1 PENDAHULUAN Latar Belakang Kehidupan modern dewasa ini menyebabkan tingkat stress yang tinggi, sehingga menjadi salah satu faktor pemicu berkembangnya berbagai macam penyakit yang memerlukan penanganan khusus. Berbagai penyakit tersebut dapat menyerang berbagai organ yang bersifat degeneratif, termasuk kelainan reproduksi. Salah satu penyakit kelainan reproduksi yang ditakuti oleh laki-laki adalah rendahnya produksi kadar testosteron, sehingga mengurangi kejantanan pria. Hal ini karena kekurangan hormon testosteron di dalam tubuh jantan dapat menghambat proses spermatogenesis (Hardy et al. 1991), sehingga menyebabkan infertilitas. Kegagalan reproduksi pada jantan seperti defisiensi hormonal, saat ini umumnya diatasi dengan cara pemberian suplemen hormon testosteron sintetis, tetapi terapi tersebut pada manusia dapat menyebabkan resiko jangka panjang seperti menyebabkan penyakit jantung koroner, retensi cairan, kanker prostat dan sebagainya (Gruennewald & Matsumoto 2003). Untuk itu, beberapa peneliti telah melakukan upaya terapi lainnya dengan menggunakan sel Leydig sebagai sumber sel penghasil hormon testosteron yang dapat ditransplantasikan ke dalam testis. Penggunaan sel Leydig sebagai terapi alternatif penghasil hormon testosteron membutuhkan sumber sel Leydig yang akan ditransplantasikan dalam jumlah yang memadai. Produksi galur (cell line) sel Leydig secara in vitro diharapkan sebagai upaya tersedianya sumber sel Leydig untuk digunakan dalam mengembangkan terapi alternatif pada kegagalan reproduksi akibat defisiensi hormonal. Isolasi sel Leydig pada umumnya dilakukan menggunakan gradien Percoll, tetapi diketahui bahwa Percoll dapat dimetabolisme oleh sel Leydig sehingga dapat menurunkan viabilitas sel Leydig ketika dikultur. Oleh karena itu diperlukan metoda isolasi dan purifikasi yang lebih baik. Nycodenz merupakan gradien pemisah yang bersifat non toksik dan tidak dapat diabsorpsi oleh beberapa jenis sel mammalia serta dapat dengan mudah dihilangkan dari sampel sel dibandingkan dengan gradien pemisahan lain (Miller 2006). Diketahui fungsi utama sel Leydig pada testis dewasa adalah memproduksi testosteron yang diperlukan pada proses spermatogenesis. Pengaturan spermatogenesis tergantung dari sistem hormon yang kompleks yang secara langsung memerlukan testosteron. Sekresi testosteron oleh sel Leydig diatur oleh hormon LH dari hipofisa dan merupakan bagian dari aksis hipotalamushipofisa-testis (Senger 2005, Yang et al. 2003). Sekresi testosteron tersebut tidak hanya berdasarkan aktivitas sel Leydig pada interstitial tetapi juga berdasarkan jumlah sel Leydig di dalam testis. Pada mamalia, fungsi sel Leydig melibatkan dua generasi sel yaitu pertama adalah populasi sel Leydig yang berkembang selama masa fetus. Sel Leydig pada tahap ini bertanggung jawab terhadap maskulinisasi sistem urogenital jantan (Habert et al. 2001).
2 Progenitor sel Leydig diduga merupakan stem cell mesenkimal karena mempunyai morfologi seperti sel yang terdapat pada jaringan ikat yang berasal dari mesoderm embrio (Hardy et al 1991). Pada tikus, progenitor sel Leydig mempunyai kemampuan proliferasi tinggi dan menunjukkan marker fungsi diferensiasi (Ge et al. 2005). Disisi lain hormon LH atau hcg sangat diperlukan untuk proliferasi dan diferensiasi sel Leydig (Saez 1994) sehingga sel Leydig mampu memproduksi testosteron. Proliferasi sel Leydig di dalam kultur secara in vitro memerlukan bahan bioaktif tambahan dan yang umum digunakan adalah ITS (Insulin Transferrin Sodium Selenite) yang mengandung tiga faktor pertumbuhan. Selain itu juga berfungsi mengurangi penggunaan serum di dalam medium kultur. Sel-sel yang dikultur secara in vitro mampu mensekresikan berbagai bahan bioaktif seperti faktor pertumbuhan (growth factor) yang bermanfaat bagi pertumbuhan sel dalam kultur. Kultur sel Leydig diduga mensekresikan berbagai bahan bioaktif seperti peptida, faktor pertumbuhan, hormon testosteron ke dalam medium kultur (Chemes et al. 1992, Cudicini et al. 1997, Hu et al. 1998). Medium tersebut dapat digunakan untuk mengkultur kembali sel Leydig maupun sel yang lain dan dikenal sebagai conditioned medium. Penggunaan conditioned medium ditemukan dapat mengarahkan diferensiasi stem cell mesenkimal menjadi sel tertentu (Djuwita et al. 2010), selain itu stem cell mesenkimal sumsum tulang belakang yang ditransplantasikan ke dalam testis menyebabkan sel tersebut berdiferensiasi menjadi sel Leydig (Yazawa et al. 2006). Berdasarkan beberapa hal yang telah diuraikan di atas, maka perlu dilakukan penelitian untuk mendapatkan teknik isolasi dan pemurnian sel Leydig yang mempunyai viabilitas sel setelah kultur yang tinggi sehingga diperoleh galur sel sebagai sumber sel Leydig, untuk mendapatkan sistem kultur sel Leydig yang optimum, serta untuk mendapatkan sel Leydig alternatif dari stem cell mesenkimal yang diferensiasinya diarahkan dengan menggunakan conditioned medium kultur sel Leydig (transdiferensiasi). Tujuan Penelitian 1. Menguji efektivitas gradien Nycodenz dalam meningkatkan konsentrasi, kemurnian dan viabilitas sel Leydig setelah diisolasi, dipurifikasi dan kultur in vitro. 2. Menguji pengaruh penambahan hcg dan/atau ITS ke dalam medium DMEM terhadap proliferasi dan perkembangan sel untuk mendapatkan kondisi optimum kultur in vitro sel Leydig hasil purifikasi dengan gradien Nycodenz. 3. Mengidentifikasi sekresi testosteron dan protein yang terdapat dalam conditioned medium (CM) kultur sel Leydig. 4. Memperoleh sel Leydig dari hasil kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang dengan CM kultur sel Leydig.
3 Manfaat Penelitian Sel Leydig dan CM kultur sel Leydig dapat digunakan untuk aplikasi terapi reproduksi pada manusia dan hewan terutama hewan yang terancam punah. Kerangka Pemikiran Penggunaan gradien Percoll banyak digunakan untuk melakukan purifikasi sel Leydig berdasarkan densitas sel. Percoll terdiri dari silica koloid yang dilapisi oleh polyvinylpyrrolidone (PVP) dan merupakan medium yang mempunyai partikel dengan diameter 15-30 nm. Keuntungan penggunaan gradien Percoll adalah untuk memisahkan sel karena mempunyai viskositas, osmolaritas dan toksisitas yang rendah. Namun penggunaan Percoll untuk mempurifikasi sel Leydig ditemukan bersifat toksik terhadap sel karena adanya proses pinositosis sehingga partikel Percoll dapat masuk ke dalam sel Leydig. Oleh karena itu, diperlukan gradien lainnya yang digunakan untuk mengatasi masalah toksisitas sel Leydig setelah purifikasi. Di samping itu, gradien alternatif yang digunakan untuk purifikasi sel Leydig juga harus menghasilkan kemurnian yang tinggi. Gradien non toksik Nycodenz yang merupakan gradien non partikel sudah sering digunakan untuk memperoleh berbagai jenis sel. Nycodenz atau iohexol bersifat non ionik dan non toksik serta tidak dimetabolisme oleh sel. Lebih lanjut diketahui juga bahwa Nycodenz merupakan larutan non partikel, sehingga mudah dihilangkan dari medium setelah digunakan untuk memisahkan sel. Purifikasi sel dengan gradien Nycodenz dilakukan dengan cara sentrifugasi sehingga sel dengan densitas tertentu akan berada pada konsentrasi gradien Nycodenz tertentu. Penggunaan gradien Nycodenz untuk mempurifikasi Leydig diharapkan dapat memperoleh tingkat kemurnian sel Leydig yang tinggi dan setara dengan penggunaan gradien Percoll. Kultur sel Leydig yang optimal memerlukan berbagai bahan bioaktif yang mampu mendukung proliferasi dan perkembangan sel di dalam kultur. Produksi hormon testosteron oleh sel Leydig diatur oleh hormon gonadotropin yaitu hormon LH yang diperlukan oleh sel Leydig sebagai induktor untuk memproduksi testosteron secara in vivo. Di dalam kultur in vitro, penambahan hormon hcg yang merupakan analog dari LH digunakan untuk menginduksi sel Leydig dalam memproduksi testosteron. Di samping hormon, diduga bahwa untuk proliferasi sel diperlukan penambahan faktor pertumbuhan yang dapat mendukung proliferasi sel dengan baik. Faktor pertumbuhan ITS merupakan faktor yang berperan dalam proliferasi sel. Untuk itu kajian penambahan hcg atau ITS ke dalam medium kultur sel Leydig secara in vitro dilakukan untuk dapat meningkatkan konsentrasi sel serta memperoleh testosteron dan bahan bioaktif lainnya. Sel Leydig dewasa berasal dari progenitor sel Leydig yang merupakan stem cell mesenkimal yang terdapat di dalam testis. Untuk pembuktian lebih
4 lanjut tentang kemampuan sekreta bahan bioaktif yang dihasilkan oleh kultur sel Leydig, maka dilakukan penelitian kemampuan conditioned medium sel Leydig untuk mengarahkan diferensiasi stem cell mesenkimal sumsum tulang menjadi sel Leydig. Untuk mencapai hasil di atas, maka dilakukan serangkai penelitian dalam tiga tahap, yaitu : (1) isolasi dan purifikasi sel Leydig menggunakan gradien Nycodenz, (2) optimasi medium kultur sel Leydig serta memperoleh conditioned medium serta galur sel Leydig dan (3) mengkultur stem cell mesenkimal sumsum tulang dengan conditioned medium sel Leydig untuk memperoleh sel Leydig (Gambar 1). Sebagai data tambahan juga dilakukan analisis terhadap kandungan testosteron dan kandungan protein yang terdapat di dalam conditioned medium sel Leydig.
5 Testis tikus Tahap pertama Isolasi dan purifikasi: Nycodenz I, II dan Percoll Kemurnian, konsentrasi dan viabilitas sel Leydig Sel Leydig Viabilitas setelah kultur (3 hari) Tahap kedua Kultur in vitro dengan perlakuan: 1. DMEM+ NBCS 10% 2. DMEM + NBCS 10%+hCG 2,5 IU/ml 3. DMEM + NBCS 10%+ITS 4. DMEM + NBCS 10%+hCG +ITS Koleksi conditioned medium (CM) Medium Kultur Optimum Pasase Population Doubling Time (PDT) Kemurnian, konsentrasi dan viabilitas galur sel CML1, CML2, CML3, CML4 Tahap ketiga ELISA, SDS PAGE, Spektrofotometer Profil hormon testosteron dan protein CM Isolasi tibia atau femur tikus dewasa CML 4 (hcg+its) Koleksi stem cell mesenkimal sumsum tulang Kultur in vitro: 1.DMEM+NBCS10% 2.DMEM+testosteron 10 ng/ml 3.DMEM+CML 50% 4.DMEM+CML 50%+hCG 2,5 IU/ml Deteksi Sel Leydig?? Pewarnaan 3β-HSD Morfologi Uji testosteron (ELISA) Uji protein (spektrofotometer) Gambar 1. Alur kegiatan penelitian