II. BAHAN DAN METODE Ikan Uji Ikan uji yang digunakan adalah ikan nila hibrida hasil persilangan resiprok 3 strain BEST, Nirwana dan Red NIFI koleksi Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar Sempur, Bogor. Rancangan persilangan resiprok selengkapnya disajikan pada Tabel 1. Tabel 1. Rancangan persilangan resiprok 3 strain ikan nila Jantan BEST Nirwana Red NIFI Betina BEST BB NB RB Nirwana BN NN RN Red NIFI BR NR RR
Keterangan: NB (NirwanaxBEST), BR (BESTxRed NIFI), BN (BESTxNirwana), RB (Red NIFIxBEST), NR (NirwanaxRed NIFI), RR (Red NIFIxRed NIFI), NN (NirwanaxNirwana), BB (BESTxBEST), RN (Red NIFIxNirwana) Ekstraksi DNA Metode yang digunakan dalam ekstraksi dan pemurnian genom DNA berdasarkan prosedur Fermentas dengan menggunakan Genomic DNA Purification KIT. Tahapan kerja yang dilakukan meliputi: Ekstraksi DNA dilakukan dengan membersihkan organ sirip dari larutan fiksatif (alkohol 70%), dengan cara direndam dan dirotasi ke dalam aquades, hingga sampel berada pada dasar wadah. Sampel diambil, dipotong kecil-kecil, lalu 20-25 mg sampel dengan 400 (l lysis solution dimasukkan dalam tabung eppendorf 1,5 ml, dicampur menggunakan vortex sampai homogen selama 20 detik, kemudian diinkubasi pada suhu 65 C selama 5 menit. Selanjutnya chloroform sebanyak 600 (l dimasukkan, lalu dicampur menggunakan vortex selama 20 detik, disentrifuse pada kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit. Precipitation solution dilakukan dengan mencampurkan 720 (l H2O dengan 80 (l diambil dari 10x konsentrasi solution. Supernatan dipindahkan ke tabung eppendorf baru yang berisi 800 (l precipitation solution, dicampur menggunakan vortex pada suhu ruang selama 2 menit. Disentrifuse pada kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit hingga DNA mengendap. Supernatan yang mengandung DNA diambil dan dikeringkan. Setelah kering supernatan ditambahkan 100 (l NaCl (1,2 M). Etanol absolut dingin sebanyak 300 (l dimasukkan, kemudian endapan DNA diinkubasi pada suhu -20 C selama 10 menit. Selanjutnya disentrifuse pada kecepatan 10.000 rpm selama 3-4 menit. Etanol dalam tabung eppendorf dibuang kemudian dibilas dengan etanol dingin 70%, atau setelah kering dapat langsung ditambahkan 100 (l H2O. Keberadaan DNA genom dapat diketahui dengan cara elektroforesis yakni menambahkan 3 (l DNA hasil ekstraksi dengan 1 (l loading dye pada gel agarose 1%. Media elektroforesis atau gel agarose 1% dibuat dengan agarose dimasukkan ke dalam tabung erlenmeyer sebanyak 0,30 g dalam 30 ml larutan Tris-Borate-EDTA (TBE 1%). Kemudian batu magnetic stirer dimasukan untuk mengaduk larutan, tabung ditutup dengan aluminium foil. Tabung erlenmeyer diletakkan di atas heater stirer pada suhu 100 C dan kecepatan putaran 5 6 mot. Larutan dipanaskan
hingga berwarna bening, selanjutnya dituang ke dalam cetakan ukuran dan sisir (comb) dipasang untuk membentuk sumur (well). Gel yang telah membeku dapat langsung digunakan untuk elektroforesis atau disimpan dengan direndam dalam larutan TBE 1%. Setelah DNA dan loading dye dimasukkan dalam sumur gel, selanjutnya bak elektroforesis dialirkan listrik dengan tegangan 100 V dengan kuat arus yang terprogram secara otomatis. Proses elektroforesis dihentikan setelah DNA bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif mencapai tiga per empat bagian panjang gel. Hasil elektroforesis diwarnai dengan merendam gel dalam larutan ethidium bromide dengan konsentrasi 5 ppm selama 20 menit. Keberadaan DNA pada gel dapat dilihat dengan menggunakan ultraviolet transilluminator dan didokumentasikan dengan film polaroid. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Jenis primer yang digunakan dalam penelitian ini disajikan pada Tabel 2 sebagai berikut. Tabel 2. Jenis primer yang digunakan dalam RAPD-PCR No. Kode Primer Urutan basa (5 3 ) Panjang nukleotida G+C (%) 1. OPA-02 TGC CGA GCT G 70%
2. OPA-03 AGT CAG CCA C 60% 3. OPC-05 GTC CCG ACG A 70% Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan metode RAPD-PCR dengan komposisi bahan: 1 (l primer, 3 (l DNA, 12,5 (l 2x PCR Master Mix dan 8,5 (l H2O nuklease free; dengan total volume 25 (l dicampur menjadi 1 unit. Seluruh bahan dicampur dengan cara memasukkannya ke dalam tabung eppendorf 0,5 ml kemudian dihomogenkan menggunakan vorteks selama 20 detik dan diputar menggunakan spin sampai tidak ada gelembung. Selanjutnya dimasukkan dalam thermocycler dengan siklus sebanyak 35 cycle, yaitu: satu siklus denaturasi awal pada suhu 94 C selama 2 menit, 34 siklus selanjutnya terdiri atas denaturasi pada suhu 94 C selama 1 menit, annealing 36 C selama 1 menit dan extention72 C selama 2 menit. Final extention pada suhu 72 C selama 7 menit. Hasil RAPD-PCR dilihat melalui elektroforesis atau disimpan di dalam lemari pendingin dengan suhu 4 C. Untuk satu sampel ikan, proses PCR ini dilakukan sebanyak jumlah primer yang digunakan (3 primer). Setiap satu kali proses PCR, jumlah primer yang digunakan sebanyak 1 primer, hingga ketiga primer selesai digunakan. Elektroforesis Setelah didapatkan DNA hasil amplifikasi, selanjutnya dilakukan tahapan elektroforesis dengan cara menambahkan 2 (l loading dye dengan 7 (l DNA hasil amplifikasi pada gel agarose 1,5%, kemudian dimasukkan pada sumur elektroforesis. Salah satu sumur diisi dengan marker atau penanda yang telah diencerkan dengan perbandingan 2 (l DNA ladder : 1 (l loading dye : 3 (l
akuades. Selanjutnya dilakukan tahapan running dan staining, lalu diamati di atas ultraviolet transilluminator dan didokumentasikan dengan film polaroid. Analisis Data Tingkat polimorfisme dan heterozigositas dianalisa dengan menggunakan descriptive statistics (Miller, 1997) serta analisis statistik menggunakan exact test for population differentiation (Raymond & Rousset, 1995 dalam Miller, 1997) dengan menggunakan program TFPGA (Tools for Population Genetic Analyses). Kekerabatan antar populasi dianalisis dengan menggunakan jarak genetik, berdasarkan program UPGMA Wright (1978) modifikasi Rogers (1972) dalam Miller (1997) dari software TFPGA. Data yang dihasilkan dari penggunaan program tersebut berupa konstruksi pohon filogeni yang disajikan dalam bentuk dendrogram.