32 BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian Kegiatan penelitian ini dilaksanakan selama 6 bulan dimulai pada bulan Agustus 2011 sampai bulan Januari tahun 2012. Tempat penelitian dilaksanakan di Laboratorium Fisika Material Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga, Laboratorium Kimia Fisik-Analitik Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga, Laboratorium Farmasi Analisis Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Laboratorium Sentral FMIPA UNM serta Pusat Penelitian (Research Center) ITS. 3.2 Bahan dan Alat Bahan yang diperlukan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut : 1. Nanopartikel hidroksiapatit dalam bentuk serbuk (Nanoparticles of hydroxyapatite powder) ukuran 20nm. 2. Kitosan serbuk (Chitosan from shrimp shells) dari Sigma-Aldrich Chemical. 3. Orthophosphoric acid 85% (H 3 PO 4 ) dari Merck Chemical. 4. Acetic acid 2% (CH 3 COOH). 5. Gas nitrogen (N 2 biasa) 6. Bahan pendukung lain yaitu aquades dan methanol.
33 Alat yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari dua kelompok, yaitu peralatan untuk pembuatan sampel dan pengujian sampel. 1. Peralatan pembuatan sampel terdiri dari botol tiga leher (three naked-round bottomed flask equipped with a stirrer, condenser, thermometer and nitrogen gas inlet tube), mechanical stirrer, thermometer digital, pipette, vacuum desiccator, vaccum oven, tabung reaksi, labu ukur, gelas kimia, gelas petri, gelas beker, labu erlenmeyer, selang dan neraca digital dengan keletilian 0,1 mg. 2. Peralatan karakterisasi mikroskopik sampel menggunakan tiga jenis analisis. Analisis struktur dilakukan dengan menggunakan difraktometer sinar-x merk Shimadzu Philips X Pert Plus Diffraktometer yang ada di Laboratorium Sentral FMIPA UNM. Shimadzu Philips X Pert Plus Diffraktometer dilengkapi PANanalytical X Pert High Score Plus Software untuk total XRD powder analysis. Kandungan gugus fungsi sampel dianalisis dengan spektrometer Fourier Transform Infrared (FTIR) Burker Tensor 37 milik Laboratorium Farmasi Analisis Fakultas Farmasi Universitas Airlangga. Morfologi permukaan diamati dengan mikroskop elektron JEOL SEM (Scanning Electron Microscope) disertai analisis penentuan komposisi unsur-unsur dalam sampel hasil karakterisasi dengan EDAX TSL metek milik Laboratorium Sentral FMIPA UNM.
34 3.3 Prosedur Penelitian Penelitian tentang Sintesis dan karakterisasi sifat mikroskopik nanokomposit hidroksiapatit/kitosan (n-ha/cs) untuk aplikasi jaringan tulang ini dilakukan dalam beberapa tahap pelaksanaan. Skema pelaksanaan penelitian dapat dilihat pada Gambar 3.1. Persiapan Alat dan Bahan Proses Persiapan Variasi (w/w)% n-ha/cs Proses Sintesis Kitosan (CS) Proses Sintesis nano-komposit n-ha/cs Sampel Uji Uji XRD Uji FTIR Observasi SEM Analisis Data Gambar 3.1 Skema Pelaksanaan Penelitian
35 3.4 Tahap Persiapan Alat dan Bahan Pertama kali yang dilakukan pada penelitian ini adalah persiapan alat dan bahan yang digunakan serta penentuan komposisi bahan-bahan yang dibutuhkan. Penentuan komposisi bahan-bahan yang dibutuhkan dalam sintesis nanokomposit hidroksiapatit/kitosan (n-ha/cs) adalah dengan melihat perbandingan variasi massa (w/w)% antara nanopartikel hidroksiapatit (n-ha) dan kitosan. Dengan mengetahui variasi massa (w/w)% dapat diketahui berapa gram yang dibutuhkan dalam pembuatan sampel uji. (a) (b) Gambar 3.2 Bahan Dasar Nanokomposit Hidrosiapatit/Kitosan (nha/cs); (a) Nanoparticles of hydroxyapatite powder; (b) Chitosan from shrimp shells Rumus umum yang digunakan dalam penentuan massa adalah :... (3.1) Variasi massa (w/w)% dalam nano-komposit hidroksiapatit/kitosan (n-ha/cs) masing-masing dapat dilihat pada Tabel (3.1).
36 Tabel 3.1 Variasi Massa (w/w)% n-ha/cs Kode Sampel (wt)% n-ha Massa n-ha (gram) Massa Kitosan (gram) Massa Komposit (gram) B 1 10 4 36 40 B 2 20 8 32 40 B 3 30 12 28 40 B 4 40 16 24 40 B 5 50 20 20 40 B 6 60 24 16 40 3.5 Proses Sintesis Kitosan (CS) Tahapan lanjutan sebelum dilakukan proses sintesis nanokomposit hidroksiapatit/kitosan (n-ha/cs) adalah proses sintesis kitosan (CS). Langkah yang dilakukan adalah kitosan diperoleh dengan melarutkan 2 gram chitosan powder (Chitosan from Shrimp Shells) dalam 100 ml asam asetat 2% dan 6 gram orthophosphoric acid 85%. Campuran yang diperoleh dipanaskan dengan proses reflux menggunakan botol tiga leher (three naked-round bottomed flask equipped with a stirrer, condenser, thermometer and nitrogen gas inlet tube) pada suhu 80 o C selama 2 jam dan dibawah pengadukan konstan. Proses reflux (Gambar 3.3) merupakan gabungan antara proses pemanasan cairan dan pendinginan uap, tetapi kondensat yang terbentuk dikembalikan ke dalam labu didih.
37 2 gram Chitosan from shrimp shells + CH 3 COOH 2% + 6 gram H 3 PO 4-85% Gambar 3.3 Skematis Proses Reflux Hasil dari sintesis kemudian didinginkan dan diendapkan dalam larutan methanol berlebih. Proses pengendapan dalam methanol merupakan proses pengendapan berulang untuk menghapus semua H 3 PO 4 dan asam asetat yang tidak bereaksi (pada proses pengendapan kedua endapan gel dilarutkan dalam aquades kemudian dalam larutan methanol berlebih). Gel yang terbentuk dikumpulkan dan dikeringkan dalam vaccum oven pada suhu 80 o C selama lebih dari semalam.
38 3.6 Proses Sintesis Nano-komposit Hidroksiapatit/Kitosan (n-ha/cs) Proses sintesis nanokomposit hidroksiapatit/kitosan (n-ha/cs) dilakukan dengan metode pencampuran sederhana. Pertama, kitosan dilarutkan dalam 100 ml air panas 80 o C dan kemudian secara perlahan-lahan serbuk nanopartikel hidroksiapatit (n-ha) ditambahkan. Enam sampel uji nanokomposit hidroksiapatit/kitosan (n-ha/cs) dibuat dengan menambahkan serbuk n-ha masing-masing (wt)% yaitu 10%, 20%, 30%, 40%, 50% dan 60% pada enam sampel uji larutan kitosan. Campuran tersebut diaduk dengan bantuan mechanical stirrer dengan kecepatan 3000 rpm selama 1 jam. Setelah semua serbuk nanopartikel hidroksiapatit ditambahkan ke dalam larutan polimer (kitosan), solusi yang dihasilkan disimpan dalam vaccum desiccator untuk menghilangkan gelembung-gelembung udara. Bubur yang dihasilkan dari proses tersebut kemudian dituangkan ke dalam cawan petri dan dikeringkan dalam vaccum oven pada suhu 90 o C selama lebih dari semalam. Hasil akhir dari sintesis ini berupa komposit yang masing-masing sampel diuji karakterisktik mikroskopiknya. 3.7 Karakterisasi Mikroskopik Sampel yang telah dibuat selanjutnya dilakukan karakterisasi. Karakterisasi mikroskopik sampel nanokomposit hidroksiapatit/kitosan (n-ha/ CS) dilakukan dalam beberapa uji. Uji tersebut meliputi uji X-Ray Diffraction (XRD), Fourier Transform Infrared (FTIR) dan uji morfologi permukaan dengan menggunakan Scanning Electron Microscopy (SEM).
39 3.7.1 Pengamatan X-Ray Diffraction (XRD) Analisis XRD menggunakan 35 ma sekon dan tegangan sebesar 40 kv. Radiasi spektrum monokromatik Cukα (sumber target) dengan panjang gelombang λ = 1.5405 Å dengan step size 0,04 o 2θ, scan rate 0,02 o 2θ/s, dan scan range dari 2θ = 10 sampai 60 o. Sampel yang akan dikarakterisasi berbentuk nano-komposit hidroksiapatit/kitosan (n-ha/cs) yang diletakkan dalam holder yang berukuran 2x2 cm 2 pada difraktometer. Pendeteksian sampel XRD menghasilkan spektrum dengan puncakpuncak intensitas pada sudut 2θ tertentu. Spektrum yang dihasilkan kemudian dicocokkan dengan data referensi (data standart) yang sudah baku, selanjutnya dapat diidentifikasi puncak-puncak difraksi oleh fase-fase tertentu dan analisa dilakukan pada puncak yang paling dominan. 3.7.2 Pengamatan Fourier Transform Infrared (FTIR) Sampel yang akan diuji dengan FTIR dibuat dalam bentuk pelet inframerah (IR). Pelet dibuat dengan mencampurkan 2 mg sampel dengan 100 mg KBr yang kemudian dilakukan pemindaian IR dengan jangkauan bilangan gelombang pada kisaran 4000-450 cm -1. Pada setiap pengukuran, pelet KBr selalu dijadikan satu agar latar belakang absorpsi dapat dihilangkan. Analisis FTIR yang digunakan untuk mengindentifikasi gugus fungsi yang terbentuk pada sampel dapat dilihat dari bentuk spektra yang disajikan serta kedudukan pita-pita serapan yang dinyatakan sebagai bilangan gelombang (wavenumber) dalam satuan cm -1.
40 3.7.3 Pengamatan Scanning Electron Microscopy (SEM) Karakterisasi uji SEM untuk sampel dilakukan pada tegangan 22 kv dan perbesaran 5.000X, 10000x dan 30.000x. Rasio molaritas Ca dan P yang dimiliki pada sampel n-ha dan nano-komposit hidroksiapatit/kitosan (n-ha/cs) dilakukan bersamaan pengukuran EDAX (Energy Dispersive X-Ray Analysis). Rumus penentuan komposisi unsur-unsur dalam sampel hasil karakterisasi EDAX sebagai berikut :... (3.2)