14 BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan melalui dua tahap selama bulan April-Oktober 2010. Tahap pertama adalah proses pencekokan serbuk buah kepel dan akuades dilakukan di Bagian Farmakologi dan Toksikologi, Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi FKH IPB. Tahap kedua adalah pengukuran dan analisis kadar amonia, trimetilamin, dan fenol pada feses yang dilaksanakan di laboratorium Kimia Analitik, Departemen Kimia (FMIPA) IPB. 3.2 Bahan dan Alat Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah serbuk buah kepel (Stelechocarpus burahol), akuades, dan hewan coba berupa mencit (Mus musculus) kelamin jantan dengan rerata berat 20 gram. Serbuk buah kepel yang digunakan diperoleh dari Pusat Studi Biofarmaka IPB. Bahan yang digunakan untuk menghitung kadar amonia dalam feses mencit adalah asam perklorat 6%, NaOH 20%, H 3 BO 4 3%, Na 2 B 4 O 7 0,02 N, dan beberapa indikator (fenolftalein, tashiro dan metil merah). Bahan yang digunakan untuk menentukan kadar trimetilamin pada feses mencit adalah larutan TCA 7%, K 2 CO 3, H 3 BO 3 2%, formalin pekat, indikator Conway, dan HCl 0,02 N. Bahan yang digunakan untuk menghitung kadar fenol pada feses adalah etanol, akuades, reagen Folin- Ciocalteau 50%, dan larutan natrium bikarbonat 5%. Alat yang digunakan untuk menentukan kadar amonia dan trimetilamin pada feses mencit adalah buret, mikroburet, corong gelas, erlenmeyer, gelas piala, labu takar, pipet volumetrik dengan volume 0,5 ml, 1 ml, dan 2 ml, kertas saring kasar, inkubator, perangkat alat destilasi uap, cawan Conway, dan timbangan analitik dengan ketelitian 0,0001 gram. Alat yang digunakan untuk menentukan kadar fenol dalam feses mencit adalah kertas saring Whatman #42, rotavapor, spektrofotometri, dan tabung reaksi. Alat lain yang digunakan pada penelitian ini adalah spoit, sonde lambung, kandang metabolik, botol film, dan timbangan.
15 3.3 Metode Penelitian 3.3.1 Persiapan Hewan Coba Sebelum diberi perlakuan, seluruh mencit diaklimatisasi terlebih dahulu selama tujuh hari. Pada hari pertama aklimatisasi, seluruh mencit diberi obat anti cacing untuk mencegah infeksi cacing selama perlakuan. Dalam tahap aklimatisasi, mencit juga dicekok dengan akuades sebanyak 1 ml/ekor setiap hari. Hal ini dilakukan agar mencit terbiasa dengan proses pencekokan. Selain itu, mencit diberi pakan berupa pelet dan air minum secara ad libitum. Pengujian ini dirancang untuk dua kelompok mencit, yaitu kelompok yang diberi serbuk buah kepel dan kelompok yang diberi akuades sebagai kontrol negatif dengan jumlah masing-masing kelompok sebanyak sembilan ekor mencit. Sembilan ekor mencit tersebut ditempatkan pada tiga kandang metabolik sehingga masing-masing kandang metabolik berisi tiga ekor mencit. 3.3.2 Pencekokan Larutan Serbuk Buah Kepel Proses pembuatan larutan serbuk buah kepel diawali dengan penimbangan serbuk buah kepel dan dilarutkan dalam akuades. Hewan dikelompokkan menjadi dua kelompok, kelompok pertama adalah kelompok hewan yang diberi akuades dan kelompok kedua adalah kelompok yang diberi serbuk daging buah kepel. Seluruh sampel diaplikasikan secara per oral selama 7 hari. Kemudian feses yang diekskresikan oleh mencit dari masing-masing kelompok perlakuan dikumpulkan dalam botol film dan disimpan dalam lemari es hingga proses perhitungan kadar amonia dan trimetilamin. Proses pengambilan feses dilakukan setiap hari sejak satu hari sebelum pencekokan hingga satu hari setelah pencekokan terakhir. Tahap pengukuran amonia, trimetilamin, dan fenol dalam feses mencit dilakukan pada hari ke-0, hari ke-4, dan hari ke-8. 3.3.3 Penentuan Kadar Amonia Dalam Feses Mencit Uji secara in vivo diarahkan untuk mengkaji khasiat deodoran oral tanaman kepel. Metode yang digunakan adalah metode pendeteksian gas amonia yang sesuai dengan SNI 2354.8:2009. Langkah awal yang dilakukan untuk perhitungan kadar amonia adalah membuat ekstraksi dari sampel feses. Feses
16 diekstrak menggunakan asam perklorat 6%, kemudian ekstrak yang didapat dimasukkan dalam tabung destilasi dan ditambahkan indikator fenolftalein. Tabung destilasi dipasang pada peralatan destilasi uap dan dimasukkan larutan NaOH 20% ke dalamnya (BSN 2009). Destilasi dilakukan selama 10 menit dan hasil destilasi ditampung dalam erlenmeyer yang telah diisi larutan H 3 BO 4 3% dan indikator tashiro yang berwarna ungu. Hasil destilasi yang bercampur dengan larutan dalam erlenmeyer akan menghasilkan larutan berwarna hijau. Tahap selanjutnya adalah destilasi larutan blanko dengan cara mengganti ekstrak sampel dengan PCA 6%. Setelah itu destilat dari sampel dan blanko dititrasi menggunakan larutan HCl 0,02 N. Titik akhir titrasi adalah dengan menemukan kembali larutan berwarna ungu. Kadar amonia dapat diketahui dengan menggunakan rumus sebagai berikut: Keterangan: Vc = volume HCl contoh Vb = volume HCl pada titrasi blanko N = normalitas larutan HCl W = bobot contoh 14,007 = massa relatif atom nitrogen 2 = faktor pengenceran 3.3.4 Penentuan Kadar Trimetilamin Dalam Feses Mencit Proses penentuan kadar trimetilamin dalam feses diketahui melalui ekstraksi sampel feses dengan larutan asam tricloro asetat (TCA) 7%. Filtrat yang terbentuk dimasukkan ke dalam salah satu sisi outer chamber cawan conway yang pada bagian tutupnya telah diolesi oleh vaselin. Setelah itu larutan K 2 CO 3 dimasukkan pada sisi lain dari outer chamber cawan conway dan ditambahkan formalin pekat ke dalamnya. Pada bagian inner chamber dimasukkan larutan H 3 BO 3 dan ditambahkan indikator conway ke dalamnya. Setelah itu, cawan conway ditutup rapat dan digoyang secara perlahan hingga larutan yang berada
17 pada kedua sisi outer chamber bercampur. Dilakukan uji blanko dengan cara mengganti larutan filtrat dengan larutan TCA 7%. Cawan conway yang berisi larutan filtrat dan blanko diinkubasi pada suhu 35 C selama dua jam atau pada suhu ruang selama satu malam. Selanjutnya hasil inkubasi dititrasi dengan menggunakan larutan HCl 0,02 N sampai terbentuk kembali larutan berwarna merah muda. Kadar trimetilamin dapat diketahui dengan menggunakan rumus perhitungan sebagai berikut: Keterangan: Vc = volume HCl contoh Vb = volume HCl pada titrasi blanko N = normalitas larutan HCl W = bobot contoh 14,007 = massa relatif atom nitrogen fp = faktor pengenceran 3.3.5 Penentuan Kadar Fenol dalam Feses Mencit Prosedur pengujian kadar fenol feses diawali dengan mencampurkan sampel feses dan etanol, kemudian dihomogenkan menggunakan mesin penggoyang (shaker) selama tiga jam. Campuran yang dihasilkan dipanaskan dalam penangas air pada suhu 70ºC selama satu jam dan disaring menggunakan kertas saring Whatman #42. Residu yang tersisa dicuci dengan menggunakan etanol panas (suhu 70ºC) kemudian kedua filtrat dicampur. Filtrat kembali disaring secara manual dengan Whatman #42 dan kemudian diuapkan dengan rotavapor pada suhu 40ºC. Ekstrak feses yang diperoleh dianalisis kandungan total fenolnya dengan metode spektrofotometri. Ekstrak etanol feses yang mengandung 5-10 mg bahan kering dilarutkan dalam 2 ml etanol 95% lalu ditambahkan 5 ml akuades dan 0,5
18 ml reagen Folin-Ciocalteau 50% (v/v). Setelah lima menit ditambahkan 1 ml larutan natrium bikarbonat (Na 2 CO 3 ) 5% (w/v). Campuran dihomogenisasi dan diinkubasi pada keadaan gelap selama satu jam, kemudian ditentukan absorbansi pada panjang gelombang 725 nm. Kurva standar fenol dibuat dengan menggunakan standar asam galat 25-200 ppm sebagai pengganti sampel dengan perlakuan yang sama. 3.4 Analisis Data Hasil pengukuran parameter dinyatakan dalan rataan dan simpangan baku. Data yang diperoleh dianalisis secara statistika dengan menggunakan metode uji T-student. Untuk memudahkan proses analisis digunakan piranti lunak SPSS 17.0.