Lampiran 1.Diagram alir penelitian proses produksi bioetanol dari hidrolisat fraksi selulosa pod kakao Pod Kakao Pemotongan Pengeringan Penggilingan dengan hammer mill 40 mesh Ca(OH) 2 Degumming (12 jam) Akuades Pencucian Pektin NaOH 0,68% Delignifikasi I (12 jam) H 2 O 2 30% Delignifikasi II (12 jam) Akuades Filtrasi Lignin Pengeringan Bubuk Pod Kakao Enzim Selulase Hidrolisis Enzim Hidrolisat Fermentasi Etanol
Lampiran 2. Prosedur analisis pod kakao a. Kadar Air (SNI 01-2891-1992) Cawan aluminium yang telah dikeringkan dan diketahui bobotnya diisi sebanyak 2 g sampel lalu ditimbang (W1) kemudian dimasukkan ke dalam oven suhu 105 C selama 1-2 jam. Cawan aluminium dan sampel yang telah dikeringkan dimasukkan ke dalam desikator kemudian ditimbang. Pemanasan sampel diulangi sampai dicapai bobot konstan (W2). Sisa contoh dihitung sebagai total padatan dan air yang menghilang sebagai kadar air. ( W1 W 2) Kadar Air (%) = 100% W1 b. Kadar Abu (AOAC, 1995) Sebanyak 2 g contoh ditimbang dalam cawan porselin yang telah diketahui bobotnya (A), kemudian diarangkan dengan menggunakan pemanas bunsen hingga tidak mengeluarkan asap lagi. Cawan porselin berisi contoh (B) yang sudah diarangkan kemudian dimasukkan ke dalam tanur bersuhu 600 o C selama 2 jam untuk mengubah arang menjadi abu (C). Cawan porselin berisi abu didinginkan dalam desikator dan ditimbang hingga mencapai bobot tetap. C A Kadar Abu (%) = 100% B ( ) c. Kadar Protein (AOAC, 1995) Sebanyak 0,1 g contoh dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl lalu ditambahkan 2,5 ml H 2 SO 4 pekat, 1 g katalis dan beberapa butir batu didih. Larutan didestruksi hingga menghasilkan larutan jernih kemudian didinginkan. Larutan hasil destruksi dipindahkan ke alat destilasi dan ditambahkan 15 ml NaOH 50%. Labu erlenmeyer yang berisi 25 ml HCl 0,02 N dan 2-4 tetes indikator Mengsel (campuran metil merah 0,02% dalam alkohol dan metil biru 0,02% dalam alkohol (2:1)) diletakkan di bawah kondensor. Ujung tabung kondensor harus terendam dalam larutan HCl. Destilasi dilakukan sampai
volume larutan dalam labu erlenmeyer mencapai dua kali volume awal. Ujung kondensor dibilas dengan akuades (ditampung dalam labu erlenmeyer). Larutan yang berada dalam labu erlenmeyer dititrasi dengan NaOH 0,02 N hingga diperoleh perubahan warna dari hijau menjadi ungu. Setelah itu dilakukan pula penetapan blanko. ( a b) Ν 0,014 6,25 Kadar Protein Kasar (%) = 100% W Keterangan : a = ml NaOH untuk titrasi blanko b = ml NaOH untuk titrasi contoh N = normalitas NaOH W = bobot contoh (g) d. Kadar Lemak (AOAC, 1995) Sebanyak 2 g contoh bebas air diekstraksi dengan pelarut organik heksan dalam alat soxlet selama 6 jam. Contoh hasil ekstraksi diuapkan dengan cara diangin-anginkan dan dikeringkan dalam oven bersuhu 105 C. Contoh didinginkan dalam desikator dan ditimbang hingga diperoleh bobot tetap. Bobot Lemak Kadar Lemak Bobot Contoh (%) = 100% e. Kadar Serat Kasar (AOAC, 1995) Sebanyak 2 g contoh dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer 500 ml dan ditambahkan 100 ml H 2 SO 4 0,325 N. Kemudian dihidrolisis dalam otoklaf selama 15 menit pada suhu 105 o C dan didinginkan serta ditambahkan NaOH 1,25 N sebanyak 50 ml. Kemudian dilakukan hidrolisis kembali dalam otoklaf selama 15 menit. Contoh disaring dengan kertas saring yang telah dikeringkan dan diketahui bobotnya. Kertas saring tersebut dicuci berturut-turut dengan air panas, 25 ml H 2 SO 4 0,325 N lalu dengan air panas dan terakhir menggunakan
aceton/alkohol 25 ml. Kertas saring tersebut dikeringkan dalam oven bersuhu 105 o C selama 1 jam dan dilanjutkan sampai bobotnya tetap. a b Kadar Serat = c (%) 100% Keterangan : a = bobot residu serat dalam kertas saring (g) b = bobot kertas saring kering (g) c = bobot bahan awal (g) f. Kadar Selulosa dan Hemiselulosa Sebanyak sampel A g dan B g masing-masing dimasukkan kedalam gelas piala berukuran 500 ml. Sampel A gram ditambahkan dengan 50 ml larutan NDS dan sampel B g ditambahkan dengan 50 ml larutan ADS kemudian dipanaskan selama 1 jam dalam penangas air. Selanjutnya masing-masing sampel dicuci menggunakan aseton dan air panas serta disaring menggunakan pompa vakum dan filter gelas G-3 (C g dan D g). Sampel dalam filter gelas G-3 dikeringkan menggunakan oven, didinginkan dengan desikator dan ditimbang sebagai E g dan F g. E C Kadar NDF (%) = 100% A Kadar Hemiselulosa (%) = kadar NDF (%) F D Kadar ADF B - kadar ADF (%) (%) = 100% Residu ADF (F g) yang berada pada filter gelas G-3 diletakkan di atas nampan yang berisi air setinggi 1 cm kemudian ditambahkan H 2 SO 4 72% setinggi ¾ bagian filter gelas G-3 dan dibiarkan selama 3 jam sambil diadukaduk. Selanjutnya sampel tersebut dicuci menggunakan aseton dan air panas serta disaring menggunakan pompa vakum dan filter gelas G-3. Sampel dalam filter gelas G-3 dikeringkan dengan menggunakan oven, didinginkan dengan desikator dan ditimbang sebagai H g. H F Kadar Selulosa (%) = 100% B
Lampiran 3. Diagram alir proses degumming dan delignifikasi pod kakao Pod Kakao Pemotongan Pengeringan Penggilingan dengan hammer mill 40 mesh Ca(OH) 2 Degumming (12 jam) Akuades Pencucian Pektin NaOH 0.68% Delignifikasi I (12 jam) H 2 O 2 30% Delignifikasi II (12 jam) Akuades Filtrasi Lignin Pengeringan Bubuk Pod Kakao
Lampiran 4. Prosedur analisa aktivitas enzim selulase dengan analisa FP-ase 1. Pembuatan pereaksi Buffer sitrat Larutan 0,05 M Na-sitrat dicampur dengan larutan 0,05 M asam sitrat dengan perbandingan 27:23, kemudian akan diperoleh larutan buffer sitrat dengan ph 4,8 pada konsentrasi 0,05 M. Pereaksi DNS Sebanyak 10,6 g DNS dan 19,8 g NaOH dilarutkan dalam 1.416 ml air, kemudian ditambahkan 306 g garam Rochlele (Na-K tartarat) dan 7,6 ml fenol serta 8,3 metabisulfit. 2. Pengujian aktivitas FP-ase Pengujian aktivitas enzim FP-ase dapat mencerminkan aktivitas umum enzim selulase, karena substrat untuk pengujiannya digunakan serat yang masih bersifat kristal sehingga melibatkan aktivitas C1 yang berperan sebagai pengaktif selulosa kristal menjadi selulosa reaktif. Substrat yang dipergunakan untuk pengujian adalah kertas saring Whatman No.1, sedangkan pereaksinya adalah DNS. Sebagai standar dipergunakan larutan glukosa. Bagan alir pengujian disajikan pada bagan berikut ini : 1 ml filtrat enzim selulase 1 ml buffer sitrat ph 4,8 Kertas saring Whatman no.1 Di inkubasi T:50 C, t: 60 menit 3 ml pereaksi DNS Dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit Dibaca absorbansinya pada λ:550 nm
Aktivitas enzim selulase ditentukan dengan menggunakan substrat kertas saring Whatman No.1. enzim selulase diencerkan menggunakan buffer sitrat 4,8 dengan faktor pengencer (fp) kali. Sebanyak 50 g ( 6 cm 1 cm) kertas saring whatman No.1 sebagai substrat (Vs) ditambah dengan 1 ml volume filtrat enzim selulase (Ve), kemudian diinkubasi selama 60 menit pada suhu 50 C. Setelah inkubasi selesai dilakukan kemudian diukur gula pereduksinya (GP) dengan metode DNS. Satu IU enzim didefinisikan sebagai banyaknya μmol glukosa yang terbentuk oleh aktivitas enzim per menit pada kondisi pengujian. Perhitungan aktifitas FP-ase yang dihasilkan sebagai berikut: Aktifitas GP Ve + Vs FP - ase = BM t Ve ( ) fp Keterangan : GP BM t Ve Vs Fp = Konsentrasi gula pereduksi = Berat molekul glukosa ( 180 g/mol) = waktu inkubasi (menit) = volume filtrat enzim selulase (ml) = volume substrat (ml) = faktor pengenceran
Lampiran 5. Prosedur pembuatan kurva standar total gula dan gula pereduksi a. Total gula metode phenol H 2 SO 4 (Dubois et al, 1956) Sebelum melakukan pengujian sampel maka perlu diketahui kurva standar fenol yang digunakan. Pembuatan kurva standar fenol adalah sebagai berikut: 2 ml larutan glukosa standar yang mengandung 0, 10, 20, 30, 40 dan 50 ppm glukosa masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 1 ml larutan fenol 5% dan dikocok. Kemudian 5 ml asam sulfat pekat ditambahkan dengan cepat dan dibiarkan selama 10 menit. Nilai absorbansi diukur pada panjang gelombang 490 nm. Pengujian sampel sama dengan pembuatan kurva standar fenol, hanya 2 ml larutan glukosa diganti dengan 2 ml sampel. kurva standar total gula Gula pereduksi Absorbansi (ppm) 10 0.147 20 0.29 30 0.439 40 0.544 50 0.707 Absorbansi Kurva Standar Fenol y = 0.0139x + 0.1563 0.9 R 2 = 0.998 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 10 20 30 40 50 60 Konsentrasi Glukosa (ppm) b. Total gula pereduksi metode DNS (Miller, 1959) Prinsip metode ini adalah suasana alkali gula pereduksi akan mereduksi asam 3,5-dinitrolisilat (DNS) membentuk senyawa yang dapat diukur absorbansinya pada panjang gelombang 550 nm. 1) Penyiapan pereaksi DNS Pereaksi DNS dibuat dengna melarutkan 10,6 g asam 3,5 dinitrolisilat dan 19,8 g NaOH ke dalam 1416 ml air. Setelah itu ditambahkan 306 g Na-K
tartarat, 7,6 g fenol dan 8,3 g Na-metabisulfit. Larutan ini diaduk rata, kemudian 3 ml larutan ini dititrasi dengna HCl 0,1 N dengan indikator fenolftalein. Banyaknya titran berkisar 5-6 ml. jika kurang dari itu harus ditambahkan 2 g NaOH untuk setiap ml kekurangan HCl 0,1 N. 2) Penentuan kurva standar Kurva standar dibuat dengan mengukur gula pereduksi pada glukosa selang 0,2-0,5 mg/l. kemudian nilai gula pereduksi dicari dengan metode DNS. Hasil yang diperoleh diplotkan dalam grafik secara linier. 3) Penetapan total gula pereduksi Pengujian gula pereduksi menggunakan kurva standar DNS adalah sebagai berikut: 1 ml sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 3 ml pereaksi DNS. Kemudian larutan tersebut dipanaskan dalam penangas air selama 5 menit dan dibiarkan sampai dingin pada suhu ruang, kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 550 nm. kurva standar gula pereduksi Gula pereduksi Absorbansi (ppm) 50 0.042 100 0.199 150 0.421 200 0.603 250 0.824 Absorbansi Kurva Standar Gula Pereduksi y = 0.0041x - 0.2082 R 2 0.9 = 0.9985 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 50 100 150 200 250 300 Konsentarsi Glukosa (ppm)
Lampiran 6. Prosedur analisa jenis gula menggunakan kromatografi kertas Stándar : Glukosa, xilosa, manosa, sukrosa dan D-galaktosa Eluen : Butanol - Asam asetat Air (4:1:5) Pewarna : Urea 5% dalam 0,4 NH 4 Cl dalam 80% etanol Cara pewarnaan : Disemprotkan Waktu elusi : 2-6 jam Prosedur: 1. Tabung kromatografi diisi dengan 50-100 ml eluen, ditutup rapat dan dikocok, kemudian dibiarkan agar ruangan di dalamnya jenuh dengan uap pelarut. 2. Garis start dibuat dengan pensil (jarak 3 cm dari tepi bawah kertas) dan garis front (1-3 cm dari tepi atas kertas). 3. Pada garis start dibuat titik-titik dengan pensil dengan jarak 2,5-3 cm. 4. Pada garis front dibuat titik-titik dengan pensil tepat diatas titik-titik pada garis start kemudian diberi kode/ nama pada setiap titik. 5. Dengan pipa kapiler, larutan analat dan standar diteteskan pada titik-titik di garis start kemudian dikeringkan dengan lampu (lebar spot 3mm). 6. Penetesan diulangi 2-3 kali dan dikeringkan sebelum penetesan ulangan dan sesudahnya. 7. Kertas dibentuk menjadi silinder dengan bagian start sebagai alas dan bagian front sebagai puncak silinder dengan cara menghubungkannya dengan jepit-jepit plastik. 8. Silinder kertas dimasukkan ke dalam tabung kromatografi yang telah berisi eluen dengan garis start di bawah. Garis start diperhatikan agar tidak tertutup dalam eluen. 9. Tabung kromatografi ditutup rapat dan dibiarkan eluen naik sampai garis front (1-6 jam). 10. Kertas kromatografi diangkat dan kering udarakan.
Lampiran 7. Analisis hasil fermentasi a. Kadar etanol Pengukuran kadar etanol sampel dilakukan dengan menggunakan Refraktometer merk ATACO. b. ph Pengukuran ph dilakukan dengan menggunakan ph meter. Sebelum digunakan, ph meter dikalibrasi terlebih dahulu ke dalam ph 4 dan ph 9.2. Setelah dicuci dengan akuades, elektroda dimasukkan ke dalam contoh yang akan diukur ph-nya. Nilai ph adalah nilai yang ditampilkan setelah menunjukkan angka konstan. Pengukuran ph dilakukan di awal dan di akhir fermentasi. c. Total Gula metode phenol H 2 SO 4 (Dubois et al., 1956) Total gula akhir diukur dengan menggunakan Metode Fenol. Sebelum melakukan pengujian sampel maka perlu diketahui kurva standar fenol yang digunakan. Pembuatan kurva standar fenol adalah sebagai berikut: 2 ml larutan glukosa standar yang mengandung 0, 10, 20, 30, 40, 50 dan 60 ppm glukosa masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 1 ml larutan fenol 5% dan dikocok. Kemudian 5 ml asam sulfat pekat ditambahkan dengan cepat. Biarkan selama 10 menit. Absorbansinya diukur pada panjang gelombang 490 nm. Pengujian sampel sama dengan pembuatan kurva standar fenol hanya 2 ml larutan glukosa diganti dengan 2 ml sampel.
Lampiran 8. Data nilai total gula (mg/ml) selama hidrolisis Waktu Konsentrasi Enzim (IU/g substrat) (Jam) 10 20 30 40 4 0,7685 0,6585 0,6176 0,6207 8 0,7308 0,6663 0,8472 1,0311 12 0,8194 0,5671 0,7415 1,1597 24 0,8912 0,7497 1,0751 1,4430 36 0,8078 0,7355 1,0673 1,1883 48 0,8390 0,8075 1,3409 1,6408 60 0,7513 0,9462 1,0201 1,4446 Tabel Sidik Ragam Sumber Keragaman Jk df KT Fhit Pvalue c.v Waktu 0,013578 6 0,002263 402,51 0,0001 2,555727 Konsentrasi 0,01951 3 0,006503 1156,69 0,0001 Waktu*konsentrasi 0,009123 18 0,000507 90,15 0,0001 Galat 0,000157 28 5,62E-06 Total 0,042368 55 R-Square : 0.996284 Uji Lanjut Duncan Waktu (Jam) Total Gula (%) 4 0,066635e 8 0,081887d 12 0,082195d 24 0,103978b 36 0,094976c 48 0,115708a 60 0,104057b uji f ** Konsentrasi (IU) 10 0,080115c 20 0,073300d 30 0,095853b 40 0,121837a uji f ** Interaksi **
Pengaruh interaksi antara waktu dan konsentrasi terhadap total gula yang dihasilkan Waktu Konsentrasi Enzim (IU/g substrat) (Jam) 10 20 30 40 4 0,076jk 0,065l 0,061l 0,062l 8 0,073k 0,066l 0,084hi 0,103ef 12 0,081ij 0,056m 0,074k 0,115d 24 0,089h 0,074k 0,107e 0,144b 36 0,080ij 0,073k 0,106ef 0,118d 48 0,083i 0,080ij 0,134c 0,164a 60 0,075k 0,094g 0,102f 0,144b
Lampiran 9. data nilai gula pereduksi (mg/ml) selama hidrólisis Waktu Konsentrasi Enzim (IU/g substrat) (Jam) 10 20 30 40 4 0,7685 0,3116 0,2688 0,2805 8 0,7308 0,3267 0,3369 0,4533 12 0,8194 0,2247 0,3842 0,4427 24 0,8912 0,4600 0,4618 0,6179 36 0,8078 0,4996 0,5240 0,9529 48 0,8390 0,5197 0,6246 0,9309 60 0,7513 0,7246 0,6118 1,1271 Tabel Sidik Ragam sumber keragaman Jk df KT Fhit Pvalue c.v waktu 0,01732809 6 0,00288801 990,72 0,0001 3,360166 konsentrasi 0,00597044 3 0,00199015 682,71 0,0001 waktu*konsentrasi 0,00563679 18 0,00031315 107,43 0,0001 galat 0,00008162 28 0,00000292 Total 0,02901694 55 R-Square:0.997187 Uji Lanjut Duncan Waktu (Jam) Total Gula (%) 4 0,0293138f 8 0,0355625e 12 0,0338263e 24 0,0473450d 36 0,0712563b 48 0,0629713c 60 0,0754075a uji f ** Konsentrasi (IU) 10 0,044890bc 20 0,043815c 30 0,045891b 40 0,068650a uji f ** Interaksi **
Pengaruh interaksi antara waktu dan konsentrasi terhadap gula pereduksi yang dihasilkan Waktu Konsentrasi Enzim (IU/g substrat) (Jam) 10 20 30 40 4 0,031kl 0,031kl 0,026m 0,028lm 8 0,030klm 0,032jk 0,033jk 0,045h 12 0,030klm 0,022n 0,038i 0,044h 24 0,035ij 0,046h 0,046h 0,061e 36 0,087c 0,049g 0,052fg 0,095b 48 0,044h 0,051fg 0,062e 0,093b 60 0,055f 0,072d 0,061e 0,112a
Lampiran 10. Data nilai DE Waktu Konsentrasi Enzim (IU/g substrat) (Jam) 10 20 30 40 4 40,56645 47,31498 43,53959 45,20017 8 41,82835 49,04096 39,77130 44,02507 12 36,77381 39,62367 51,91391 38,21240 24 39,73425 61,35967 42,96245 42,81968 36 45,73547 67,90765 49,09853 80,19883 48 52,90344 64,36153 46,59514 56,75291 60 73,56767 76,58780 59,98478 78,01737
Lampiran 11. Perhitungan analisis hasil fermentasi pod kakao Tabel Analisis hasil fermentasi pod kakao dengan hidrolisis enzim Parameter Unit Hasil Etanol di substrat* % (v/v) 0,20 Etanol di substrat % (b/v) 0,16 Total Gula Awal mg/ml 1,6 Total Gula Akhir mg/ml 0,6 Efisiensi substrat % (b/v) 62,5 Total volume substrat ml 200 Berat Tepung pod kakao g 10 Rendemen total gula/ pod kakao % 3,2 Rendemen etanol/ total gula % 98,7 Rendemen etanol/ pod kakao % 3,2 Hasil etanol/ ton pod kakao l 40,05 Keterangan : BJ etanol = 0,79 g/ml Etanol % (v/v) diperoleh dari hasil pengukuran alat Perhitungan : Etanol di substrat (%b/v) = Etanol di substrat (%v/v) BJ Etanol 0, 2 ml 0, 79 g = 100 ml ml = 0,16 % (b/v) So S Efisiensi substrat (ds/s) = 100% S o ( 1,6 0,6) = 1,6 = 62,5% 100% Keterangan: S = konsentari total gula akhir S 0 = konsentrasi total gula awal Etanol yang dihasilkan % (b/v) Rendemen etanol / pod kakao (%) = 100% Pod kakao % (b/v) 0,16 %(b/v) = 100% 5 %(b/v) = 3,2 %
Konversi Etanol / ton pod kakao = Rendemen Etanol (%) 1ton pod kakao = 3,2 % 1000 kg = 32 kg etanol / ton pod kakao massa etanol ( g) Volume etanol yang dihasilkan per ton pod kakao = BJ etanol ( g / ml) 32000 g = 0,79 g / ml = 40.506 ml = 40,5 l Jadi dalam 1 ton pod kakao menghasilkan etanol 40,51 liter etanol / ton pod kakao