10 3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan selama tiga bulan. Bahan penelitian berupa hasil samping produksi karagenan diperoleh dari PT. Araminta Sidhakarya, Tangerang. Fermentasi sampel dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Analisis kandungan nutrien yang meliputi kadar air, abu, protein kasar, serat kasar, lemak kasar dan BET-N dilakukan di Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, serta analisis daya cerna in vitro dilakukan di Laboratorium Ilmu Nutrisi Ternak Perah, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah termometer, timbangan analitik, cawan porselen, oven, desikator, tabung reaksi, gelas erlenmeyer, tabung kjeldahl, tabung sokhlet, pemanas, destilator, buret, tanur. Analisis invitro terdiri dari analisis Kecernaan Bahan Kering/Organik, analisis kandungan NH 3 serta analisis kandungan VFA (asam lemak mudah menguap). Alat yang digunakan dalam analisis in vitro ini adalah tabung (tube) sentrifuse polypropylene 50 ml dan tutup karet berventilasi, pompa vakum, shaker bath dengan suhu air pemanas 39-40 o C, cawan porselin, sentrifuse, tanur listrik, mikroburet 0,001 ml, erlenmeyer, seperangkat alat destilasi, pembakar Bunsen atau kompor listrik serta kertas saring whatman nomor 41. Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah hasil samping produksi karagenan. Bahan yang digunakan pada analisis kandungan nutrien adalah akuades, H 2 SO 4, NaOH, HCl, dan pelarut heksana. Analisis in vitro menggunakan bahan-bahan, seperti H 2 SO 4 15%, larutan McDougal dengan suhu 39 o C dengan ph 6,5-6,9, cairan rumen segar dengan suhu 39 o C, larutan pepsin- HCl 0,2%, larutan HCl 0,5 N, larutan HgCl 2 jenuh, larutan Na 2 CO 3 jenuh, larutan H 2 SO 4 0,005 N, asam borat berindikator (BB) serta vaselin. 3.3 Metode Penelitian
11 Penelitian ini dibagi dalam beberapa tahap yaitu pengayaan nutrient hasil samping produksi karagenan, analisis proksimat dan uji fermentabilitas secara in vitro. 3.3.1 Pengayaan Nutrien Hasil Samping Produksi Keragenan Penelitian diawali dengan melakukan pengecilan ukuran partikel bahan fermentasi hasil samping produksi karagenan. Bahan yang telah dikeringkan, digiling, ditimbang sebanyak 50 gram, diberi air panas sambil diaduk rata sampai agak basah, kemudian disterilisasi selama 15 menit diangkat dan didinginkan. Hasil samping produksi karagenan yang telah didinginkan ditambahkan NPK yang sudah dilarutkan dalam air (± 1 sendok makan) dengan konsentrasi NPK 0%, 5%, 10%, 15% dari berat keringnya. Setelah itu diinokulasi campuran biakan ragi tempe sebanyak 1 gram atau 2% inokulum per gram substrat kering dan diletakkan dalam baki plastik kemudian ditutup dengan plastik, difermentasi pada suhu kamar selama 21 hari (Lampiran 1) Setelah waktu fermentasi selesai dilakukan beberapa analisis. Analisis yang dilakukan yaitu, analisis kandungan nutriennya melalui uji proksimat (kadar air, abu, lemak dan protein), serta analisis pengukuran kecernaan in vitro yang meliputi uji amonia, analisis VFA, KCBK serta KCBO. Diagram alir penelitian dapat dilihat pada Gambar 2. Hasil Samping Produksi Karagenan Penggilingan dan Sterilasasi Penambahan Pupuk NPK (0 %, 5%, 10%, Fermentasi 21 Hari dengan Ragi Tempe Analisis Proksimat (air, abu, protein, serat, lemak, Karbohidrat) Uji In Vitro (amonia, VFA, KCBK, KCBO Gambar 2 Diagram alir penelitian 3.3.2 Analisis Proksimat (AOAC 1995)
12 Bahan yang dianalisis digiling terlebih dahulu dengan saringan 2 mm. Analisis proksimat yang dilakukan meliputi uji kadar air dan uji kadar abu menggunakan metode oven, uji kadar lemak menggunakan metode sokhlet dan uji kadar protein mengggunakan metode kjeldahl. (1) Analisis kadar air Cawan yang digunakan dioven terlebih dahulu selama 30 menit pada suhu 100 0-105 0 C, kemudian didinginkan dalam desikator untuk menghilangkan uap air dan ditimbang (A). Sampel ditimbang sebanyak 2 g dalam cawan yang sudah dikeringkan (B), kemudian dioven pada suhu 100-105 0 C selama 6 jam lalu didinginkan dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang (C). Kadar air dihitung dengan rumus: B - C % Kadar air x100 % B - A Keterangan: A = Berat cawan kosong (g) B = Berat cawan dengan sampel (g) C = Berat cawan dengan sampel setelah dikeringkan (g). (2) Analisis kadar abu Cawan yang digunakan dioven terlebih dahulu selama 30 menit pada suhu 100-105 0 C, kemudian didinginkan dalam desikator untuk menghilangkan uap air dan ditimbang (A). Sampel ditimbang sebanyak 2 g dalam cawan yang sudah dikeringkan (B), kemudian dibakar diatas nyala pembakar sampai tidak berasap dan dilanjutkan dengan pengabuan didalam tanur dengan suhu 550-600 0 C sampai pengabuan sempurna (sesekali pintu tanur dibuka sedikit agar oksigen masuk). Sampel yang sudah diabukan didinginkan dalam desikator dan ditimbang (C). Kadar abu dihitung dengan rumus: C - A % Kadar abu x100 % B - A Keterangan: A = Berat cawan abu porselen kosong (g) B = Berat cawan abu porselen dengan sampel (g)
13 3) Analisis kadar lemak C = Berat cawan abu porselen dengan sampel setelah dikeringkan (g). Sampel seberat 3 g (W 1 ) dimasukkan ke dalam kertas saring dan dimasukkan ke dalam selongsong lemak, kemudian dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya (W 2 ), dan disambungkan dengan tabung sokhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung sokhlet dan disiram dengan pelarut lemak. Tabung ekstraksi dipasang pada alat destilasi sokhlet lalu dipanaskan pada suhu 40 0 C dengan menggunakan pemanas listrik selama 6 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor saat destilasi, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105 0 C, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan (W 3 ). Perhitungan kadar lemak pada sampel % Kadar Lemak Keterangan: W 1 = Berat sampel (g) W 2 = Berat labu lemak tanpa lemak (g) W 3 = Berat labu lemak dengan lemak (g) (4) Analisis kadar protein Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. (a) Tahap destruksi Sampel ditimbang seberat 0,5 g kemudian dimasukkan ke dalam tabung kjeltec. Satu butir kjeltab dimasukkan ke dalam tabung tersebut dan ditambahkan 10 ml H 2 SO 4. Tabung yang berisi larutan tersebut dimasukkan ke dalam alat pemanas dengan suhu 410 0 C ditambahkan 10 ml air. Proses destruksi dilakukan sampai larutan menjadi bening.
14 (b) Tahap destilasi Tahap destilasi terdiri dari 2 pengujian, yaitu persiapan dan sampel. Tahap persiapan dilakukan dengan membuka kran air kemudian dilakukan pengecekan alkali dan air dalam tanki, tabung dan erlenmeyer yang berisi akuades diletakkan pada tempatnya. Tombol power ditekan pada kjeltech system yang dilanjutkan dengan menekan tombol steam dan tungku beberapa lama sampai air di dalam tabung mendidih. Steam dimatikan dan tabung kjeltech dan erlenmeyer dikeluarkan dari alat kjeltech system. Tahap sampel dilakukan dengan meletakkan tabung yang berisi hasil didestruksi ke dalam kjeltech system beserta erlenmeyer yang diberi asam borat. Destilasi dilakukan sampai volume larutan dalam erlenmeyer yang berisi asam borat mencapai 200 ml. (c) Tahap titrasi Titrasi dilakukan dengan menggunakan HCl 0,1 N sampai warna larutan pada erlenmeyer berubah warna menjadi pink. Perhitungan kadar protein pada sampel: % Nitrogen = (ml HCl sampel ml HCl blanko)x 0,1 N HCl x 14 x 100% mg sampel % Kadar Protein = % nitrogen x faktor konversi (5) Analisis kadar serat kasar ( Apriyantono et al.1989) Sebanyak 2 g contoh bebas air dimasukkan ke dalam erlenmeyer 500 ml dan ditambahkan 100 ml H 2 SO 4 0,325 N. Campuran tersebut dihidrolisis dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 105 o C dan didinginkan serta ditambahkan NaOH 1,25 N sebanyak 50 ml. Kemudian dilakukan hidrolisis kembali dalam autoklaf selama 15 menit. Sampel disaring dengan kertas saring yang telah dikeringkan dan diketahui bobotnya. Kertas saring tersebut dicuci berturut-turut dengan air panas, 25 ml H 2 SO 4 0,325 N, air panas dan terakhir menggunakan aseton/alkohol 25 ml. Kertas saring tersebut dikeringkan dalam oven bersuhu 105 o C selama 1 jam dan dilanjutkan sampai bobotnya tetap. Kadar serat kasar ditentukan dengan rumus:
15 Kadar serat kasar (%) = a b x 100% c Keterangan: a = bobot residu serat dalam kertas saring (g) b = bobot kertas saring kering (g) c = bobot bahan awal (g) (6) Analisis kadar karbohidrat by difference Kadar karbohidrat dihitung dengan rumus sebagai berikut: Kadar karbohidrat(%) = 100%- (% kadar air + % kadar abu + % kadar lemak + % kadar protein + % kadar serat kasar) 3.3.3 Pengukuran Kecernaan Fermentatif Kecernaan in vitro dilakukan dengan metode Tilley dan Terry (1963). Sebanyak 1 g sampel perlakuan, 40 ml larutan McDougall dan 10 ml cairan rumen dimasukkan kedalam tabung fermentor sambil dialiri gas CO 2 selama 30 detik dan ditutup dengan menggunakan karet berventilasi. Tabung fermentor tersebut dimasukkan ke dalam water bath shaker dengan suhu 39 o C dan diinkubasi selama 48 jam. Setelah 48 jam waktu inkubasi, tabung fermentor diambil dan ditambahkan 0,2 ml HgCl 2 untuk mematikan mikroba rumen sehingga proses fermentasi terhenti. Campuran dalam tabung fermentor disentrifuse dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit dan supernatan yang dihasilkan digunakan untuk analisa VFA dan NH 3. 3.3.4 Analisis Konsentrasi Amonia Analisis amonia dilakukan dengan metode mikrodifusi cawan conway (University of Wisconsin 1966). Bibir cawan conway dan tutupnya diolesi dengan vaselin. Sebanyak 1 ml supernatan ditempatkan pada salah satu sisi sekat cawan dan sisi yang lain ditempatkan 1ml larutan Na 2 CO 3. jenuh (kedua bahan tidak boleh bercampur sebelum tutup cawan ditutup rapat). Sebanyak 1 ml asam borat berindikator merah metil dan hijau bromo kresol pada ph 5,5 dipipet dan dimasukkan ke cawan kecil yang terletak di tengah cawan conway. Cawan conway ditutup rapat dengan permukaan (tutup) cawan, kemudian digerakkan hingga supernatan dan Na 2 CO 3 jenuh tercampur rata dan dibiarkan selama 24 jam
16 pada suhu kamar. Setelah 24 jam, tutup cawan dibuka, asam borat berindikator dititrasi dengan H 2 SO 4 0,005 N sampai warnanya berubah dari biru menjadi kemerah-merahan. Konsentrasi amonia dapat dihitung dengan rumus : Konsentrasi amonia (mm) = ml H 2 SO 4 x N H 2 SO 4 x 1000 Berat ransum x % BK Ransum 3.3.5 Konsentrasi Volatile Fatty Acids (VFA) Analisis VFA dilakukan dengan teknik destilasi uap (steam destilation) (University of Wisconsin 1966). Rangkaian alat pengujian konsentrasi VFA dapat dilihat pada Lampiran 2. Sebanyak 5 ml supernatan dimasukkan ke dalam tabung destilasi, lalu ditambahkan 1 ml H 2 SO 4 15% dan tabung segera ditutup. Proses destilasi dilakukan dengan cara menghubungkan tabung dengan labu yang berisi air mendidih. Uap air panas akan mendesak VFA dan akan terkondensasi di dalam pendingin. Destilat ditampung di dalam labu erlenmeyer yang berisi 5 ml NaOH 0,5 N sehingga volumenya mencapai 250-300 ml. Setelah itu ditambahkan indikator Phenolptalein sebanyak 2 tetes dan dititrasi dengan HCl 0,5 N sampai warna titrat berubah dari warna merah jambu menjadi bening. Konsentrasi VFA dapat dihitung dengan rumus : Konsentrasi VFA (mm) = (a-b) x N HCl x 1000/5 ml Berat ransum x % BK Ransum Keterangan : a= volume titran blanko (ml) b= volume titran sampel (ml) 3.3.6 Analisis Kandungan KCBK dan KCBO Endapan yang diperoleh dari tahapan pencernaan fermentatif, selanjutnya ditambah dengan 50 ml larutan pepsin HCl 0,2%. Inkubasi dilanjutkan hingga 48 jam pada suhu air water bath 39 O C. Setelah selesai masa inkubasi, sisa pencernaan disaring menggunakan kertas saring Whatman No. 41 dengan dibantu menggunakan pompa vakum. Kertas saring sebelumnya telah diketahui kadar airnya. Hasil saringan dimasukkan ke dalam cawan porselin dan dikeringkan di dalam oven 105 o C selama 24 jam untuk mengetahui bahan kering residu dan
17 diabukan dalam tanur 600 o C selama 6 jam untuk menghitung bahan organiknya. Gambar alat pengujian KCBK dan KCBO dapat dilihat pada Lampiran 3. Kecernaan bahan kering (KCBK) dan bahan organik (KCBO) dapat dihitung dengan rumus : KCBK (%) = BK sampel(g) [BK residu(g) BK blanko(g)] x 100% BK sampel(g) KCBO (%) = BO sampel(g) [BO residu(g) BO blanko(g)] x100% BO sampel(g) 3.4 Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan perlakuan penambahan pupuk NPK dengan berbagai taraf konsentrasi ( 0%, 5%, 10%, 15%). Variabel yang diamati adalah konsentrasi amonia (NH 3 ), konsentrasi VFA, kecernaan bahan kering serta kecernaan bahan organik. Data dari pengujian fermentabilitas hasil samping produksi karagenan dalam cairan rumen sapi dianalisis secara statistik dengan analisis sidik ragam (ANOVA). Model linear untuk rancangan acak lengkap yang digunakan adalah sebagai berikut (Matjik dan Sumertajaya 2002): Y ij = µ + τ i + ε ij i: faktor (i= 1,2,3,4) j: ulangan (j= 1,2) keterangan: Y ij = respon percobaan karena pengaruh faktor penambahan pupuk NPK pada faktor ke i dan ulangan ke j µ = rataan umum τ i ε ij = pengaruh faktor penambahan pupuk NPK pada taraf i = galat percobaan karena faktor penambahan NPK pada taraf ke i dan ulangan ke j.