Bab IV Hasil dan Pembahasan

32 Bab IV Hasil dan Pembahasan Penggunaan α-amilase dalam beberapa sektor industri mengalami peningkatan dan sekarang ini banyak diperlukan α-amilase dengan sifat yang khas dan mempunyai kemampuan untuk mendegradasi pati mentah. Salah satu tahap awal untuk menghasilkan α-amilase dalam skala besar dan sifat yang khas adalah dengan mengisolasi gen pengkode α-amilase. Bakteri laut galur lokal Vibrio sp. SFNB3 adalah mikroba yang berpotensi dalam menghasilkan α-amilase dengan sifat yang unik. Strategi penelitian yang digunakan untuk memperoleh gen pengkode α-amilase dari bakteri laut galur lokal Vibrio sp. SFNB3 yaitu melalui kloning gen. Penapisan dengan penambahan iodin pada media agar yang mangandung pati dilakukan untuk memilih transforman yang membawa gen α- amilase. IV.1 Pertumbuhan dan penapisan bakteri laut galur lokal SFNB3 Bakteri laut galur lokal SFNB3 pada media padat marine dengan penambahan 1% pati tumbuh lebih melebar dibandingkan dengan pertumbuhan pada media padat marine tanpa pati, sehingga terbentuk daerah berwarna putih yang diduga sebagai ekstrapolisakarida (Gambar IV.1 B). A B C Gambar IV.1 Pertumbuhan dan penapisan bakteri laut galur lokal SFNB3. A: Pertumbuhan bakteri laut galur lokal SFNB3 pada media marine. B: Pertumbuhan bakteri laut galur lokal SFNB3 pada media marine dengan penambahan 1% pati. C: Hasil penapisan bakteri laut galur lokal SFNB3 dengan KI/I 2.

33 Penapisan dilakukan berdasarkan pembentukan kompleks antara pati dan iodin dengan menggunakan KI/I 2 dengan media pertumbuhan ditambah 1% pati. Daerah bening (halo zone) mengindikasikan adanya aktivitas α-amilase yang menyebabkan pati terhidrolisis sehingga tidak terjadi pembentukan komplek antara pati dan iodin. Daerah gelap mengindikasikan tidak adanya aktivitas α- amilase sehingga pati tidak terhidrolisis dan terjadi pembentukan komplek antara pati dan iodin (Gambar IV.2 C). Hasil ini menunjukkan bahwa bakteri laut galur lokal Vibrio sp. SFNB3 menghasilkan α-amilase. IV.2 Penyiapan DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3 Penyiapan DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3 dilakukan dengan menggunakan metode Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega). Tahap isolasi berdasarkan pada serangkaian proses berikut, tahap pertama adalah lisis sel yang dilakukan secara enzimatik menggunakan lisozim. Tahap kedua adalah proses pemurnian hasil lisis yang dilakukan secara enzimatik dengan menggunakan RNase dan secara kimiawi untuk menghilangkan RNA dan mengendapkan protein dari dalam larutan DNA. Tahap ketiga meliputi pemekatan DNA dan penghilangan garam melalui pengendapan dengan isopropanol. Hasil isolasi DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3 dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1% b/v (Gambar IV.2).

34 pb 1 2 23.130 9.416 6.557 4.361 2.322 2.027 Gambar IV.2 Elektroforegram hasil isolasi DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3 dengan metode Wizard Genomic DNA Purification Kit. Lajur 1. Penanda DNA λ/hindiii; Lajur 2. DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3. Elektroforegram yang diperoleh menunjukkan bahwa pita DNA kromosom mempunyai bentuk yang kompak atau tidak terfragmentasi dengan ukuran lebih dari 23,2 kb (Gambar IV.2 lajur 2). Pita DNA yang kompak menggambarkan bahwa DNA kromosom hasil isolasi mempunyai kualitas yang baik. IV.3 Identifikasi bakteri laut galur lokal SFNB3 dengan sekuensing gen 16S rrna Amplifikasi gen 16S rrna bakteri laut galur lokal SFNB3 melalui proses PCR dilakukan untuk mengidentifikasi jenis bakteri. Hasil PCR dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1% b/v (Gambar IV.3). pb 23.130 9.416 6.557 4.361 2.322 2.027 1 2 3 4 1,4 kb Gambar IV.3 Elektroforegram hasil PCR 16s rrna. Lajur 1. Penanda DNA λ/hindiii; lajur 2. DNA kromosom hasil PCR; lajur 3. Kontrol negatif; lajur 4. Kontrol positif.

35 Hasil analisis elektroforesis gel agarosa menunjukkan pita DNA kromosom hasil PCR berukuran sekitar 1,4 kb. Penentuan urutan nukleotida gen 16S rrna dilakukan dengan metode dideoxy Sanger menggunakan dye terminator (Gambar IV.4 dan Lampiran A). AACGAGTTATCTGAACCTTCGGGGAACGATAACGGCGTCGAGCGGCGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAAAT TGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATGATGCCTACGGGCCAAAGAGGGG ACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAGGGCTCACCAAGG CGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGG AGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCC TTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTRGTGTAGTTAATAGCTGCATTATTTGACGTTAGCGAC AGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTA CTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATAGCA TTTGAAACTGGCAGACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGAT CTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAGATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAG CAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGT GGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTG ACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGA CATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTC AGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCGAGTAAT GTCGGGAACTCCAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCC CTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGGGCGGCCAACTTGCGAAAGTGAGCGAA TCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATC GTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACAGCCATGGGAGTGGG CTGCAAAAGAAGTAGGTAGTTTAACCTTCGGGGGGA Gambar IV.4 Urutan Nukleotida gen 16S rrna bakteri laut galur lokal SFNB3. Hasil analisis urutan nukleotida dengan metode blastn dari program BLAST yang terdapat pada situs NCBI menunjukkan bahwa bakteri laut galur lokal yang diteliti termasuk kedalam genus Vibrio, dan mempunyai kesamaan sebesar 99% dengan V. parahaemolyticus. Untuk selanjutnya, bakteri laut galur lokal yang diteliti disebut dengan bakteri laut galur lokal Vibrio sp. SFNB3. IV.4 Pemotongan DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3 secara parsial dengan enzim restriksi EcoRI Untuk memperoleh fragmen DNA kromosom dengan ukuran tertentu dilakukan pemotongan secara parsial dengan enzim restriksi EcoRI. Beberapa kondisi dan

36 komposisi enzim restriksi EcoRI yang berbeda telah dilakukan untuk memperoleh hasil yang optimal. IV.4.1 Pemotongan DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3 secara parsial dengan variasi aktivitas unit enzim restriksi EcoRI Pemotongan DNA kromosom secara parsial dengan variasi aktivitas unit enzim restriksi dilakukan untuk mengetahui pola fragmentasi DNA kromosom, sehingga dapat ditentukan jumlah unit aktivitas enzim yang digunakan untuk mendapatkan fragmen DNA dengan ukuran-ukuran tertentu. pb 1 2 3 4 5 23.130 9.416 6.557 4.361 2.322 2.027 Gambar IV. 5 Elektroforegram pemotongan secara parsial DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3 oleh enzim restriksi EcoRI dengan variasi aktivitas unit enzim restriksi. Lajur 1. Penanda DNAλ/HindIII; lajur 2. DNA kromosom tidak dipotong (1,525 µg); lajur 3. DNA kromosom (1,525 µg)/ecori (2,5U); lajur 4. DNA kromosom (1,525 µg)/ecor1 (5U); lajur 5. DNA kromosom (1,525 µg)/ecor1 (10U). Hasil pemotongan parsial DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3 dengan 2,5 U, 5 U, dan 10 U enzim restriksi EcoRI (Gambar IV.5 lajur 3, 4, dan 5) mempunyai pola fragmentasi yang sama, yaitu pita smear pada daerah sekitar 5-9,5 kb. Kondisi dengan ketiga aktivitas unit enzim restriksi ini dapat digunakan untuk fragmentasi DNA kromosom pada tahap selanjutnya.

37 IV.4.2 Pemotongan DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3 secara parsial oleh enzim restriksi EcoRI dengan variasi waktu inkubasi Pemotongan parsial DNA kromosom oleh enzim restriksi EcoRI dengan variasi waktu inkubasi dilakukan untuk memperoleh waktu optimum aktivitas enzim restriksi. pb 1 2 3 4 5 6 7 8 23.130 9.416 6.557 4.361 2.322 2.027 Gambar IV. 6 Elektroforegram pemotongan secara parsial DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3 oleh enzim restriksi EcoRI dengan variasi waktu inkubasi. Lajur 1. Penanda DNAλ/HindIII; lajur 2. DNA kromosom tidak dipotong (0,7625 µg); lajur 3. DNA kromosom (1,525 µg)/ecori (2,5U), waktu inkubasi 1 jam; lajur 4. DNA kromosom (1,525 µg)/ecori (2,5U), waktu inkubasi 2 jam; lajur 5. DNA kromosom (1,525 µg)/ecori (2,5U), waktu inkubasi 3 jam; lajur 6. DNA kromosom (1,525 µg)/ecori (2,5U), waktu inkubasi 4 jam; lajur 7. DNA kromosom (1,525 µg)/ecori (2,5U), waktu inkubasi 5 jam; lajur 8. DNA kromosom (1,525 µg)/ecori (2,5U), waktu inkubasi 6 jam. Hasil analisis dengan elektroforesis gel agarosa menunjukkan bahwa pemotongan parsial DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3 dengan waktu inkubasi selama 1 jam dan 2 jam (Gambar IV.6 lajur 3 dan 4) mempunyai pola fragmentasi yang sama Sedangkan waktu inkubasi selama 3, 4, 5, dan 6 jam (Gambar IV.6 lajur 5, 6, 7, dan 8) menunjukkan pola fragmentasi yang sama, yang mengindikasikan bahwa DNA kromosom telah terpotong oleh enzim restriksi EcoRI.

38 Kemudian dilakukan perbandingan waktu inkubasi pemotongan DNA kromosom yaitu selama 3 jam dan satu malam. 1 2 3 pb 4 5 6 23.130 9.416 6.557 4.361 2.322 2.027 Gambar IV.7 Elektroforegram pemotongan secara parsial DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3 oleh enzim restriksi EcoRI dengan perbandingan waktu inkubasi. Lajur 1 dan 5. DNA kromosom tidak dipotong (0,7625 µg); lajur 3 dan 4. Penanda DNAλ/HindIII; lajur 2. DNA kromosom (3,05 µg)/ecori (5U), waktu inkubasi 3 jam; lajur 6. DNA kromosom (4,026 µg)/ecori (5U), waktu inkubasi satu malam. Hasil analisis elektroforesis gel agarosa (Gambar IV.7) menunjukkan bahwa hasil pemotongan DNA kromosom oleh enzim restriksi EcoRI dengan waktu inkubasi yang berbeda mempunyai pola fragmentasi yang sama, yaitu pita smear sekitar 2-23 kb. Dari hasil yang diperoleh, untuk fragmentasi DNA kromosom pada tahap selanjutnya digunakan waktu inkubasi selama 3 jam. IV.4.3 Pemotongan dan pemurnian fragmen DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3 Ukuran gen α-amilase pada bakteri laut galur lokal galur lokal Vibrio sp. SFNB3 belum diketahui, oleh karena itu fragmen DNA yang akan digunakan berukuran sekitar 4,5-6 kb. Dengan ukuran 4,5-6 kb diharapkan fragmen tersebut mengandung gen α-amilase yang dapat mendegradasi pati mentah.

39 pb 1 2 3 4 23.130 9.416 6.557 4.361 2.322 2.027 4,5-6 kb Gambar IV.8 Elektroforegram pemotongan fragmen DNA kromosom dengan enzim restriksi EcoRI. Lajur 1. Penanda DNAλ/HindIII; lajur 2. DNA kromosom tidak dipotong (0,7625 µg); lajur 3. DNA kromosom (6,1 µg)/ecori (10U), waktu inkubasi 3 jam; lajur 4. Penanda 1 kb DNA Ladder. Dari hasil analisis dengan elektroforesis gel agarosa 1% b/v, diperoleh DNA dengan ukuran fragmen yang bervariasi, yang mengindikasikan banyaknya sisi pemotongan enzim restriksi EcoRI pada DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3. Pemotongan gel dilakukan pada fragmen DNA dengan ukuran sekitar 4,5-6 kb. Untuk mengekstraksi fragmen DNA yang terkandung dalam gel agarosa 1% digunakan metode GFX TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit. Metode ini terdiri dari dua tahap, yaitu denaturasi protein serta pelarutan agarosa, dan pencucian serta pengeringan melalui sentrifugasi. Pada tahap yang kedua, matriks pengikat DNA diikat dengan buffer etanolik untuk menghilangkan garam dan kontaminasi lain. Hasil pemurnian kemudian dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1%. Elektroforegram menunjukkan adanya pita pada ukuran 4,5-6 kb (Gambar IV.9 lajur 2).

40 pb 1 2 3 pb 23.130 9.416 6.557 4.361 2.322 2.027 10000 8000 6000 5000 4000, 3500, 3000 2500 2000 1500 1000 750 500 250 Gambar IV.9 Elektroforegram pemurnian DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3 dengan GFX TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit. Lajur 1. Penanda DNAλ/HindIII; lajur 2. DNA kromosom hasil pemurnian (6 kb); lajur 3. Penanda 1 kb DNA Ladder. Fragmen DNA dengan ukuran 4,5-6 kb akan digunakan dalam ligasi dengan vektor puc19. IV.5 Isolasi DNA plasmid puc19 dengan QIAprep Spin Miniprep Kit Plasmid puc19 merupakan vektor berukuran kecil yang dapat digunakan untuk kloning fragmen DNA dengan jumlah copy yang tinggi. Selain itu, puc19 mempunyai satu sisi pemotongan enzim restriksi EcoRI dalam daerah LacZ. Metode QIAprep Spin Miniprep Kit berdasarkan pada lisis sel bakteri yang diikuti oleh penyerapan DNA di atas silika dengan adanya garam yang tinggi. Tiga tahap reaksi yang terjadi diantaranya : (i) preparasi dan pembersihan hasil lisis bakteri, (ii) penyerapan DNA di atas membran QIAprep, dan (iii) pencucian serta elusi plasmid DNA. Bufer PB yang digunakan berfungsi untuk menghilangkan endonuklease, sedangkan bufer PE berfungsi untuk menghilangkan garam.

41 pb 1 2 3 23.130 9.416 6.557 4.361 2.322 2.027 Gambar IV.10 Elektroforegram hasil isolasi DNA puc19. Lajur 1. Penanda DNAλ/HindIII; lajur 2 dan 3. DNA puc19. Hasil isolasi DNA plasmid puc19 dengan QIAprep Spin Miniprep Kit yang dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1% b/v pada tegangan 80 volt selama 45 menit ditunjukkan pada Gambar IV.10 lajur 2 dan 3. IV. 6 Pemotongan, defosforilasi dan pemurnian DNA plasmid puc19. Untuk memperoleh DNA plasmid puc19 dalam bentuk linier digunakan enzim restriksi EcoRI agar hasil pemotongannya sesuai dengan fragmen DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3. Hasil pemotongan puc19 dengan enzim restriksi EcoRI selanjutnya didefosforilasi dengan enzim alkalin fosfatase yang berfungsi menghilangkan gugus fosfat yang terletak pada ujung 5 molekul DNA, agar tidak terjadi religasi (self ligation). Untuk menghilangkan pengaruh bufer-bufer yang telah digunakan, dilakukan pemurnian dengan GFX TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit.

42 pb 1 2 3 23.130 9.416 6.557 4.361 2.322 2.027 2,7 kb Gambar IV.11 Elektroforegram hasil pemotongan, defosforilasi, dan pemurnian puc19. Lajur 1. Penanda DNAλ/HindIII; lajur 2. puc19 /EcoRI; lajur 3. puc19 utuh. Dari hasil analisis dengan elektroforesis gel agarosa, pada Gambar IV.11 lajur 2 diperoleh pita yang menunjukkan DNA plasmid puc19 linier dengan ukuran sekitar 2,7 kb. IV.7 Transformasi E. coli TOP10F dengan plasmid rekombinan Proses kloning merupakan pendekatan yang dilakukan untuk memperoleh gen α- amilase dari bakteri laut galur lokal Vibrio sp. SFNB3. Dalam proses kloning dilakukan beberapa tahapan, yaitu ligasi antara fragmen DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3 dengan DNA plasmid puc19 sebagai vektor sehingga diperoleh plasmid rekombinan, selanjutnya transformasi E. coli TOP10F dengan plasmid rekombinan. Fragmen DNA kromosom dengan ukuran 4,5-6 kb yang diligasikan dengan DNA plasmid puc19 dikatalisis oleh enzim T4 DNA ligase. Enzim ini membentuk ikatan fosfodiester antara ujung 3 hidroksil dan ujung 5 fosfat DNA yang berdekatan. Kultur sel transforman ditumbuhkan pada media luria bertani dengan penambahan ampisilin, X-gal, dan IPTG, dengan cara disebarkan menggunakan batang L.

43 Ampisilin adalah antibiotik yang digunakan untuk mengidentifikasi plasmid rekombinan. Plasmid rekombinan (puc19-fragmen DNA kromosom) mempunyai gen yang resisten terhadap ampisilin (Amp R ), sehingga akan tumbuh baik pada media yang mengandung ampisilin. IPTG (isopropil-tiogalaktosida) merupakan induser gen lac dan untuk mengindikasikan bahwa ekspresi LacZ tidak direpresi. X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranosida) adalah substrat untuk β- galaktosidase dan dipecah oleh enzim ini menjadi hasil yang berwarna biru. Dari hasil transformasi diperoleh sel transforman yang tumbuh pada media padat LBA yang terdiri dari koloni berwarna putih dan biru (Gambar IV.12). Koloni yang tumbuh ini diperkirakan membawa plasmid rekombinan karena plasmid tersebut membawa gen yang resisten terhadap antibiotik ampisilin dan menunjukkan adanya vektor yang masuk ke dalam E. coli, baik vektor utuh maupun vektor yang telah tersisipi gen α-amilase. Gambar IV.12 Hasil transformasi E. coli TOP10F dengan plasmid rekombinan. Koloni berwarna biru (amp R lacz + ) mengindikasikan bahwa vektor rekombinan tidak tersisipi fragmen DNA. Daerah LacZ yang terdapat pada vektor tetap utuh sehingga enzim β-galaktosidase disintesis dan memecah X-gal sebagai substrat analog dari laktosa menjadi produk yang berwarna biru tua. Jika vektor tersisipi fragmen DNA, daerah LacZ menjadi terpotong sehingga β-galaktosidase tidak bisa disintesis dan tidak terjadi pemecahan X-gal, produk yang dihasilkan berwarna putih (amp R lacz - ).

44 Pada tahap selanjutnya dilakukan peremajaan dan penapisan koloni putih untuk memperoleh koloni yang mengandung gen α-amilase, kemudian dilanjutkan dengan isolasi plasmid rekombinan dan analisis restriksi untuk mengetahui ukuran fragmen DNA sisipan pada vektor rekombinan. IV.8 Penapisan sel transforman Koloni-koloni yang berwarna putih ditumbuhkan pada media padat LBA dengan penambahan 1% pati sebagai substrat. Setelah satu hari pertumbuhan, di atas permukaan tempat tumbuhnya transforman diberi penambahan D-sikloserin, kemudian diinkubasi kembali selama lima jam pada 37 C. D-sikloserin akan menginhibisi biosintesis dinding sel E. coli TOP10F sehingga substrat bisa masuk ke dalam periplasma dan dapat dihidrolisis oleh α-amilase yang terdapat pada periplasma. Selanjutnya dilakukan penambahan KI/I 2 untuk mengidentifikasi transforman yang mengandung gen α-amilase. Dari hasil penapisan diperoleh transforman yang diduga mengandung gen α- amilase (Vsp.7), hal ini dapat dilihat dari terbentuknya daerah bening (halo zone) sebagai akibat adanya aktivitas α-amilase yang menghidrolisis pati sehingga kompleks antara pati dan iodin tidak terbentuk dan daerah bening yang ditunjukkan oleh sel transforman Vsp.7 sama dengan daerah bening yang terbentuk pada kontrol positif (BLA) (Gambar IV.13 No. B.1 dan 3). 1 1 Vsp.7 6 2 2 6 5 4 3 3 4 5 A B Gambar IV.13 Penapisan sel transforman dengan menggunakan D-sikloserin dan KI/I 2. 1,2,5,6: transforman yang diduga mengandung α-amilase dan hasil peremajaan; 3: kontrol positif (BLA); 4: kontrol negatif (koloni biru). A: Sel transforman pada media LBA, B: Penapisan sel transforman dengan KI/I 2.

45 IV.9 Isolasi plasmid rekombinan Vsp.7 dengan metode QIAprep Spin Miniprep Kit dan pemotongan dengan enzim restriksi EcoRI Plasmid rekombinan Vsp.7 diduga mengandung gen α-amilase. Hasil isolasi Plasmid rekombinan Vsp.7dengan QIAprep Spin Miniprep Kit selanjutnya dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 0,8% b/v (Gambar IV.14). pb 1 2 3 4 23.130 9.416 6.557 4.361 2.322 2.027 Gambar IV.14 Elektroforegram hasil isolasi plasmid rekombinan Vsp.7 dengan metode QIAprep Spin Miniprep Kit. Lajur 1. Penanda DNAλ/HindIII; lajur 2 dan 3. Plasmid rekombinan Vsp.7; lajur 4. plasmid puc19. Dari hasil analisis elektroforesis gel agarosa dapat dilihat bahwa plasmid rekombinan Vsp.7 (Gambar IV.14 lajur 2 dan3) mempunyai pola plasmid tersisipi insert dengan ukuran yang lebih besar daripada plasmid puc19 (Gambar IV.14 lajur 4) dan mengindikasikan bahwa pada plasmid rekombinan tersebut terdapat fragmen DNA sisipan. Plasmid rekombinan Vsp.7 mempunyai satu sisi pemotongan enzim EcoRI, yaitu pada urutan nukleotida GAATTC. Selanjutnya, plasmid rekombinan Vsp.7 ini dianalisis dengan menggunakan enzim restriksi EcoRI (Gambar IV.15).

46 pb 1 2 3 4 5 23.130 9.416 6.557 4.361 2.322 2.027 4,7 kb 2,7 kb Gambar IV.15 Elektroforegram hasil pemotongan plasmid rekombinan Vsp.7 dengan enzim restriksi EcoRI. Lajur 1. Penanda DNAλ/HindIII; lajur 2. Plasmid rekombinan Vsp.7/EcoRI; lajur 3. Penanda 1 kb DNA Ladder; lajur 4. Plasmid rekombinan Vsp.7 utuh; lajur 5. Plasmid puc19. Hasil analisis restriksi menunjukkan bahwa pemotongan plasmid rekombinan Vsp.7 dengan enzim restriksi EcoRI menghasilkan dua fragmen DNA (Gambar IV.15 lajur 2), yaitu fragmen DNA dengan ukuran sekitar 4,7 kb yang menunjukkan fragmen DNA sisipan dan fragmen DNA dengan ukuran sekitar 2,7 kb yang menunjukkan fragmen puc19 linier sebagai vektor. Adanya fragmen yang berukuran sekitar 4,7 kb mengindikasikan bahwa plasmid rekombinan yang diperoleh membawa gen yang diharapkan. Selanjutnya untuk mengidentifikasi gen yang terdapat pada fragmen DNA sisipan Vsp.7, dilakukan sequencing dengan menggunakan metode dideoxy Sanger (Macrogen, Korea) (Lampiran B). IV.10 Analisis urutan nukleotida Vsp.7 Untuk menentukan urutan nukleotida Vsp.7 dengan metode dideoxy Sanger digunakan primer universal puc19, yaitu M13F-pUC (forward primer : 5 (GTAAAACGACGGCCAGT)3 ), dan M13R-pUC (reverse primer :

47 5 (AACAGCTATGACCATG)3 ), dengan strategi penentuan urutan nukleotida ditunjukkan pada Gambar IV.16. F 5 3 Insert DNA 3 R puc19 5 Gambar IV.16 Strategi penentuan urutan nukleotida fragmen DNA sisipan Vsp.7 dengan metode dideoxy Sanger. Dari hasil sequencing dengan forward primer diperoleh urutan nukleotida sepanjang 849 pb, setelah dilakukan analisis dengan menggunakan metode blastn dari program BLAST yang terdapat pada situs NCBI, diperoleh kesamaan tertinggi dengan Hypothetical protein dari Vibrio harveyi ATCC BAA-1116 (nomor akses CP000789.1) dan flavodoxin 2 dari Vibrio parahaemolyticus RIMD (nomor akses BA000031.2). Pensejajaran urutan nukleotida Vsp.7-M13F-pUC selanjutnya dilakukan dengan menggunakan program komputer Clustal-X dan GeneDoc (Gambar IV.17).

48 Gambar IV.17 Hasil pensejajaran urutan nukleotida Vsp.7-M13F-pUC dari Vibrio sp. SFNB3 dengan urutan nukleotida flavodoxin 2 dari V. parahaemolyticus. Vsp.7-M13F, urutan nukleotida fragmen DNA sisipan Vsp.7 dengan menggunakan forward primer;flavodoxin, urutan nukleotida flavodoxin 2 dari V. parahaemolyticus (nomor akses BA000031.2). Dari hasil sequencing dengan reverse primer diperoleh urutan nukleotida sepanjang 847 pb, setelah dilakukan analisis dengan menggunakan metode blastn dari program BLAST yang terdapat pada situs NCBI, diperoleh kesamaan tertinggi dengan Hypothetical protein dari Vibrio harveyi ATCC BAA-1116 (nomor akses CP000789.1) dan single-stranded-dna-specific exonuclease RecJ dari Vibrio parahaemolyticus RIMD (nomor akses BA000031.2). Selanjutnya pensejajaran urutan nukleotida Vsp.7-M13R-pUC dilakukan dengan menggunakan program komputer Clustal-X dan GeneDoc (Gambar IV.18).

Gambar IV.18 Hasil pensejajaran urutan nukleotida Vsp.7-M13R-pUC dari Vibrio sp. SFNB3 dengan urutan nukleotida single-stranded-dna-specific exonuclease RecJ dari V. parahaemolyticus. Vsp.7-M13R, urutan nukleotida fragmen DNA sisipan Vsp.7 dengan menggunakan reverse primer; eksonuklease, urutan nukleotida single-stranded- DNA-specific exonuclease RecJ dari V. parahaemolyticus (nomor akses BA000031.2). 49

50 Berdasarkan hasil penelusuran terhadap genom V. parahaemolyticus RIMD diketahui bahwa diantara gen pengkode flavodoxin 2 dan single-stranded-dnaspecific exonuclease RecJ pada V. parahaemolyticus RIMD terdapat dua gen pengkode lain, yaitu gen pengkode integrase dan DsbC (disulfide bond). Berdasarkan pada analisis kesaman tertinggi fragmen DNA Vsp.7 dari Vibrio sp. SFNB3 dengan V. parahemolyticus RIMD, maka diasumsikan pada fragmen DNA sisipan Vsp.7 tersebut terdapat pula gen pengkode integrase dan DsbC (disulfide bond). Skema gen-gen pengkode yang diduga terdapat pada fragmen DNA sisipan Vsp.7 dari Vibrio sp. SFNB3 dapat dilihat pada Gambar IV.19. F R Flavodoxin 2 Integrase DsbC Exonuclease : Fragmen DNA sisipan : Gen pengkode Gambar IV.19 Skema gen-gen pengkode yang diduga terdapat pada fragmen DNA sisipan Vsp.7 dari bakteri laut galur lokal Vibrio sp. SFNB3. Dari genom V. parahaemolyticus RIMD juga diperoleh informasi yang sangat penting, yaitu ditemukannya gen pengkode α-amilase dengan urutan nukleotida sepanjang 2085 pb. Besarnya ukuran gen pengkode α-amilase ini memunculkan dugaan bahwa α-amilase dari V. parahemolyticus RIMD mempunyai sifat yang khas dan berbeda dengan α-amilase pada umumnya. Untuk mengidentifikasi kekhasan sifat α-amilase V. parahaemolyticus RIMD, dilakukan pensejajaran urutan nukleotida dan urutan asam amino α-amilase dari V. parahaemolyticus RIMD dengan α-amilase dari beberapa spesies dengan genus yang sama (Gambar IV.20).

Gambar IV.20 Pensejajaran urutan asam amino α-amilase dari beberapa spesies dengan genus Vibrio. Amy1, α-amilase V. parahaemolyticus (BAC58283.1); Amy2, Vibrio sp. Ex25 (ZP_01474024); Amy3, V. alginolyticus (ZP_01262268.1); Amy4, V. splendidus (ZP_00992853.1); Amy5, V. cholerae (ZP_01955056.1); Amy6, V. harveyi (ZP_01986111.1). Kenaikan intensitas warna menunjukkan asam amino semakin lestari. 51

52 Dari hasil pensejajaran asam amino pengkode α-amilase beberapa genus Vibrio terdapat beberapa urutan asam amino yang lestari, yaitu Asp25, Asn218, Asp225, Leu245, Val269, Asp416, dan Ala543. Urutan asam amino α-amilase dari V. parahaemolyticus RIMD selanjutnya dianalisis dengan menggunakan program Conserved Domains pada situs NCBI, untuk melihat domain yang terdapat pada gen tersebut (Gambar IV.21). 1 100 200 300 400 500 600 694 Alpha-amylase superfamily mals Gambar IV.21 Domain yang terdapat pada α-amilase V. parahaemolyticus RIMD (program Conserved Domains, situs NCBI). Dari hasil analisis menggunakan program Conserved Domains diperoleh informasi bahwa α-amilase dari V. parahaemolyticus RIMD mempunyai dua domain utama, yaitu domain alpha-amylase superfamily dan multi-domains mals. Domain alpha-amylase superfamily merupakan katalitik domain, dimana didalamnya terdapat struktur (β/α) 8 atau TIM barrel yang mengandung residu katalitik, sedangkan multi-domains mals merupakan precursor α-amilase periplasmic. Hasil analisis terhadap domain yang terdapat pada α-amilase dari beberapa spesies dengan genus Vibrio (Lampiran C), diperoleh penampakan domain yang sama dengan domain α-amilase yang terdapat pada V. parahaemolyticus RIMD (Gambar IV.21), yaitu terdiri dari domain alpha-amylase superfamily dan multidomains mals.

53 Untuk menemukan keunikan dari α-amilase Vibrio, dilakukan analisis terhadap α- amilase dari genus yang berbeda dengan menggunakan program Conserved domains pada situs NCBI (Lampiran D). Dari hasil analisis diperoleh informasi mengenai keunikan α-amilase dari Vibrio, yaitu terdapatnya multi-domains mals. Domain inilah yang menyebabkan besarnya ukuran gen pengkode α-amilase dari Vibrio. Dengan diketahuinya informasi mengenai keunikan gen pengkode α-amilase dari V. parahaemolyticus RIMD maka isolasi gen pengkode α-amilase dari bakteri laut galur lokal Vibrio sp. SFNB3 untuk penelitian lebih lanjut dapat dilakukan melalui pendekatan PCR. Dari urutan nukleotida gen pengkode α-amilase V. parahaemolyticus RIMD dapat dibuat rancangan primer. Melalui pendekatan PCR ini, diharapkan akan diperolehnya α-amilase dari bakteri laut galur lokal Vibrio sp. SFNB3 yang mempunyai sifat baru dan unik dengan α-amilase pada umumnya sehingga dapat memberikan keuntungan jika digunakan dalam proses industri berbasis pati.