BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Parasetamol 2.1.1 Sifat Fisikokimia Rumus struktur : Nama Kimia Rumus Molekul : 4- Hidroksiasetanilida : C 8 H 9 NO2 Berat Molekul : 151,16 Pemerian : serbuk, putih, tidak berbau, rasa sedikit pahit. Kelarutan : larut dalam air mendidih dan dalam natrium hidroksida 1 N, mudah larut dalam etanol. (Depkes RI, 1995). 2.1.2 Farmakokinetik A. Absorpsi Parasetamol diberikan secara oral, diserap dengan baik melalui saluran cerna. Penyerapan dihubungkan dengan tingkat pengosongan lambung. Konsentrasi darah puncak biasanya tercapai dalam 30-60 menit. Parasetamol sedikit terikat pada protein plasma dan sebagian dimetabolisme oleh enzim mikrosoma hati dan diubah menjadi sulfat dan glukoronida. (Katzung, 2002). B. Efek Samping Pada dosis terapi normal, asetaminofen bebas dari efek samping bermakna. Kemerahan pada kulit dan reaksi alergi minor pada jumlah leukosit, 5
tetapi ini umumnya selintas. Nekrosis tubular ginjal dan koma hipoglikemia merupakan komplikasi yang jarang dari terapi dosis besar jangka lama. Asetaminofen dosis besar menyebabkan persediaan glutation di hati berkurang dan N-asetil-benzokuinoneimin bereaksi dengan grup sulfihidril protein hati, membentuk ikatan kovalen. Dapat terjadi nekrosis hati, suatu kondisi yang sangat serius dan berpotensi mengancam kehidupan. 2.1.3 Kegunaan Asetaminofen merupakan pengganti yang baik untuk analgesik dan antipiretik aspirin pada penderita dengan keluhan saluran cerna dan pada mereka dengan perpanjangan waktu perdarahan yang tidak menguntungkan. Asetaminofen merupakan analgetik dan antipiretis. Asetaminofen tidak mengantagonis obat urikosurik probenesid dan karena itu dapat digunakan pada penderita gout yang mendapatkan obat itu. 2.2 Kofein 2.2.1 Sifat Fisikokimia Rumus struktur : Nama Kimia Rumus Molekul : 1,3,7-Trimetil xantin : C 8 H10N 4 O2 Berat Molekul : 194,19 Pemerian : serbuk putih atau bentuk jarum mengkilat putih,biasanya menggumpal, tidak berbau, rasa pahit. Kelarutan : Agak sukar larut dalam air, dalam etanol, mudah larut dalam kloroform, sukar larut dalam eter. (Depkes RI, 1995). 6
2.2.2 Farmakokinetik A. Absorpsi Kafein per oral mudah diabsorbsi. Kafein tersebar ke seluruh tubuh termasuk otak. Obat dapat melewati plasenta janin dan disekresikan ke dalam ASI. Dimetabolisme di hati dan metabolitnya dikeluarkan di dalam urin. B. Efek Samping Kafein dosis sedang menyebabkan insomnia, ansietas dan agitasi. Dosis tinggi diperlukan untuk memperlihatkan toksisitas berupa muntah dan konvulsi. Dosis letal sekitar 10 g (kira-kira 100 cangkir kopi) yang menimbulkan aritmia jantung. Kematian karena kafein sangat tidak mungkin. Letargi, iritabel dan sakit kepala terjadi pada pengguna yang secara rutin minumg lebih dari 600 mg kopi per hari ( sekitar 6 cangkir kopi per hari) dan mendadak berhenti. (Mycek, 2001). 2.2.3 Kegunaan Kofein berkhasiat menstimulasi SSP, dengan efek menghilangkan rasa letih, lapar dan mengantuk, juga daya konsentrasi dan kecepatan reaksi dipertinggi, prestasi otak dan suasana jiwa diperbaiki. Kofein juga memperkuat kontraksi jantung, vasodilatasi perifer dan diuretis. Kofein digunakan sebagai penyegar. Zat ini sering dikombinasikan dengan Parasetamol atau asetosal untuk memperkuat efek analgetisnya. 2.3 Kromatografi Dalam analisis kimia pada umumnya, komponen (zat) yang dianalisa harus dipisahkan terlebih dahulu dari komponen lain atau zat pengganggu yang ada, lalu dipekatkan, kemudian baru diidentifikasi atau diukur kuantitasnya. Banyak teknik pemisahan zat yang digunakan, tetapi kromatografi adalah teknik yang paling banyak dipakai, terutama untuk campuran yang kompleks. Suatu komponen 7
campuran yang tidak mungkin dipisahkan dengan cara yang lain, menggunakan kromatografi dapat diselesaikan dalam waktu yang singkat dengan peralatan yang relatif sederhana. Lebih dari itu, karena sifat pemisahannya yang spesifik, maka selain digunakan sebagai metode pemisahan, kromatografi juga merupakan metode penentuan zat baik kualitatif maupun kuantitatif. Kromatografi dapat didefinisikan sebagai suatu teknik pemisahan zat berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi yang berlangsung dalam suatu sistem yang terdiri dari dua macam fasa, dimana salah satu fasa bergerak atas fasa lainnya. Kromatografi apapun bentuknya mempunyai 2 macam fasa, yaitu fasa diam dan fasa gerak. Berdasarkan jenis fasa gerak yang digunakan, kromatografi dibedakan atas 2 golongan besar yaitu kromatografi gas bila fasa geraknya gas dan kromatografi cair bila fasa geraknya cairan. Pada kromatografi gas, fasa diam selalu ditempatkan di dalam kolom. Fasa diam itu dapat berupa padatan atau cairan yang diemban oleh butiran halus zat padat pendukung. Karena itu berdasarkan wujud fasa diamnya, kromatografi gas dapat dibedakan atas kromatografi gas padat dan kromatografi gas cair. Pada kromatografi cair, selain ditempatkan dikolom, fasa diam dapat pula ditebarkan berupa lapis tipis diatas permukaan suatu pelat dari kaca yang disebut kromatografi lapis tipis. Selain itu dapat pula menggunakan secarik kertas sebagai fasa diamnya yang disebut kromatografi kertas. Kromatografi lapis tipis dan kromatografi kertas dilakukan untuk membedakannya dari kromatografi yang dilakukan di dalam sebuah kolom, yang dinamakan kromatografi kolom. Didalam kromatografi cair pun dikenal pula kromatografi cair-padat dan kromatografi caircair, tergantung pada fasa diam yang digunakan. Selain berdasarkan wujud fasa 8
gerak dan fasa diam yang digunakan, kromatografi dapat dibedakan berdasarkan mekanisme interaksi yang terjadi antara fasa diam dan komponen campuran yang dipisahkan. Maka dikenal kromatografi adsorbsi, kromatografi partisi, kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi atau permiasi gel. Mekanisme interaksi yang paling banyak dijumpai dilaboratorium adalah adsorbsi dan partisi. Pada proses adsorbsi, molekul pelarut dan molekul zat terlarut menempati permukaan zat padat pengadsorbsi (adsorbent). Dalam kromatografi partisi, fungsi zat padat pengadsorbsi sebagai fasa diam digantikan oleh zat cair. Distribusi komponen dalam fasa diam itu karena daya larutnya. Pada kromatografi cair, misalnya Kromatografi cair Kinerja Tinggi(KCKT), molekul senyawa yang digunakan sebagai fasa diam diikatkan secara kimia pada permukaan pertikel pendukung, menghasilkan kromatografi fasa terikat. Berdasarkan perbandingan polaritas antara fasa diam dan fasa geraknya dikenal kromatografi fasa normal bila fasa diam lebih polar dari fasa geraknya, kromatografi fasa terbalik bila fasa gerak lebih polar daripada fasa diamnya. Karena fasa diam yang digunakan tidak sebanyak pada kromatografi gas, maka selektifitas pemisahan lebih mudah diperbaiki dengan merubah komposisi fasa gerak. (Sudaryo, 2001). 2.4 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Kromatogarfi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi karena didukung oleh kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif dan beragam sehingga mampu menganalisa berbagai cuplikan secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran (Depkes RI, 1995). 9
2.4.1 Komponen Kromatografi cair kinerja tinggi detektor pompa injektor kolom oven Wadah data Gambar 2.1. Bagan alat KCKT 2.4.2 Wadah Fase gerak Wadah fase gerak terbuat dari bahan yang inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum digunakan adalah gelas dan baja anti karat. Daya tampung tandon harus lebih besar dari 500 ml, yang dapat digunakan selama 4 jam untuk kecepatan alir yang umumnya 1-2 ml/menit. 2.4.3 Pompa Untuk menggerakkan fase gerak melalui kolom diperlukan pompa. Pompa harus mampu menghasilkan tekanan 6000 Psi pada kecepatan alir 0,1 10 ml/menit. Pompa ada 2 jenis yaitu pompa volume konstan dan pompa tekanan konstan. Pompa terbuat dari bahan yang inert terhadap semua pelarut. Bahan yang umum digunakan adalah gelas baja antikarat dan teflon. Aliran pelarut dari pompa harus tanpa denyut untuk menghindari hasil yang menyimpang pada detektor. 2.4.4 Injektor Cuplikan harus dimasukkan ke dalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan agar sesedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Ada tiga jenis dasar injektor, yaitu: a. Hentikan aliran/stop flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Tehnik ini 10
bisa digunakan karena difusi di dalam aliran kecil dan resolusi tidak dipengaruhi. b. Septum: Injektor-injektor langsung ke aliran fase gerak umumnya sama dengan yang digunakan pada kromatografi gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Disamping itu, partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan. c. Katup putaran (loop valve): ditunjukkan secara skematik dalam Gambar 6, tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari pada 10 µl dan sekarang digunakan dengan cara automatis (dengan adaptor khusus, volume-volume lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel loop (cuplikan dalam putaran) diisi pada tekanan atmosfir. Bila katup difungsikan, maka cuplikan di dalam putaran akan bergerak ke dalam kolom. Gambar 2.2 Tipe injektor katup putaran 2.4.5 Kolom Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok: 11
Kolom analitik: diameter khas adalah 2-6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis kemasan. Untuk kemasan pelikular, panjang yang lumrah adalah 50-100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikilat, umumnya 10-30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25-100 cm. Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Kemasan kolom tergantung pada mode kromatografi cair kinerja tinggi yang digunakan. 2.4.6 Detektor Detektor pada KCKT dikelompokkkan menjadi 2 golongan yaitu: \ Detektor universal: Mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif, seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa. Detektor spesifik: Hanya mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi dan elektrokimia (Rohman,2007). 2.4.7 Fase Gerak Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel (Johnson dan Stevenson, 1991; Munson, 1991 dan Rohman, 2007). 12
Terdapat keragaman yang luas dari solvent yang digunakan dalam semua mode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, tetapi ada beberapa sifat yang diinginkan yang mana umumnya harus dipenuhi oleh semua solven. Fase gerak harus: Murni; tidak ada pencemar/kontaminan Tidak bereaksi dengan pengemas Sesuai dengan detektor Melarutkan cuplikan Mempunyai viskositas rendah Mudah rekoveri cuplikan, bila diinginkan Tersedia diperdagangan dengan harga yang pantas (Putra, 2003) Elusi gradien dan isokratik Elusi pada kromatografi cair kinerja tinggi dapat dibagi menjadi dua sistem yaitu: 1. Sistem elusi isokratik. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam atau lebih fase gerak dengan perbandingan tetap (komposisi fase gerak tetap selama elusi) pompa injektor oven detektor kolom data Solven tunggal Gambar 2.3 Sistem elusi isokratik 13
2. Sistem elusi gradien. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran fase gerak yang perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi). 2.4.8 Pengolahan Data Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncakpuncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram. Rt Area W 1/2 H 1/2 H W Gambar 2.4 Kromatogram Guna kromatogram: 1. Kualitatif waktu retensi selalu konstan dalam setiap kondisi kromatografi yang sama. dapat digunakan untuk identifikasi. 2. Kuantitatif luas puncak proporsional dengan jumlah sampel yang diinjesikan dan dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi. 3. Kromatogram dapat digunakan untuk mengevaluasi efisiensi pemisahan dan kinerja kolom 2.5 Parameter Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Ada beberapa parameter yang perlu diperhatikan dalam memperoleh kondisi yang diinginkan dalam kromatografi antara lain : 14
a. Waktu Retensi Waktu yang dibutuhkan suatu komponen untuk melewati suatu kolom disebut waktu retensi yang dapat didefinisikan sebagai waktu yang diperlukan untuk membawa keluar suatu komponen dari dalam kolom, dihitung mulai diinjeksikan hingga keluar kolom tepat pada saat konsentrasi maksimum. 2. Faktor Selektifitas Suatu kolom dinyatakan baik apabila kolom tersebut cukup selektif, dan dikatakan selektif apabila kolom tadi mampu menahan berbagai komponen dengan kekuatan yang berbeda-beda. 3. Efisiensi Kolom Jumlah plat teoritik dalam suatu kolom sebanding dengan panjang kolom. Karena itu jumlah plat teoritik suatu kolom dapat ditingkatkan dengan memperpanjang kolom. Makin panjang kolom makin banyak jumlah plat teoritiknya maka makin sempurna pemisahan. 4. Resolusi Derajat pemisahan atau resolusi dari dua pita yang berdekatan didefinisikan sebagai jarak antara puncak-puncak pita (atau pusat-pusat) dibagi dengan luas pita rata-rata. Semakin tinggi harga N selalu memberikan resolusi yang membaik. Oleh karena itu resolusi dapat diperbaiki dengan menambah panjang kolom. (Putra, 2003). 5. Faktor Ikutan Keasimetrisan puncak dinyatakan dengan faktor ikutan atau faktor asimetris. Pembentukan puncak yang curam bagian depan tetapi landai bagian belakang disebut tailing, sebaliknya puncak yang landai bagian depan dan curam bagian belakang disebut fronting. 15
2.6 Validasi Validasi metode menurut United States Pharmacopeia (USP) dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Suatu metode analis harus divalidasi untuk verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi masalah dalam analisis. Parameter analisis yang ditentukan pada validasi adalah akurasi, presisi, batas deteksi, batas kuantitasi, spesifikasi, linieritas dan rentang, kekasaran (Ruggedness) dan ketahanan (Robutness). Akurasi merupakan ketelitian metode analisis atau kedekatan antara nilai terukur dengan nilai yang diterima. Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Akurasi dapat ditentukan dengan dua cara yaitu metode simulasi (spiked placebo recovery) dan metode penambahan bahan baku (standard addition method). Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya diekspresikan sebagai relatif standar deviasi (RSD) dari sejumlah sampel yang berbeda secara signifikan secara statistik. Batas deteksi (limit of detection, LOD) didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat terdeteksi yang masih memberikan respon signifikan. Batas kuantitasi (limit of quantitation, LOQ) didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan. Batas deteksi dan batas kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi (Rohman, 2007). 16