MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Analisis Polymerase Chain Reaction (PCR) serta analisis penciri Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) dilaksanakan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, Bagian Pemuliaan dan Genetika Ternak, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Analisis DNA berlangsung pada bulan Juli sampai November 2010. Sampel Darah Materi Sampel darah sapi Friesian Holstein berasal dari BIB Lembang, BBIB Singosari, dan BET Cipelang serta sebagai pembanding digunakan sapi Simmental, Limousin, Brahman, dan Angus yang berasal dari BET Cipelang. Sampel DNA yang digunakan merupakan koleksi sampel Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, bagian Pemuliaan dan Genetika Ternak, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Jumlah tiap sampel DNA dan asal pengambilan sampel darah disajikan pada Tabel 1. Tabel 1. Jumlah DNA dan Asal Pengambilan Sampel Darah yang Digunakan dalam Penelitian. No. Bangsa Sapi Jenis Kelamin Tipe Sapi Jumlah Sampel (ekor) Lokasi 1. Friesian Holstein Jantan Perah 17 BIB Lembang 2. Friesian Holstein Jantan Perah 32 BBIB Singosari 3. Friesian Holstein Betina Perah 40 BET Cipelang Subtotal 89 4. Simmental Betina Pedaging 13 BET Cipelang 5. Limousin Betina Pedaging 14 BET Cipelang 6. Brahman Betina Pedaging 5 BET Cipelang 7. Angus Betina Pedaging 5 BET Cipelang Subtotal 37
Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA telah dilakukan mengikuti metode phenol-cloroform (Sambrook et al., 1989). Bahan-bahan yang digunakan, yaitu 200 µl sampel darah, 1000 µl Destilata Water (DW), 40 µl Sodium Dodecyl Sulphate 10% (SDS), 10 µl Proteinase K 5 mg/ml, 1x Sodium Tris EDTA (STE), 400 µl larutan fenol, 400 µl Chloroform Isoamil Alcohol (CIAA), 80 µl NaCl 5 M, 800 µl etanol absolut, etanol 70%, 100 µl TE 80% atau Elution buffer, dan sarung tangan. Alat-alat yang digunakan, yaitu tabung vaccutainer, rak tabung vaccutainer, rak penyimpan sampel, rak tabung Eppendorf, tabung Eppendorf 1,5 ml, mikro pipet (200-1000 µl, 20-100 µl, 2-20 µl) beserta tipsnya (warna biru dan kuning), alat mikrosentrifugasi berpendingin, vortex mixer, autoclave, incubator, freezer, rotary mixer, gunting, pinset steril, dan alat tulis. Primer Primer gen GHR AluI yang digunakan dalam penelitian ini mengikuti Ge et al. (2000) yang dimodifikasi oleh Andreas (2010) dengan runutan primer forward 5 - CGCTTACTTCTGCGAGGTAGACGC-3 dan primer reverse 5 - GTCTGTGCTCACATAGCCAC-3. Amplifikasi DNA Fragmen gen GHR memiliki panjang produk PCR 298 pb pada ekson 10 bovine Growth Hormon Receptor (Gambar 4). Bahan-bahan yang digunakan meliputi 1 µl sampel DNA; 9,7 µl destilate water; 1,25 µl buffer; 0,25 µl MgCl 2 ; 0,15 µl dntps; 0,1 µl primer; dan 0,05 µl Taq. Alat-alat yang digunakan untuk amplifikasi DNA antara lain microtube, mikropipet dengan tipsnya, dan mesin thermal cycler. Analisis PCR-RFLP Bahan-bahan yang digunakan dalam analisis PCR-RFLP adalah 5 µl produk PCR fragmen gen GHR, 1 µl destilate water; 0,7 µl buffer (buffer tango); dan 0,3 µl enzim pemotong AluI. Alat-alat yang digunakan dalam analisis PCR-RFLP antara lain microtube, mikropipet dengan tipsnya, mesin thermal cycler, dan inkubator. 14
Elektroforesis Bahan-bahan yang digunakan untuk elektroforesis adalah loading dye, marker 100 pb, agarose, 0,5x TBE (1 M Tris, 0,9 M Asam Borat, 0,01 M EDTA ph 8), produk PCR, dan etidium bromide. Alat-alat yang digunakan untuk elektroforesis antara lain gelas ukur, gelas kimia, stirrer, magnet stirrer, mikro pipet 10µl dengan tipsnya, power supply electroforesis 500vA, dan alat foto UV transiluminator. Prosedur Penarikan Sampel Data Penelitian Sampel data penelitian ditarik berdasarkan kriteria bangsa, yaitu bangsa FH yang diambil dari BIB Lembang, BBIB Singosari, dan BET Cipelang, serta sapi Simmental, Limousin, Brahman, dan Angus diambil dari BET Cipelang. Pengambilan dan Penanganan Sampel Darah diambil melalui vena jugularis menggunakan jarum vennoject dan tabung vaccutainer tanpa heparin. Ethanol absolute ditambahkan pada sampel darah dengan perbandingan 1:2 dan disimpan pada suhu ruang. Ekstraksi DNA Ektraksi DNA mengikuti metode phenol-chloroform (Sambrook et al., 1989): Preparasi Sampel. Sampel darah 200 µl dimasukkan ke tabung 1,5 ml. Ethanol dihilangkan dengan menambahkan air destilasi 1000 µl. Sampel disentrifugasi 8000 rpm selama 5 menit, dan supernatan dibuang. Degradasi protein. Sebanyak 1x STE sampai volume 400 µl, 40 µl SDS 10%, dan 10 µl proteinase K 5 mg/ml ditambahkan ke dalam sampel. Campuran diinkubasi dan digoyang pelan pada suhu 55 o C selama 2 jam. Degradasi Bahan Organik. Sebanyak 400 µl larutan phenol, 400 µl chloroform:isoamyl alcohol (24:1), dan 40 µl NaCl 5M ditambahkan ke dalam sampel. Campuran digoyang pelan pada suhu ruang selama satu jam. Presipitasi DNA. Sampel disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit. Fase air dipindahkan ke dalam tabung baru sebanyak 400 µl. Molekul DNA diendapkan 15
dengan menambahkan 800 µl ethanol absolute dan 40 µl NaCl 5 M. Campuran kemudian diinkubasi pada suhu -20 o C selama satu malam. Pengendapan DNA dilakukan dengan sentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit. Endapan DNA dicuci dengan 800 µl alkohol 70%, kemudian diendapkan lagi dan dikeringkan. Sebanyak 100 µl TE 80% (Tris EDTA) ditambahkan pada DNA. Sampel DNA disimpan pada suhu -20 o C dan siap untuk digunakan. Amplifikasi DNA menggunakan mesin thermal cycler. Amplifikasi DNA Proses amplifikasi DNA secara umum menggunakan metode sebagai berikut. Satu µl sampel DNA dimasukkan ke dalam tabung PCR, kemudian ditambahkan 0,1 µl primer. Larutan dalam tabung kemudian ditambahkan dengan premix yang terdiri dari 0,15 µl dntps; 0,25 µl MgCl 2 ; 0,05 µl Taq Polymerase (real tag); 1,25 µl buffer; dan 9,7 µl DW dalam larutan total 12 µl. Tabung kemudian diinkubasi pada mesin thermal cycler dengan suhu denaturasi awal 94 o C selama 5 menit, denaturasi pada suhu 94 o C selama 45 detik, penempelan primer pada suhu 62 o C selama 45 detik, ekstensi (perpanjangan DNA baru) pada suhu 72 o C selama 1 menit, dan ekstensi (perpanjangan) akhir pada suhu 72 o C selama 5 menit. Analisis PCR-RFLP Produk PCR yang diperoleh dari hasil amplifikasi fragmen gen GHR AluI dipotong menggunakan enzim pemotong AluI (AG CT). Volume dan bahan pereaksi yang digunakan untuk setiap enzim pemotong adalah 5 µl sampel produk PCR; 1 µl DW; 0,7 µl 1x buffer enzim pemotong (buffer tango); dan 0,3 µl enzim pemotong AluI. Campuran sampel produk PCR fragmen gen GHR Alu1 dengan bahan pereaksi diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 37 o C selama ± 16 jam. Elektroforesis DNA Total dan Produk PCR -RFLP Potongan DNA produk PCR dipisahkan dengan teknik elektroforesis terhadap DNA total, produk PCR, dan produk pemotong (digested) atau PCR-RFLP dengan menggunakan gel agarose dengan konsentrasi yang berbeda. Konsentrasi agarose 1,5% digunakan untuk elektroforesis DNA total (0,45 g/30 ml dan 0,5 x TBE) dan produk PCR-RFLP 2% (0,6 g/30 ml dan 0,5 x TBE). Gel agarose dibuat 16
sesuai dengan konsentrasi yang dibutuhkan, kemudian dipanaskan dalam microwave sampai mendidih (larutan terlihat bening), larutan didinginkan dengan stirrer di atas magnet stirrer, dan ditambahkan 5 µl ethidium bromide (10 mg/ml), kemudian diletakkan di cetakan wel dan dipasang sisir untuk 16 sampel dan dibiarkan sampai membeku. Sebelum menjalankan piranti elektroforesis, sampel dimasukkan ke setiap sumur sampel, larutan atau buffer 0,5x TBE dimasukkan sampai sampel terendam, dan sampel siap dijalankan. Elektroforesis menggunakan Mupid Electroforesis yang dijalankan atau dimigrasikan dari kutub negatif (katoda) ke positif (anoda) dengan arus 100 volt selama 30 menit sampai 45 menit. Hasil elektroforesis diamati dengan bantuan sinar UV transilluminator dan hasilnya difoto. Keberadaan pita (band) yang tergambar dalam hasil elektroforesis memberikan hasil ada tidaknya DNA total, berhasil tidaknya amplifikasi PCR atau ada tidaknya variasi atau keragaman fragmen gen GHR Alu1. Analisis Data Frekuensi Genotipe dan Alel Keragaman genotipe pada setiap individu dapat ditentukan melalui pita-pita DNA yang ditemukan. Frekuensi genotipe merupakan rasio dari jumlah genotipe dari suatu populasi, sedangkan frekuensi alel merupakan rasio jumlah alel pada suatu lokus di populasi tertentu. Frekuensi genotipe dan alel gen GHR AluI dapat dihitung dengan menggunakan rumus Nei dan Kumar (2000): Keterangan: χ ii = N χ ii = Frekuensi genotipe χ i = Frekuensi alel ke-i n ii = Jumlah sampel bergenotipe ii n ij = Jumlah sampel bergenotipe ij N = Jumlah populasi χ i = N Keseimbangan Hardy-Weinberg (HW) Keseimbangan Hardy-Weinberg diuji dengan perhitungan Chi-Kuadrat (Nei, 1987). X 2 = O E E 17
Keterangan: X 2 = Nilai uji Chi-kuadrat O = Jumlah pengamatan genotipe ke-i E = Jumlah harapan genotipe ke-i Heterozigositas Derajat heterozigositas alel (Ho) dari suatu populasi dapat digunakan untuk mengestimasi keragaman genetik dengan dihitung menggunakan rumus Weir (1996) sebagai berikut: Ho = N Heterozigositas harapan (He) pada suatu populasi dapat dihitung dengan menggunakan rumus Nei dan Kumar (2000) sebagai berikut: He = 1 Keterangan : Ho = Nilai heterozigositas pengamatan He = Nilai heterozigositas harapan Xi 2 = Frekuensi homozigot q = Jumlah alel 18