13 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, IPB, dari bulan Oktober 2011 Mei 2012. Bahan Isolasi untuk memperoleh isolat B. thuringiensis dilakukan oleh Khudra (2011) pada 15 sampel tanah yang diperoleh dari tiga lokasi berbeda, yaitu Lampung, Kalimantan Timur, dan Bali. Hasil isolasi kemudian diseleksi, dan didapatkan 453 koloni bakteri yang menunjukkan ciri-ciri morfologi kelompok Bacillus. Dari total isolat yang diperoleh, hanya dua isolat (11,3%) yang menunjukkan ciri koloni, morfologi mirip B. thuringiensis serta memiliki kristal protein. Dua isolat tersebut ialah B. thuringiensis Lot II dan 47. Isolat yang digunakan ialah B. thuringiensis subsp. pakistani, B. thuringiensis Lot II dan B. thuringiensis 47 yang disimpan pada koleksi kultur IPBCC, Departemen Biologi, FMIPA, IPB. Pertumbuhan dan Peremajaan Isolat Isolat B. thuringiensis subsp. pakistani, B. thuringiensis Lot II dan B. thuringiensis 47 diremajakan dengan cara digores kuadran pada media Nutrient Agar (NA) dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Pengamatan Morfologi Isolat B. thuringiensis Biakan bakteri dibuat preparat dengan cara mengoleskan satu ose biakan pada objek gelas dan diwarnai dengan larutan Commasie Briliant Blue (0,25% Commasie Briliant Blue G250, 50% etanol, dan 7% asam asetat) selama tiga menit, kemudian dibilas dengan air mengalir, dan diamati di bawah mikroskop cahaya dengan minyak emersi (Fadel et al. 1988). Pengukuran Pertumbuhan Isolat dan Produksi Protein Protoksin pada Media Selektif B. thuringiensis Isolat B. thuringiensis subsp. pakistani ditumbuhkan pada media selektif (Atlas 1946) (g/l) : glukosa 3,0 g, (NH 4 ) 2 SO 4 2,0 g, ekstrak khamir 2,0 g,
14 K 2 HPO. 4 3H 2 O 0,5 g, Mg 2 SO. 4 7H 2 O 0,2 g, CaCl. 2 2H 2 O 0,08 g, MnSO. 4 4H 2 O 0,05 g, ph 7,0. Kultur cair bakteri diinokulasikan sebanyak 10% dari total volume media produksi dengan jumlah sel 10 7 sel/ml pada media pertumbuhan, kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C dengan kecepatan agitasi 120 rpm. Inkubasi dilakukan selama 36 jam, dan setiap 3 jam sampel diambil dan diukur absorbansi pada panjang gelombang (λ) 590 nm untuk mengukur pertumbuhan, serta konsentrasi protoksinnya. Pengukuran Pertumbuhan Isolat dan Produksi Enzim Kitinase B. thuringiensis pada Media Produksi Kitinase Isolat B. thuringiensis ditumbuhkan pada media produksi kitinase (g/l) : MgSO. 4 7H 2 O 0,1 g, K 2 HPO 4 1,0 g, NaCI 1,0 g, ekstrak khamir 7,0 g, koloidal kitin 3,0 g, ph 7,0. Kultur cair bakteri diinokulasikan sebanyak 10% dari total volume media produksi dengan jumlah sel 10 7 sel/ml pada media pertumbuhan, kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C dengan kecepatan agitasi 120 rpm (Nurdebyandaru et al. 2010). Inkubasi dilakukan selama 36 jam, dan setiap 3 jam sampel diambil dan diukur absorbansi pada panjang gelombang (λ) 590 nm untuk mengukur pertumbuhan bakteri, serta aktivitas enzim kitinasenya. Pengukuran Konsentrasi Protein Protoksin Isolat B. thuringiensis Protoksin diperoleh menggunakan prinsip pelarutan kristal protein insektisidal dalam kondisi alkalin. Sebanyak 1 ml sampel yang diperoleh dari kultur produksi, disentrifugasi pada kecepatan 10.000 g, 10 menit, 4 o C. Pelet dikumpulkan untuk mengukur konsentrasi protoksin. Pelet dicuci sebanyak 3 kali menggunakan 1 ml larutan pencuci (0,14 M NaCI ; 0,01% Triton X-100) untuk menghilangkan kandungan enzim protease yang dapat menganggu konsistensi protein protoksin. Kristal protein dilarutkan pada 0,3 ml 0,05 N NaOH (ph 12,5) selama 3 jam. Suspensi larutan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 g, 10 menit, 4 o C (Vu et al. 2009) Supernatan yang mengandung kristal protein terlarut digunakan untuk menghitung konsentrasi protoksin menggunakan metode Bradford (1976).
15 Pengukuran Aktivitas Enzim Kitinase Isolat B. thuringiensis Aktivitas enzim kitinase diukur dengan menggunakan metode Spindler (Nurdebyandaru et al. 2010). Kultur cair disentrifugasi dengan kecepatan 8.400 g, 10 menit, suhu 4 o C. Supernatan yang dihasilkan mengandung ekstrak kasar enzim kitinase. Ekstrak kasar enzim kitinase diambil sebanyak 0,45 ml dan dicampurkan dengan 0,9 ml substrat koloidal kitin 0,3%, serta 0,45 ml bufer fosfat ph 7,0 0,2 M, kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 30 menit. Setelah inkubasi, reaksi dihentikan pada suhu 100 o C selama 10 menit dan disentrifugasi pada kecepatan 8.400 g, 5 menit. Supernatan yang dihasilkan direaksikan menggunakan reagen Schales yang mengandung 0,5 M natrium karbonat dan 1,5 mm kalium ferisianida, absorbansi diukur pada panjang gelombang 420 nm. Sebagai kontrol, ekstrak kasar enzim direaksikan terpisah dari substrat koloidal kitin dan bufer fosfat. Setelah reaksi dihentikan pada 100 o C, ekstrak kasar enzim dicampurkan dengan larutan berisi substrat koloidal kitin dan bufer fosfat. Aktivitas kitinase dihitung berdasarkan kurva standar N-asetil-glukosamin (NAG). Satu unit aktivitas enzim kitinase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang membebaskan N-asetil glukosamin (NAG) sebesar 1 µmol per menit (Lampiran 1). Karakterisasi Ekstrak Kasar Kitinase Aktivitas ekstrak kasar kitinasi diukur pada berbagai suhu dan ph. Suhu optimum enzim kitinase diukur menggunakan larutan bufer ph 7,0 pada kisaran suhu 30 o - 65 o C. Sedangkan ph optimum enzim kitinase diukur pada suhu optimumnya pada kisaran ph 4,0-8,0. ph 4,0 4,5 menggunakan 0,2 M bufer sitrat, ph 6,0 7,5 menggunakan 0,2 M bufer fosfat, dan ph 8,0 8,5 menggunakan 0,2 M bufer glisin NaOH. Kestabilan enzim kitinase terhadap suhu diketahui dengan mengukur aktivitas enzim kitinase selama waktu inkubasi tertentu pada suhu dan ph optimumnya masing-masing. Pengukuran Konsentrasi Protein Konsentrasi protein enzim kitinase diukur menggunakan metode Bradford (1976), larutan standar berupa bovine serum albumin (BSA). Larutan stok BSA diencerkan dengan akuades untuk mencapai konsentrasi akhir 0,1 1,0 mg/ml.
16 Dari masing-masing seri pengenceran BSA, diambil sebanyak 0,1 ml larutan dan ditambahkan dengan 5 ml reagen Bradford, kemudian di kocok dengan vorteks dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 15 menit. Larutan sampel diberikan perlakuan yang sama. Absorbansi diukur pada panjang gelombang (λ) 595 nm, dan akuades sebagai larutan blanko (Lampiran 2). Pemekatan Ekstrak Kasar Enzim Kitinase Ekstrak kasar kitinase dipekatkan menggunakan amonium sulfat pada kisaran saturasi 20%-80% (Karossi & Pudjiraharti 2010). Enzim yang telah ditambahkan amonium sulfat, disimpan semalam pada suhu 4 o C. Kemudian disentrifugasi pada kecepatan 10.000 g, 15 menit, 4 o C. Endapan yang terbentuk merupakan enzim hasil pemekatan, dan dilarutkan menggunakan 0,2 M bufer fosfat ph 7,0, kemudian diukur aktivitas kitinasenya. Pendugaan Berat Molekul Ekstrak Kasar Kitinase dan Protoksin Berat molekul ekstrak kasar kitinase dan protoksin ditentukan menggunakan SDS PAGE, berdasarkan metode Laemli (Bollag & Edelstein 1999). Konsentrasi gel pemisah (separating gel) sebanyak 10% dan 4% gel penahan (stacking gel) untuk menduga berat molekul protein kitinase, sedangkan berat molekul protein protoksin digunakan konsentrasi gel pemisah sebanyak 12,5% dan 4% gel penahan. Sampel didenaturasi dengan cara dipanaskan pada suhu 100 o C selama 10 menit, dan dielektrofororesis pada 65 volt, 20 A selama 180 menit. Gel diwarnai menggunakan pewarna perak nitrat. Pewarnaan perak nitrat dilakukan dengan cara merendam gel dalam larutan fiksasi yang mengandung 25% metanol dan 12% asam asetat selama 60 menit, direndam dalam 50% etanol selama 20 menit, dan diganti dengan 30% etanol selama 2 X 20 menit. Larutan diganti dengan larutan pengembang yang terdiri dari 5% natrium karbonat, 0,05% formalin, dan 0,0004% natrium tiosulfat, lalu dicuci dengan akuabides. Larutan perak nitrat ditambahkan selama 30 menit, kemudian dicuci kembali dengan larutan campuran natrium karbonat, formaldehida, dan larutan fiksasi. Pita protein kitinase yang terbentuk ditentukan berat molekulnya berdasarkan penanda protein low molecular weight (Sigma) yang yang terdiri atas
17 fosforilase-b (97 kda), albumin (66 kda), ovalbumin (45 kda), karbonat anhidrase (30 kda), tripsin inhibitor (20,1 kda), dan alfa laktabumin (14,4 kda) (Lampiran 3). Pita protein protoksin ditentukan berat molekulnya menggunakan penanda protein marker precision plus protein dual color (Bio-Rad) yang memiliki berat molekul berkisar 250 kda 10 kda (Lampiran 4).