III. BAHAN DAN METODE A. BAHAN DAN ALAT 1. Bahan Bahan utama yang dibutuhkan dalam penelitian terdiri dari prebiotik berupa fruktooligosakarida (QHTFOS-G50L TM ), galaktooligisakarida (QHTGOS-50L TM ), dan inulin (Frutafit IQ TM ). Bakteri Asam Laktat (BAL) yang digunakan dalam penelitian ini adalah BAL yang berasal dari isolat ASI. Isolat tersebut antara lain: Lactobacillus rhamnosus A23, B16, R14, R21, R23 dan R23H serta Lactobacillus acidophillus A22. Isolat kultur BAL tersebut diperoleh dari SEAFAST CENTER IPB. Bahan yang digunakan untuk media pertumbuhan diantaranya adalah media MRS (deman, Rogosa and Sharpe) broth, MRS agar, yeast extract (Oxoid TM ), susu skim (Sunlac TM ), protease peptone (Difco TM ), Tween 80, K 2 HPO 4.3H 2 O, MgSO 4.7H 2 O, MnSO 4.4H 2 O (Merck TM ), dan sodium asetat (Cica TM ). Bahan-bahan untuk analisis oligosakarida meliputi larutan fenol 5%, H 2 SO 4 pekat, Na 2 CO 3, NaHCO 3, KCN, FeNH 4 (SO 4 ) 2 (Merck TM ), dan potassium ferric cyanide (Cica TM ). Bahan yang digunakan untuk analisis persen asam laktat adalah NaOH 0.1 N (Cica TM ), KHP, indikator penolfthalein (Merck TM ), dan air destilata. 2. Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian terdiri dari peralatan analisis mikrobiologi dan analisis kimia untuk oligosakarida dan persen asam laktat. Alat-alat untuk analisis mikrobiologi meliputi mikropipet 100-1000 µl, mikropipet 10-100 µl, membran filter steril 0.2 µl, autoklaf, oven, hot plate magnetic stirrer, ph meter, tabung reaksi, dan cawan petri. Alat-alat untuk analisis oligosakarida dan persen asam laktat meliputi sentrifus, spektrofotometer, buret, tabung reaksi, dan alat gelas lainnya. B. METODE PENELITIAN Pelaksanaan penelitian ini terdiri dari tiga tahap. Tahap pertama adalah seleksi BAL isolat ASI yang dapat mempergunakan prebiotik sebagai sumber karbon untuk pertumbuhannya. Pada tahap ke dua, isolat terpilih ditumbuhkan kembali pada media dengan berbagai prebiotik sebagai sumber gula untuk dilihat metabolismenya dengan menganalisis kandungan gula dan asam laktat pada media. Selanjutnya pada tahap ke tiga, isolat terpilih ditumbuhkan pada media susu skim dengan penambahan kombinasi prebiotik untuk kembali diamati metabolismenya. Dengan demikian, hasil yang diperoleh dapat dijadikan acuan dalam pengembangan produk sinbiotik berbasis susu fermentasi. Tahapan penelitian secara keseluruhan dapat dilihat pada Gambar 6.
Seleksi BAL yang dapat memetabolisme prebiotik, BAL ditumbuhkan pada media berbasis MRSB dengan kombinasi prebiotik (A, B, C, D, E, dan F)*, inkubasi BAL pada 37 o C selama 24 jam Analisis total BAL Kultur BAL terpilih Uji metabolisme prebiotik oleh BAL, BAL ditumbuhkan pada media berbasis MRSB dengan kombinasi prebiotik (A, B, C, D, E, dan F)*dan diinkubasi pada 37 o C selama 24 jam Analisis OD, ph, % asam laktat, total gula, dan gula pereduksi Kombinasi BAL dan prebiotik terpilih Aplikasi pemanfaatan BAL isolat ASI dan prebiotik dalam produk susu fermentasi, BAL ditumbuhkan pada media susu skim 12% dengan penambahan prebiotik terpilih, inkubasi pada 37 o C selama 24 jam Analisis total BAL, ph, % asam laktat, total gula, dan gula pereduksi, Kombinasi BAL dan prebiotik terpilih pada pembuatan susu fermentasi Gambar 6. Bagan Alir Penelitian * Keterangan: A : media berbasis MRSB tanpa gula (kontrol) B : media berbasis MRSB dengan 5% FOS C : media berbasis MRSB dengan 5% GOS D : media berbasis MRSB dengan 5% inulin E : media berbasis MRSB dengan 5% FOS:GOS (1:9) F : media berbasis MRSB dengan 5% inulin:gos (1:9) 16
1. Seleksi BAL Isolat ASI yang Dapat Memanfaatkan Prebiotik sebagai Sumber Karbon a. Penyegaran dan Pengawetan Kultur (Hariyadi et al. 2003) Manik-manik yang mengandung mikroba yang digunakan (sebanyak ± 3 biji) ditempatkan pada tabung reaksi yang berisi MRSB steril. Kemudian masing-masing tabung diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 24 jam. Selanjutnya dari tabung reaksi berisi kultur tersebut diambil sebanyak 0.1 ml dan dimasukan ke dalam tabung reaksi lain yang berisi 10 ml MRSB untuk diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 24 jam. Kultur yang telah diinkubasi siap untuk digunakan. Pengawetan kultur sangat penting untuk dilakukan agar kultur bakteri dapat terus digunakan. Pengawetan dilakukan dengan cara menambahkan gliserol steril ke dalam kultur BAL yang telah diinokulasikan dalam MRSB steril dengan perbandingan 1:4 kemudian dikocok rata. Suspensi bakteri yang telah berisi gliserol dimasukkan ke dalam vial yang berisi manik-manik steril sampai manik-manik tersebut terendam. Campuran kemudian dikocok dan sisa cairan dipipet dan dibuang. Kultur yang telah termobilisasi disimpan pada suhu -20 o C. b. Persiapan Media Fermentasi Media fermentasi yang digunakan adalah media berbasis MRSB tetapi glukosa pada media diganti dengan beberapa jenis prebiotik yang digunakan. Pembuatan media berbasis MRSB ini mengacu pada pembuatan media yang dilakukan oleh Khrisnayudha (2007). Media berbasis MRSB dibuat dengan mencampurkan protease pepton, yeast extract, Tween 80, dipotassium hidrogen fosfat, sodium asetat, MgSO 4.7H 2 O dan MnSO 4.4H 2 O. Jumlah bahan dan prosedur pembuatan media berbasis MRSB dapat dilihat pada Lampiran 2. Sterilisasi medium dilakukan dalam autoklaf pada 121 o C selama 15 menit. Konsentrasi prebiotik FOS, GOS, dan inulin yang ditambahkan pada media berbasis MRSB adalah sebesar 5%. Terlebih dahulu dibuat larutan stok prebiotik dengan konsentrasi 10 kali konsentrasi awal media, kecuali untuk inulin dibuat larutan stok dengan konsentrasi 2 kali konsentrasi semula. Penambahan prebiotik dilakukan secara terpisah setelah didapatkan medium dan larutan prebiotik steril. Sterilisasi prebiotik dilakukan dengan menggunakan filter steril 0.2 µm. Sesaat sebelum digunakan, media berbasis MRSB yang telah disiapkan ditambah dengan prebiotik steril. Terdapat enam jenis media dengan kombinasi prebiotik yang berbeda yaitu FOS, GOS, inulin, FOS:GOS (1:9), inulin:gos (1:9), dan kontrol tanpa penambahan prebiotik. Media berbasis MRSB yang telah dicampur dengan prebiotik sebagai sumber gula siap untuk digunakan sebagai media pertumbuhan BAL. 17
c. Uji Pertumbuhan BAL pada Media Berbasis MRSB dengan Prebiotik sebagai Sumber Karbon Pada tahap penyeleksian ini, pengaruh penambahan prebiotik berupa FOS, GOS, dan inulin diujikan terhadap tujuh kultur BAL isolat ASI yang telah disebutkan sebelumnya. Kultur dari masing-masing BAL sebanyak 0.1 ml ditambahkan pada tabung reaksi berisi media yang telah dipersiapkan sebelumnya untuk selanjutnya dilakukan inkubasi di dalam inkubator 37 o C selama 24 jam. Prosedur yang sama juga dilakukan terhadap kontrol yang berupa media tanpa penambahan gula. Dengan demikian, secara keseluruhan terdapat enam perlakuan untuk masing-masing kultur dengan perbedaan pada penambahan jenis prebiotik yaitu 5% FOS, 5% GOS, 5% inulin, 5% FOS:GOS (1:9), 5% inulin:gos (1:9), dan kontrol. Analisis total BAL secara kuantitatif dilakukan setelah inkubasi selama 24 jam. Analisis dilakukan dengan menghitung secara langsung jumlah BAL yang tumbuh pada MRSA setelah dilakukan pencawanan dengan metode cawan tuang. Prosedur selengkapnya dapat dilihat pada metode analisis pertumbuhan BAL. 2. Uji Metabolisme Prebiotik oleh BAL Metabolisme prebiotik oleh BAL dapat diamati dengan menganalisis kandungan gula dan asam pada media pertumbuhan yang digunakan. Kultur BAL yang terpilih berdasarkan seleksi pada tahap 1 (Lactobacillus R23 dan R23H), ditumbuhkan kembali pada media berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon. Media berbasis MRSB dan kombinasi prebiotik yang digunakan sama dengan pengujian pada tahap sebelumnya. Hanya saja pada tahap ini proses sterilisasi prebiotik dengan membran filter diganti dengan proses pasteurisasi pada suhu 85 o C selama 30 menit. Hal ini dilakukan untuk menyesuaikan dengan kondisi proses pembuatan susu fermentasi pada umumnya. Masing-masing kultur BAL yang ditumbuhkan diamati dan dianalisis setiap dua jam mulai jam ke-0 sampai jam ke-12 dan selanjutnya diamati kembali pada jam ke-24. Beberapa analisis yang dilakukan adalah pertumbuhan sel dengan metode spektrofotometri, analisis total gula, gula pereduksi, persen asam laktat, dan ph. Prosedur analisis selengkapnya dapat dilihat pada bagian metode analisis. 3. Aplikasi pemanfaatan Prebiotik dan BAL Isolat ASI pada Susu Fermentasi Berbeda dengan kedua tahap sebelumnya, untuk tahap ke tiga, media yang digunakan adalah susu skim. Pembuatan media susu skim dilakukan dengan melarutkan susu skim sebanyak 12% (b/v) ke dalam akuades kemudian dipasteurisasi dengan autoklaf pada suhu 100 o C selama 30 menit. Media susu skim digunakan agar dapat dilihat metabolisme prebiotik dengan keberadaan sumber gula lain yaitu laktosa. Dengan demikian, hasil dari penelitian ini dapat dijadikan acuan dalam pengembangan produk sinbiotik berbasis susu fermentasi. Sebelum dilakukan pengujian, disiapkan terlebih dahulu starter kultur seperti halnya dalam pembuatan produk susu fermentasi. Kultur BAL terpilih (Lactobacillus R23) sebanyak 2% ditumbuhkan pada media susu skim 10% yang telah dipasteurisasi pada suhu 100 o C 18
selama 30 menit. Media susu skim yang telah diinokulasi dengan BAL kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 48 jam. Starter yang telah diinkubasi siap untuk digunakan. Kombinasi prebiotik yang digunakan adalah FOS, Inulin, dan Inulin:GOS (1:9). Prebiotik yang telah dipasteurisasi pada 85 o C selama 30 menit ditambahkan ke dalam media susu skim sebanyak 5% sesaat sebelum media digunakan. Selain media susu skim dengan penambahan prebiotik, digunakan pula media susu skim tanpa penambahan prebiotik sebagai media pembanding. Selanjutnya, 1% starter kultur yang telah siap digunakan diinokulasikan ke dalam media susu skim dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 48 jam. Analisis yang dilakukan meliputi analisis total BAL dengan menggunakan metode hitungan cawan, analisis total gula, gula pereduksi, ph, dan TAT (% asam laktat). Analisis dilakukan pada jam ke-0, jam ke-24, dan jam ke-48. Prosedur analisis selengkapnya dapat dilihat pada bagian metode analisis. C. METODE ANALISIS 1. Analisis Pertumbuhan BAL dengan Metode Hitungan Cawan (BAM 2001) Sebanyak 1 ml kultur dipipet secara aseptis ke dalam pengenceran berseri hingga diperoleh tiga pengenceran terbesar yang akan dicawankan secara duplo. Metode pencawanan yang digunakan adalah metode agar tuang (pour plate) dengan MRSA sebanyak 12-15 ml. MRSA dituang ke dalam cawan petri yang berisi kultur dan diratakan dengan cara memutar cawan lalu dibiarkan membeku. Setelah membeku, cawan diinkubasikan dengan posisi terbalik pada suhu 37 o C selama 48 jam. Koloni yang dihitung berada dalam kisaran 25 250 koloni. Jumlah koloni dicatat dan dihitung dengan rumusan sebagai berikut: N = Σ C / [ ( 1 x n 1 ) + ( 0.1 x n 2 ) ] x d Keterangan: N : Jumlah koloni (CFU) per ml atau gram produk Σ C : Total seluruh koloni pada cawan yang dapat dihitung n 1 : Jumlah cawan dari pengenceran pertama yang dihitung n 2 : Jumlah cawan dari pengenceran kedua yang dihitung d : Nilai pengenceran dari penghitungan pertama yang digunakan 2. Analisis Pertumbuhan BAL dengan Metode Spektrofotometri (Widdel 2007) Analisis kuantitatif pertumbuhan BAL dengan metode spektrofotometri dilakukan dengan mengukur nilai optical density (OD) media kultur pada λ 600 nm. Pengukuran ini dilakukan setiap 2 jam selama waktu inkubasi berlangsung yaitu dari jam ke-0 sampai jam ke-12 dan dilanjutkan pada jam ke-24. Pengukuran OD ini dimaksudkan untuk menduga pola pertumbuhan bakteri. Pada awal waktu inkubasi, pengukuran dilakukan langsung terhadap 5 ml media kultur. Tetapi untuk waktu inkubasi selanjutnya (disesuaikan dengan tingkat kekeruhan media) dilakukan pengenceran terlebih dahulu agar nilai OD tetap terbaca pada alat. Sebanyak 0.5 ml media kultur diencerkan dengan 4.5 ml media yang sama tetapi tidak mengandung kultur sehingga diperoleh faktor pengenceran 10. Blanko yang digunakan 19
adalah media tanpa kultur yang sama dengan media yang digunakan untuk pengencer. OD sampel diukur dengan menggunakan rumus sebagai berikut: OD terhitung = Od terukur x FP Keterangan: OD : optical density FP : faktor pengenceran 3. Analisis Total Gula Metode Fenol-Sulfat (Dubois et al. 1956) Total gula diukur setiap 2 jam selama waktu inkubasi yaitu dari jam ke-0 sampai jam ke-12 dan dilanjutkan pada jam ke-24. Persiapan sampel dilakukan dengan cara memisahkan gula dari BAL yang ditumbuhkan dan komponen lain yang terdapat dalam media. Hal ini dilakukan dengan cara mensentrifus media berisi BAL selama 10 menit pada kecepatan 4000 rpm. Selanjutnya sebanyak 1 ml supernatan dipipet dan ditambahkan NaOH 1 N sampai ph netral (2 tetes). Sebelum dianalisis, sampel diencerkan terlebih dahulu dengan akuades hingga mencapai konsentrasi pada kisaran konsentrasi kurva standar. Kemudian sampel sebanyak 0.5 ml dipipet untuk dianalisis total gulanya. Sampel tersebut dicampurkan dengan 0.5 ml larutan fenol 5% kemudian divorteks. Setelah itu, campuran tersebut ditambah dengan 2.5 ml H 2 SO 4 pekat lalu divorteks kembali dan disimpan selama 20 menit pada suhu ruang. Sampel kemudian diukur absorbansinya pada λ 490 nm. Hal yang sama dilakukan terhadap larutan glukosa standar dengan konsentrasi 20, 40, 60, 80, dan 100 µg/ml untuk pembuatan kurva standar. 4. Analisis Total Gula Pereduksi metode Park-Johnson (Takeda 2003) Penetapkan total gula pereduksi dilakukan setiap 2 jam selama waktu inkubasi berlangsung yaitu dari jam ke-0 sampai jam ke-12 dan dilanjutkan pada jam ke-24. Persiapan sampel yang dilakukan sama dengan persiapan sampel untuk analisis total gula. Sebelumnya disiapkan pula beberapa larutan yang dibutuhkan dalam analisis ini yaitu larutan buffer sodium karbonat-sodium hidrogen karbonat (larutan A), larutan potassium fericianida 0.1% (larutan B), dan larutan feric ammonium sulfat (larutan C). Pembuatan ketiga jenis larutan tersebut dapat dilihat pada Lampiran 3. Selanjutnya sebanyak 1 ml sampel dicampurkan dengan 0.5 ml larutan A dan 0.5 ml larutan B. Campuran tersebut dipanaskan selama 15 menit dalam air mendidih kemudian didinginkan dengan air yang mengalir selama 10 menit. Setelah cukup dingin, ke dalam campuran ditambahkan 2.5 ml larutan C lalu divorteks dan dibiarkan bereaksi selama 20 menit di suhu ruang. Sampel diukur absorbansinya pada λ 715 nm. Hal yang sama juga dilakukan terhadap larutan glukosa standar dengan konsentrasi 2, 4, 6, 8, dan 10 µg/ml untuk pembuatan kurva standar. 5. Analisis Persen Asam Laktat (AOAC 942.05, 1998) Penentuan jumlah persen asam laktat selama inkubasi dilakukan melalui pengukuran total asam tertitrasi (TAT) setiap 2 jam dari jam ke-0 sampai jam ke-12 dan 20
dilanjutkan pada jam ke-24. Pengukuran TAT dilakukan dengan mentitrasi kandungan asam pada sampel oleh basa standar yaitu NaOH 0.1 N. NaOH yang digunakan sebelumnya harus distandardisasi terlebih dahulu dengan menggunakan asam potassium phthalate (KHP). Prosedur standardisasi selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 4. Sebanyak 1 ml sampel dilarutkan dengan air destilata menjadi 25 ml di dalam labu takar. Kemudian sampel ditambahkan 2-3 tetes indikator phenolftalein lalu dititrasi dengan NaOH 0.1 N. Titik akhir titrasi tercapai saat muncul warna pink yang pertama. Perhitungan jumlah persen asam laktat dilakukan dengan menggunakan rumus berikut: Keterangan: Asam laktat (%) = V1 x N x BE x FP x 100% V2 x 1000 V1 N BE FP V2 : Volume NaOH 0.1 N yang telah distandardisasi : Normalitas NaOH hasil standardisasi : Bobot ekuivalen asam laktat (90.08 g/ekuivalen) : Faktor Pengenceran : Jumlah sampel yang dititrasi (ml) 6. Analisis ph (AOAC 973.41, 1998) Penentuan ph sampel dilakukan setiap 2 jam selama waktu inkubasi berlangsung yaitu pada jam ke-0 sampai jam ke-12 dan dilanjutkan pada jam ke-24. Sebelumnya ph meter dikalibrasi terlebih dahulu dengan buffer ph 7.00 dan kemudian dilanjutkan dengan buffer ph 4.00. Elektroda ph meter dibilas dahulu, dikeringkan dengan tisu, dicelup ke dalam buffer ph, dan ditunggu sampai layar menunjukkan nilai ph sesuai dengan buffer yang digunakan. Selanjutnya sebanyak 5 ml sampel diletakkan dalam gelas piala kemudian diukur ph-nya secara duplo. 7. Analisis Statistik Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan ANOVA (Analysis of Variance) dengan analisis lanjutan menggunakan uji Duncan pada taraf signifikansi 5%. Analisis statistik ini dilakukan terhadap data hasil hitungan cawan, nilai OD, gula pereduksi, total gula, ph, dan TAT (% asam laktat) dengan bantuan program SPSS 16 for Windows. 21