BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Uraian Bahan 2.1.1 Rifampisin 2.1.1.1 Sifat Fisikokimia Rumus Struktur : Rumus molekul : C 43 H 58 N 4 O 12 Nama kimia : 5,6,9,17,19,21-Heksahidroksi-23-metoksi-2,4,12,16,18,20,22- heptametil-8-[n-(4-metil-1-piperazinil)formimidoil]-2,7- (epoksipentadeka[1,11,13]trienimino]nafto[2,1-b]furan-1,11-(2h)- dion 21-asetat [13292-46-1] Berat molekul : 822,95 Pemerian : Serbuk hablur, coklat merah. Kelarutan : Sangat sukar larut dalam air; mudah larut dalam kloroform; larut dalam etil asetat dan dalam metanol (Ditjen POM, 1995).
2.1.1.2 Farmakologi Antibiotikum ini adalah derivat semisintetis dari rifamisin B yang dihasilkan oleh Streptomyces mediterranei. Rifampisin bersifat bakterisid luas terhadap fase pertumbuhan M. tuberkulosae dan M. leprae, baik yang berada di luar maupun di dalam sel. Obat ini mematikan kuman yang dormant selama fase pembelahan yang singkat. Maka, obat ini sangat penting untuk membasmi semua basil guna mencegah kambuhnya TBC. Rifampisin juga aktif terhadap kuman gram-positif dan kuman gram-negatif. Mekanisme kerjanya berdasarkan perintangan spesifik dari suatu enzim bakteri RNApolymerase, sehingga sintesa RNA terganggu. Resorpsinya di usus sangat tinggi, distribusinya ke jaringan dan cairan tubuh juga baik. Plasma t 1 / 2 nya berkisar antara 1,5 sampai 5 jam dan meningkat bila ada gangguan fungsi hati. Di lain pihak, masa paruh ini akan turun pada pasien yang bersamaan waktu menggunakan isoniazid. Dalam hati terjadi desasetilasi dengan terbentuknya metabolitmetabolit dengan kegiatan antibakteriil. Ekskresinya melalui empedu (Tjay dan Rahardja, 2002). 2.1.1.3 Efek Samping Menimbulkan warna oranye yang tidak berbahaya pada urin, keringat, air mata dan lensa mata. Efek samping yang sering terjadi termasuk kulit kemerahan, trombositopenia, nefritis dan gangguan fungs hati (Katzung, 1998). 2.1.1.4 Dosis Oral 1 dd 450-600 mg sekaligus pagi hari sebelum makan, selalu diberikan dalam kombinasi dengan isoniazid 300 mg dan untuk 2 bulan pertama ditambah pula dengan 1,5-2 g pirazinamid setiap hari (Tjay dan Rahardja, 2002).
2.1.2 Isoniazid 2.1.2.1 Sifat Fisikokimia Rumus Struktur : Rumus molekul : C 6 H 7 N 3 O Nama kimia : Asam isonikotinat hidrazida [54-85-3] Berat molekul : 137,14 Pemerian : Hablur putih atau tidak berwarna atau serbuk hablur putih; tidak berbau, perlahan-lahan dipengaruhi oleh udara dan cahaya. Kelarutan : Mudah larut dalam air; agak sukar larut dalam etanol; sukar larut dalam kloroform dan dalam eter (Ditjen POM, 1995). 2.1.2.2 Farmakologi Derivat asam isonikotinat ini berkhasiat tuberkulostatis paling kuat terhadap M. tuberkulosae dan bersifat bakterisid terhadap basil yang sedang tumbuh pesat. Aktif terhadap kuman yang berada intraseluler dalam makrofag maupun di luar sel (ekstraseluler). Mekanisme kerjanya berdasarkan terganggunya sintesa mycolic acid, yang diperlukan untuk membangun dinding bakteri. Isoniazid masih tetap merupakan obat
kemoterapi terpenting terhadap berbagai tipe tuberkulosa dan selalu dalam bentuk multiple terapi dengan rifampisin dan pirazinamid. Resorpsinya dari usus sangat cepat, difusinya ke dalam jaringan dan cairan tubuh baik sekali, bahkan menembus jaringan yang sudah mengeras. Penetrasi yang cepat ini sangat penting dalam pengobatan tuberculous meningitis. Di dalam hati, isoniazid diasetilasi oleh enzim asetiltransferase menjadi metabolit inaktif. Plasma t 1 / 2 nya antara 1 dan 4 jam tergantung pada kecepatan asetilasi. Ekskresinya melalui ginjal (Tjay dan Rahardja, 2002). 2.1.2.3 Efek Samping Gatal-gatal, ikterus, polineuritis, perasaan tidak sehat, letih dan lemah, anoreksia, kadang-kadang terjadi kerusakan hati dengan hepatitis dan ikterus yang fatal (Tjay dan Rahardja, 2002). 2.1.2.4 Dosis Oral/i.m. dewasa dan anak-anak 1 dd 4-8 mg/kg/hari sehari atau 1 dd 300-400 mg, atau sebagai single dose bersama rifampisin, pagi hari a.c. atau sesudah makan bila terjadi gangguan lambung (Tjay dan Rahardja, 2002). 2.2 Spektrofotometri Ultraviolet 2.2.1 Teori Spektrofotometri Ultraviolet Spektrofotometri serapan merupakan pengukuran suatu interaksi antara radiasi elektromagnetik dan molekul atau atom dari suatu zat kimia. Teknik yang sering digunakan dalam analisis farmasi meliputi spektrofotometri ultraviolet, cahaya tampak, inframerah dan serapan atom. Jangkauan panjang gelombang untuk daerah ultraviolet adalah 190-380 nm, daerah cahaya tampak 380-780 nm, daerah inframerah dekat 780-3000 nm, dan daerah inframerah 2,5-40 µm atau 4000-250 cm -1 (Ditjen POM, 1995).
Sinar ultraviolet dan sinar tampak memberikan energi yang cukup untuk terjadinya transisi elektronik. Transisi-transisi elektronik akan meningkatkan energi molekuler dari keadaan dasar ke satu atau lebih tingkat energi tereksitasi. Jika suatu molekul sederhana dikenakan radiasi elektromagnetik maka molekul tersebut akan menyerap radiasi elektromagnetik yang energinya sesuai. Interaksi antara molekul dengan radiasi elektromagnetik ini akan meningkatkan energi potensial elektron dari tingkat dasar ke tingkat tereksitasi. Apabila pada molekul yang sederhana tadi hanya terjadi transisi elektronik pada satu macam gugus yang terdapat pada molekul, maka hanya akan terjadi satu absorpsi yang merupakan pita spektrum. Terjadinya dua atau lebih pita spektrum diberikan oleh molekul dengan struktur yang lebih kompleks karena terjadi beberapa transisi sehingga mempunyai lebih dari satu panjang gelombang (Gandjar dan Rohman, 2007). Gugus fungsi yang menyerap radiasi di daerah ultraviolet dekat dan daerah tampak disebut gugus kromofor dan hampir semua gugus ini mempunyai ikatan tak jenuh. Pada kromofor jenis ini transisi terjadi dari π π*, yang menyerap pada panjang gelombang maksimum kecil dari 200 nm (tidak terkonyugasi), misalnya pada >C=C< dan C C. Kromofor ini merupakan tipe transisi dari sistem yang mengandung elektron π pada orbital molekulnya. Untuk senyawa yang mempunyai sistem konyugasi, perbedaan energi antara keadaan dasar dan keadaan tereksitasi menjadi lebih kecil sehingga penyerapan terjadi pada panjang gelombang yang lebih besar (Dachriyanus, 2004). Gugus fungsi seperti OH, -O, -NH 2, dan OCH 3 yang memberikan transisi n π* disebut gugus auksokrom. Gugus ini adalah gugus yang tidak dapat menyerap radiasi ultraviolet-sinar tampak, tetapi apabila gugus ini terikat pada gugus kromofor mengakibatkan pergeseran panjang gelombang ke arah yang lebih besar (pergeseran batokromik) (Gandjar dan Rohman, 2007).
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam analisis spektrofotometri ultraviolet: a. Pemilihan panjang gelombang maksimum Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang gelombang dimana terjadi serapan maksimum. Untuk memperoleh panjang gelombang maksimum, dilakukan dengan membuat kurva hubungan antara absorbansi dengan panjang gelombang dari suatu larutan baku pada konsentrasi tertentu. b. Pembuatan kurva kalibrasi Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai konsentrasi. Masing-masing absorbansi larutan dengan berbagai konsentrasi diukur, kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi dengan konsentrasi. Bila hukum Lambert-Beer terpenuhi maka kurva kalibrasi merupakan garis lurus. c. Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikan Absorbansi yang terbaca pada spektrofotometer hendaknya antara 0,2-0,6. Anjuran ini berdasarkan anggapan bahwa pada kisaran nilai absorbansi tersebut, kesalahan fotometrik yang terjadi adalah paling minimal (Gandjar dan Rohman, 2007). 2.2.2 Hukum Lambert-Beer Menurut Hukum Lambert, serapan berbanding lurus terhadap ketebalan sel yang disinari. Sedangkan menurut Beer, serapan berbanding lurus dengan konsentrasi, ini berlaku untuk radiasi monokromatis dalam larutan yang sangat encer. Kedua pernyataan ini dapat dijadikan satu dalam Hukum Lambert-Beer, sehingga diperoleh bahwa serapan berbanding lurus terhadap konsentrasi dan ketebalan sel, yang dapat ditulis dengan persamaan : A= a.b.c (g/liter) atau A= ε. b. c (mol/liter) Dimana: A = serapan
a = absorptivitas b = ketebalan sel c = konsentrasi ε = absorptivitas molar Hukum Lambert-Beer menjadi dasar aspek kuantitatif spektrofotometri dimana konsentrasi dapat dihitung berdasarkan rumus di atas. Absorptivitas merupakan suatu tetapan dan spesifik untuk setiap molekul pada panjang gelombang dan pelarut tertentu. Menurut Roth dan Blaschke (1981), absorptivitas spesifik juga sering digunakan untuk menggantikan absorptivitas. Harga ini, memberikan serapan larutan 1 % (b/v) dengan ketebalan sel 1 cm, sehingga dapat diperoleh persamaan: A = A 1 1. b. c Dimana : A 1 1 = absorptivitas spesifik b = ketebalan sel c = konsentrasi senyawa terlarut (g/100ml larutan) 2.2.3 Penggunaan Spektofotometri Ultraviolet Analisis kualitatif Secara eksperimental, sangat mudah untuk mengukur banyaknya radiasi yang diserap oleh suatu molekul sebagai fungsi frekuensi radiasi. Suatu grafik yang menghubungkan antara banyaknya sinar yang diserap dengan frekuensi (atau panjang gelombang) sinar merupakan spektrum absorpsi. Transisi yang dibolehkan untuk suatu molekul dengan struktur kimia yang berbeda adalah tidak sama sehingga spektrum absorpsinya juga berbeda. Dengan demikian, spektrum dapat digunakan sebagai bahan informasi yang bermanfaat untuk analisis kualitatif (Gandjar dan Rohman, 2007).
Analisis kuantitatif Penggunaan utama spektrofotometri ultraviolet adalah dalam analisis kuantitatif. Apabila dalam alur spektrofotometer terdapat senyawa yang mengabsorpsi radiasi, akan terjadi pengurangan kekuatan radiasi yang mencapai detektor. Parameter kekuatan energi radiasi yang diabsorpsi oleh molekul adalah absorban (A) yang dalam batas konsentrasi tertentu nilainya sebanding dengan banyaknya molekul yang mengabsorpsi radiasi. Senyawa yang tidak mengabsorpsi radiasi ultraviolet-sinar tampak dapat juga ditentukan dengan spektrofotometri ultraviolet-sinar tampak, apabila ada reaksi kimia yang dapat mengubahnya menjadi kromofor atau dapat disambungkan dengan suatu pereaksi kromofor (Satiadarma, 2004). Analisis kuantitatif secara spektrofotometri ultraviolet dapat dilakukan dengan metode regresi dan pendekatan. 1. Metode Regresi Analisis kuantitatif dengan metode regresi yaitu dengan menggunakan persamaan regresi yang didasarkan pada harga serapan dan konsentrasi standar yang dibuat dalam beberapa konsentrasi, paling sedikit menggunakan 5 rentang konsentrasi yang meningkat yang dapat memberikan serapan yang linier, kemudian diplot menghasilkan suatu kurva yang disebut dengan kurva kalibrasi. Konsentrasi suatu sampel dapat dihitung berdasarkan kurva tersebut. 2. Metode Pendekatan Analisis kuantitatif dengan cara ini dilakukan dengan membandingkan serapan standar yang konsentrasinya diketahui dengan serapan sampel. Konsentrasi sampel dapat dihitung melalui rumus perbandingan C = As. Cb / Ab dimana As = serapan sampel, Ab = serapan standar, Cb = konsentrasi standar, dan C = konsentrasi sampel (Holme dan Peck, 1983).
2.2.4 Peralatan Untuk Spektrofotometri Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitans atau serapan suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Spektrofotometer merupakan penggabungan dari dua fungsi alat yang terdiri dari spektrometer yang menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer sebagai alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi (Day dan Underwood, 1981). Unsur -unsur terpenting suatu spektrofotometer adalah sebagai berikut: 1. Sumber-sumber lampu: lampu deuterium digunakan untuk daerah UV pada panjang gelombang dari 190-350 nm, sementara lampu halogen kuarsa atau lampu tungsten digunakan untuk daerah visibel pada panjang gelombang antara 350-900 nm. 2. Monokromotor: digunakan untuk memperoleh sumber sinar yang monokromatis. Alatnya dapat berupa prisma maupun grating. Untuk mengarahkan sinar monokromatis yang diinginkan dari hasil penguraian. 3. Kuvet (sel): digunakan sebagai wadah sampel untuk menaruh cairan ke dalam berkas cahaya spektrofotometer. Kuvet itu haruslah meneruskan energi radiasi dalam daerah spektrum yang diinginkan. Pada pengukuran di daerah tampak, kuvet kaca atau kuvet kaca corex dapat digunakan, tetapi untuk pengukuran pada daerah ultraviolet kita harus menggunakan sel kuarsa karena gelas tidak tembus cahaya pada daerah ini. Kuvet tampak dan ultraviolet yang khas mempunyai ketebalan 1 cm, namun tersedia kuvet dengan ketebalan yang sangat beraneka, mulai dari ketebalan kurang dari 1 milimeter sampai 10 cm bahkan lebih. 4. Detektor: Peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai panjang gelombang. 5. Suatu amplifier (penguat) dan rangkaian yang berkaitan yang membuat isyarat listrik itu dapat dibaca.
6. Sistem pembacaan yang memperlihatkan besarnya isyarat listrik (Day and Underwood, 1981). 2.3 Validasi Validasi adalah suatu tindakan terhadap parameter tertentu pada prosedur penetapan yang dipakai untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (WHO, 1992). Parameter analisis yang ditentukan pada validasi adalah akurasi, presisi, kespesifikan, limit deteksi, limit kuantitasi, linieritas dan rentang. Akurasi (kecermatan) adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit sebenarnya. Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (% recovery) analit yang ditambahkan dan dapat ditentukan melalui dua cara yaitu metode simulasi (spiked placebo recovery) dan metode penambahan bahan baku (standard addition method). Dalam kedua metode tersebut, persen perolehan kembali dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya. A B % Perolehan Kembali = x100% C Keterangan : A = konsentrasi sampel yang diperoleh setelah penambahan baku B = konsentrasi sampel sebelum penambahan baku C = konsentrasi baku yang ditambahkan Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya diekspresikan sebagai relatif standar deviasi (RSD) dari sejumlah sampel yang berbeda secara signifikan secara statistik.
Batas deteksi (limit of detection) didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat terdeteksi. Batas deteksi dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut: 3xSB Batas deteksi = Slope Batas kuantitasi (limit of quantitation) didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan. 10xSB Batas Kuantitasi = Slope Kelinieran suatu metode analisis adalah kemampuan untuk menunjukkan bahwa nilai hasil uji langsung atau setelah diolah secara matematika, proporsional dengan konsentrasi analit dalam sampel dalam batas rentang konsentrasi tertentu. Rentang suatu metode analisis adalah interval antara batas konsentrasi tertinggi dan konsentrasi terendah analit yang dapat ditentukan dengan presisi, akurasi dan kelinieran (Rohman, 2007; Satiadarma, 2004).