III.METODOLOGI PENELITIAN A. BAHAN DAN ALAT PENELITIAN 1. Kultur Kultur yang digunakan dalam penelitian ini adalah Enterococcus faecium IS-27526 (Genebank accession no. EF068251) dan Lactobacillus plantarum IS-10506 (GeneBank accession no. DQ860148) hasil isolasi dari dadih serta Lactobacillus casei strain Shirota atas izin Yakult. 2. Bahan Bahan bahan yang digunakan dalam penelitian adalah media pertumbuhan demann Rogosa Sharp Broth (MRSB) merk Oxoid dan demann Rogosa Sharp Agar (MRSA) merk Oxoid, m-mrsb yaitu MRSB modifikasi tanpa kandungan glukosa, prebiotik inulin (kemurnian > 90%) dan fruktooligosakarida atau FOS (kemurnian > 93.2%) dari PT Orafti Indonesia, serta glukosa, akuades, larutan pengencer buffer fosfat, alkohol, spiritus, NaOH 1N dan 0.1 N, buffer ph 4.0 dan ph 7.0, indikator fenolftalein (PP), serta indikator bromcresol purple (BCP). 3. Alat Alat-alat yang digunakan adalah phmeter, spektrofotometer, autoklaf, inkubator 37 C, vorteks, mikropipet, neraca analitik, oven pengering, serta alat-alat gelas lainnya. B. METODE PENELITIAN Penelitian ini terbagi menjadi dua tahap. Tahap pertama meliputi penyegaran kultur yang digunakan menjadi kultur kerja dan pembuatan kurva pertumbuhan E. faecium IS-27526 untuk mengetahui waktu dan jumlah yang tepat untuk ditambahkan ke uji prebiotik. Tahap kedua adalah melakukan pengujian pengaruh prebiotik terhadap pertumbuhan probiotik E. faecium IS-27526. Hasil pengujian akan dibandingkan dengan dua galur probiotik lainnya, yaitu L. plantarum IS-10506 sebagai pembanding dari probiotik isolat dadih dan juga L. casei strain Shirota
sebagai pembanding dari probiotik komersial. Pengujian pembanding ini dilakukan dengan metode dan pengukuran yang sama. 1. Aktivasi Kultur dan Kurva Pertumbuhan a. Aktivasi Kultur E. faecium IS-27526 merupakan strain isolat probiotik dari dadih yang disimpan dalam bentuk kultur kering pada suhu refrijerasi 7-10 o C. Kultur kerja dibuat dengan menyegarkan kultur dengan melakukan tahapan aktivasi sebanyak tiga kali mengacu pada penelitian yang dilakukan oleh Ariella (2009). E. faecium IS-27526 diambil 1 ose untuk disegarkan dalam 10 ml MRSB selama 24 jam pada suhu 37 o C. Pemurnian kultur dilakukan dengan menggores kuadran pada MRSA yang telah ditambahkan dengan indikator bromcresol purple (BCP) di cawan petri steril. Hasil goresan diinkubasi dalam posisi cawan terbalik pada suhu 37 o C selama 24 jam. Hasil pemurnian berupa koloni tunggal berwarna kuning yang berada pada area berwarna kuning pada cawan berisi MRSA. Koloni tunggal diambil 1 ose kemudian digores ke MRSA agar miring untuk diinkubasi pada 37 o C selama 24 jam untuk dijadikan kultur kerja. Kultur kerja dipastikan kemurniannya dengan melakukan pewarnaan gram untuk dilihat penampakannya di bawah mikroskop cahaya. Uji lain yang digunakan adalah uji katalase. Kedua perlakuan ini secara lebih lengkap terdapat pada Lampiran 1. Kultur BAL yang positif menampilkan warna ungu tanda gram positif dan tidak menunjukkan adanya gelembung udara sebagai hasil uji katalase yang negatif. Aktivasi kultur juga dilakukan pada kultur L. plantarum IS-10506 yang diperoleh dalam bentuk bubuk kering. Kultur L. casei strain Shirota ditumbuhkan pada MRSB selama 24 jam pada suhu 37 o C kemudian digores kuadran untuk memperoleh koloni tunggal.
b. Kurva Pertumbuhan (modifikasi Ariella, 2009) E. faecium IS-27526 dari MRS agar miring diaktifkan terlebih dahulu pada 10 ml MRSB dalam selang waktu 6 jam dalam inkubator 37 o C, kemudian dilakukan pengujian kurva pertumbuhan dengan mengambil 2% (v/v) ke dalam 10 ml MRSB. Pengukuran pertumbuhan E. faecium IS-27526 dilakukan dengan pengukuran absorbansi menggunakan alat spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm serta penghitungan jumlah total E. faecium IS-27526 yang tumbuh pada media MRSA dengan metode hitungan cawan. Pengukuran dilakukan dari jam ke-0 hingga jam ke-24 setiap 2 jam. Metode pengukuran kurva pertumbuhan dapat dilihat pada Lampiran 2. 2. Pengaruh Prebiotik terhadap Pertumbuhan E. faecium IS-27526 a. Persiapan Media Media yang digunakan dalam pengujian pengaruh prebiotik adalah media modifikasi MRSB (m-mrsb). Media ini merupakan hasil modifikasi MRSB yang dibuat tanpa kandungan glukosa sebagai sumber karbon dalam media. Pembuatan media m-mrsb ini mengacu pada pembuatan media yang pernah dilakukan oleh Hana (2007). Media m-mrsb 1 liter dipersiapkan dengan melarutkan Naasetat.3H 2 0 5 gram, MgSO 4.7H 2 O 0.2 gram, MnSO 4.4H 2 O 0.05 gram dalam sejumlah akuades. Bubuk pepton 10 gram, lab lemco powder 8 gram, dan yeast extract 4 gram dilarutkan dalam sejumlah akuades. Larutkan K2HPO4 2 gram dalam akuades secara terpisah. Ketiga larutan dicampur kemudian ditambahkan 1 ml Tween 80 hingga volume menjadi 1 liter dengan pelarut akuades. Larutan kemudian diaduk sambil dipanaskan, kemudian disterilisasi 121 0 C selama 15 menit Pembuatan larutan stok glukosa serta prebiotik 10% (b/v) dilakukan dengan melarutkan bubuk glukosa dalam akuades yang kemudian disterilisasi 121 o C selama 15 menit. Larutan stok prebiotik inulin dan FOS konsentrasi 10% (b/v) dibuat dengan melarutkan bubuk prebiotik dalam akuades, kemudian disterilisasi 100 o C selama 30 menit. Larutan
stok glukosa dan prebiotik 10% (b/v) diambil 1% (b/v) secara aseptis untuk ditambahkan ke dalam media m-mrsb pada pengujian. b. Pengujian Aktivitas Prebiotik Bakteri probiotik E. faecium IS-27526 yang tumbuh di agar miring diambil sejumlah 1 ose kemudian disegarkan terlebih dahulu ke dalam 10 ml MRSB dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 6 jam. Setelah itu, diambil sejumlah 2% (v/v) kultur segar untuk dimasukkan ke dalam 10 ml MRSB kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 8 jam untuk memperoleh kultur yang telah berada pada fase log atau eksponensial. Sebelum dimasukkan ke dalam media, absorbansi kultur dilihat terlebih dahulu pada λ600 nm untuk memperkirakan jumlahnya. Kultur awal diambil 1% (v/v) kemudian dimasukkan ke dalam empat jenis media cair untuk pengujian aktivitas prebiotik. Media tersebut adalah m-mrsb, m-mrsb + Glukosa sebagai standar, m- MRSB dengan prebiotik yaitu m-mrsb + Inulin dan m-mrsb + FOS. Kandungan sumber karbon, baik dari glukosa maupun prebiotik, sejumlah 1% (b/v) dari total volume media. Inkubasi kultur dilakukan pada suhu optimum 37 o C selama 24 jam (Huebner et al., 2007). Pengukuran dilakukan dari jam ke-0 hingga jam ke-24 setiap 4 jam, meliputi pengukuran absorbansi, ph, Total Asam Tertitrasi (TAT) yang kemudian dihitung persen asam laktat, dan penghitungan jumlah sel hidup E. faecium IS-27526 dengan metode hitungan cawan. Perlakuan pengukuran secara rinci terlampir pada Lampiran 3. Pengujian aktivitas prebiotik ini dilakukan dengan dua kali ulangan. Diagram alir pengujian pengaruh prebiotik terhadap pertumbuhan probiotik E. faecium IS-27526 terlampir pada Lampiran 4. 3. Pengaruh Prebiotik terhadap Pertumbuhan L. plantarum IS-10506 dan L. casei strain Shirota a. Persiapan Pengujian Persiapan pengujian dilakukan seperti persiapan pengujian terhadap E. faecium IS-27526, yaitu meliputi persiapan media m-mrsb serta larutan gula. Pada uji pembanding ini sumber karbon yang diuji hanya
larutan prebiotik inulin dan FOS masing-masing sebesar 1% (b/v) ke dalam total media dari larutan stok 10% (b/v) yang telah disterilisasi 100 o C selama 30 menit. b. Pengujian Aktivitas Prebiotik Pengujian pembanding ini dilakukan dengan melihat pengaruh prebiotik terhadap pertumbuhan L. plantarum IS-10506 dan L. casei strain Shirota. Pengujian dilakukan dalam dua kali ulangan tanpa penggunaan media m-mrsb + Glukosa. Pengukuran yang dilakukan meliputi pengukuran ph dan TAT (% asam laktat) yang dilakukan dari jam ke-0 hingga jam ke-12 setiap 4 jam. Sedangkan pengukuran jumlah sel hidup dengan metode hitungan cawan dilakukan pada jam ke-0 untuk jumlah awal, jam ke-8 untuk jumlah pada awal fase eksponensial, dan jam ke-12 untuk mengetahui jumlah akhir. Diagram alir pengujian pengaruh prebiotik terhadap pertumbuhan probiotik L. plantarum IS-10506 dan L. casei strain Shirota terlampir pada Lampiran 5. 4. Analisis Statistik Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan ANOVA (Analysis of Variance) dengan analisis lanjutan menggunakan uji Tukey pada taraf signifikansi 5%. Analisis statistik ini dilakukan pada jumlah sel hidup hasil hitungan cawan (log cfu/ml), ph media, dan TAT (% asam laktat) dengan variabel jenis media dan waktu inkubasi selama pengujian pengaruh prebiotik terhadap probiotik. Analisis statistik ini dilakukan dengan bantuan program SPSS 13.0 for Windows.