dengan aquades steril terlebih dahulu, hal ini dilakukan agar tabung sentrifus dalam keadaan steril. Setelah dituang, media cair hasil perbanyakan diendapkan dengan cara disentrifugasi agar bakteri mengendap di dasar tabung selama 3 menit dengan kecepatan maksimal. Kemudian cairan perbanyakan bakteri dibuang dan bakteri yang mengendap di dasar tabung diambil dan dilarutkan dengan air yang steril. 3.3.3 Isolasi Spora Mikoriza Untuk mendapatkan spora dilakukan isolasi melalui teknik penyaringan basah bertingkat. Spora yang tersaring dimasukan pada cawan Petri lalu diamati di bawah mikroskop stereo, kemudian dipisahkan dengan pinset spora dari kototankotoran yang ikut tersaring, sehingga dihasilkan spora murni dalam tabung film yang telah berisi aquades. Satu tabung film berisi minimal 50 spora untuk 1 tanaman. 3.3.4 Inokulasi mikoriza dan inokulasi bakteri Spora mikoriza dan bakteri diinokulasikan Dengan membuat 4 lubang sekitar batang semai sampai terlihat akarnya, larutan isolat bakteri dimasukkan dengan menggunakan mikro pipet sebanyak 1 ml, begitu pula dengan anakan yang mendapat perlakuan mikoriza, 1 tabung yang berisi 50 spora Gigaspora sp. dimasukkan dalam lubang mengenai akar semai, kemudian lubang ditutup kembali dengan media sapih. Begitu pula dengan perlakuan kombinasi antara mikoriza dengan bakteri, penginokulasian isolat bakteri dan spora Gigaspora sp. dimasukkan dalam lubang yang sama.
12 3.3.5 Pemeliharaan Untuk pemeliharaan dilakukan penyiraman dengan air biasa sebanyak dua kali dalam sehari (pagi dan sore) tergantung kondisi media. Jika media dalam kondisi basah atau lembab maka cukup disiram sekali saja (pagi atau sore). Untuk pengendalian hama dilakukan secara manual dengan mematikan hama. 3.3.6 Pengamatan parameter dan pengumpulan data Dalam pengamatan, parameter yang diamati adalah : (1) tinggi tanaman (2) diameter tanaman (3) biomassa akar dan pucuk (4) perhitungan IMB (Indeks Mutu Bibit) (5) NPA (6) persentase infeksi akar. 3.3.6.1 Tinggi bibit Pengukuran tinggi bibit dilakukan setiap 1 minggu sekali selama 2 bulan. Tinggi bibit diukur mulai dari titik bekas kotiledon sampai titik tumbuh tunas yang paling muda/titik tertinggi (meristem apikal) pada batang. Nilai tersebut dinyatakan dalam satuan centimeter (cm). 3.3.6.2 Diameter batang Pengukuran diameter dilakukan setiap 1 bulan sekali selama 2 bulan. Diameter diukur mulai dari 1,5 cm di atas permukaan media dengan menggunakan alat kaliper digital. Nilai tersebut dinyatakan dalam satuan milimeter (mm). 3.3.6.3 Pengukuran biomassa akar dan pucuk Biomassa akar dan pucuk dihitung dengan rumus biomassa yaitu : Biomassa = (Berat basah - berat kering)/berat basat x 100 % 3.3.6.4 Nisbah Pucuk Akar (NPA) Nilai ini menggambarkan perbandingan antara berat kering bagian pucuk dengan bagian akar bibit.
13 3.3.6.5 Indeks Mutu Bibit (IMB) Menurut Lackey dan Alm (1982) dalam Hendromono (1987), Indeks Mutu Bibit dapat dihitung dengan menggunakan rumus : IMB = A + B C/D + A/B Keterangan : IMB = Indeks Mutu Bibit A = Bobot kering pucuk (g) B = Bobot kering akar (g). C = Tinggi tanaman (cm) D = Diameter tanaman (mm) Bibit baik dan mampu bertahan di lapangan jika memiliki nilai IMB (Q) > 0.09 (Dickson et al. 1960). 3.3.6.6 Persentase infeksi akar Identifikasi persentase infeksi akar dilakukan dengan cara mengambil contoh akar yang muda (serabut) secara acak dari polibag kemudian dilakukan proses pembersihan dan pewarnaan akar. Infeksi akar ditandai dengan adanya hifa, arbuskula dan vesikel atau salah satu dari organ tersebut Menurut Setiadi et al.(1992), pengukuran persen infeksi dapat dilakukan dengan cara sebagai berikut: Akar diambil, dicuci dengan air biasa untuk melepaskan semua miselium luar. Bagian akar muda (serabut) diambil dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi atau tabung film bekas dan direndam dalam larutan KOH 2,5%, dibiarkan selama semalam atau akar sampai berwarna kuning bersih. Setelah akar berwarna kuning bersih, larutan KOH 2,5% dibuang dan akar dibilas dengan air. Setelah itu direndam dengan larutan H 2 O 2 2% selama 5 menit, lalu larutan H 2 O 2 2% dibuang dan akar dibilas dengan air, kemudian akar direndam dengan HCl 2 % selama 10 menit, tanpa di oven. Setelah 10 menit akar tidak dicuci lagi dan langsung diganti dengan larutan staining (gliserin dan aquades dengan perbandingan 7:3), ditambah dengan Trypan blue 0,05% (0,2 g dalam 1 L), kemudian dibiarkan semalam. Larutan staining dibuang dan diganti dengan larutan distaining (larutan staining tanpa Trypan blue yaitu gliserin dan aquades dengan perbandingan 1:1) selama
14 semalam. Akar kemudian dipotong-potong sepanjang 1 cm, lalu disusun pada gelas objek (1 gelas objek untuk 10 potong akar). Untuk setiap tanaman sampel dibuat tiga preparat. Selanjutnya diamati dengan mikroskop stereo. Amati potongan akar pada kaca preparat untuk setiap bidang pandang. Bidang pandang yang terinfeksi ditunjukan dengan adanya tanda-tanda seperti hifa, arbuskula maupun vesikula. Persentase akar terinfeksi dihitung dengan rumus : bidang pandang yang terinfeksi % Terinfeksi = x 100 % keseluruhan bidang pandang 3.3.7 Rancangan Percobaan Rancangan percobaan pada penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan pola faktorial teridiri dari 2 faktor. Faktor yang pertama adalah pemberian mikoriza (M) yang terdiri dari 2 taraf yaitu M0 = Tanpa mikoriza Gigaspora sp. M1 = pemberian mikoriza Gigaspora sp. Faktor kedua adalah pemberian bakteri (B) yang terdiri dari 3 taraf yaitu B0 = tanpa bakteri B1 = pemberian isolat bakteri B. subtilis B2 = pemberian isolat bakteri E. hormaechei Dengan demikian terdapat 6 kombinasi perlakuan dengan 5 kali ulangan sehingga jumlah total tanaman seluruhnya adalah 30 tanaman. Model rancangan yang digunakan pada penelitian ini adalah : Y ijk = µ + α i + β j + (αβ) ij + ε ijk Keterangan : Y ijk = Nilai pengamatan pada faktor pemberian mikoriza ke-i dan faktor pemberian bakteri ke-j pada ulangan ke-k µ = Nilai rata-rata umum αi = Nilai pengaruh faktor pemberian mikoriza ke-i βj = Nilai pengaruh faktor pemberian bakteri ke-j εijkl = Nilai galat dari unit percobaan faktor pemberian mikoriza ke-i dan faktor pemberian bakteri ke-j pada ulangan ke-k
15 Untuk mengetahui pengaruh perlakuan yang diberikan terhadap peubah yang diamati, dilakukan analisis keragaman yang diperoleh dari pengolahan data dengan menggunakan prog SAS. Kemudian bila pengaruh yang diberikan menunjukan perbedaan yang nyata maka dilakukan uji lanjut Duncan.