BAB II TINJAUAN PUSTAKA. Menurut Ditjen. BKAK (2014), sifat fisikokimia pirasetam adalah : Gambar 2.1 Struktur Pirasetam. : 2-Oxopirolidin 1-Asetamida

Transkripsi

1 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Pirasetam Uraian Bahan Menurut Ditjen. BKAK (2014), sifat fisikokimia pirasetam adalah : Gambar 2.1 Struktur Pirasetam Nama Kimia : 2-Oxopirolidin 1-Asetamida Rumus Molekul : C 6 H 10 N 2 O 2 Berat Molekul : 142,2 Pemerian Kelarutan : Serbuk; putih atau hampir putih : Mudah larut dalam air; larut dalam etanol Farmakologi Pirasetam merupakan obat nootropik yang digunakan untuk meningkatkan proses belajar dan mengingat. Pirasetam biasa disebut sebagai turunan siklik dari Gamma Amino Butiric Acid (GABA) yang berikatan dengan GABA reseptor. Obat ini bekerja pada aktivitas kognitif tanpa menimbulkan perangsangan ekstra atau menghambat neurotransmitter (Barkat, dkk., 2014). 5

2 Pirasetam merupakan salah satu dari kelompok rasetam yang biasa digunakan untuk mengobati penyakit demensia dan alzheimer. Pirasetam mempunyai absorbsi yang baik dengan pemberian peroral, dengan bioavailabilitas hampir 100%. Pirasetam diekskresikan dalam bentuk tidak berubah dan tereliminasi seutuhnya setelah 30 jam (Gouliaev dan Senning, 1994). 2.2 Kromatografi Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana analit-analit dalam sampel terdistribusi antara dua fasa, yaitu fasa diam dan fasa gerak. Fasa diam dapat berupa bahan padat dalam bentuk molekul kecil, atau dalam bentuk cairan yang dilapiskan pada pendukung padat atau dilapiskan pada dinding kolom. Fasa gerak dapat berupa gas atau cairan. Jika gas digunakan sebagai fasa gerak, maka prosesnya dikenal sebagai kromatografi gas. Dalam kromatografi cair dan kromatografi lapis tipis, fasa gerak yang digunakan selalu cair (Rohman, 2009). Saat ini kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling umum dan paling sering digunakan dalam bidang kimia analisis kualitatif, kuantitatif, atau preparatif dalam bidang farmasi, lingkungan, industri, dan sebagainya. Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang menggunakan fasa diam (stationary phase) dan fasa gerak (mobile phase) (Gandjar dan Rohman, 2007) Klasifikasi Kromatografi Kromatografi dapat dibedakan atas berbagai macam, tergantung pada pengelompokannya. Berdasarkan pada mekanisme pemisahannya, kromatografi dibedakan menjadi : (a) kromatografi adsorbsi; (b) kromatografi partisi; (c) kromatografi pasangan ion; (d) kromatografi penukar ion; (e) kromatografi 6

3 eksklusi ukuran dan (f) kromatografi afinitas. Berdasarkan pada alat yang digunakan, kromatografi dapat dibagi atas: (a) kromatografi kertas; (b) kromatografi lapis tipis; (c) KCKT dan (d) kromatografi gas (KG) (Rohman, 2009). 2.3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi memisahkan komponen campuran senyawa kimia terlarut dengan sistem adsorpsi pada fasa diam padat atau sistem partisi di antara fasa diam cair yang terikat pada penyangga padat, dan fasa gerak cair. KCKT dapat memisahkan makromolekul, ion, bahan alam yang tidak stabil, polimer dan berbagai gugus polifungsi dengan berat molekul tinggi. Berbeda dengan kromatografi gas, pemisahan pada KCKT adalah hasil interaksi spesifik antara molekul senyawa dengan fasa diam dan fasa gerak (Satiadarma, dkk., 2004). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif dan beragam. KCKT mampu menganalisa berbagai cuplikan secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran (Ditjen. POM., 1995). Teknik analisis obat secara KCKT merupakan yang paling cepat berkembang. Cara ini ideal untuk analisis beragam obat dalam sediaan dan cairan biologi, karena sederhana dan kepekaannya tinggi (Munson, 1984). 7

4 2.4 Cara Kerja Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Kromatografi merupakan teknik yang mana zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan zat terlarut ini melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan zat-zat terlarut ini diatur oleh distribusi dalam fasa gerak dan fasa diam. Penggunaan kromatografi cair membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fasa gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fasa gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel (Gandjar dan Rohman, 2007). Pemisahan analit dalam kolom kromatografi berdasarkan pada aliran fasa gerak yang membawa campuran analit melalui fasa diam dan perbedaan interaksi analit dengan permukaan fasa diam sehingga terjadi perbedaan waktu perpindahan setiap komponen dalam campuran (Meyer, 2010). 2.5 Kriteria Optimasi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Menurut Berridge (1985), optimasi dalam sistem KCKT disyaratkan untuk menemukan kondisi yang optimal guna menghasilkan pemisahan yang baik pada kondisi percobaan tersebut dilakukan. Adapun tujuan dipersyaratkan optimasi pada sistem KCKT antara lain: (a) menghemat biaya penelitian; (b) mendapatkan hasil pemisahan yang baik dengan waktu yang singkat; (c) menciptakan pemisahan terbaik yang mungkin dihasilkan oleh sampel; (d) memilih fasa gerak dan kolom yang menunjukkan pemisahan yang baik pada waktu yang singkat. Keberhasilan pemisahan suatu analit sangat dipengaruhi oleh pemilihan sistem kromatografi dan komposisi fasa gerak yang tepat. Meskipun dari segi 8

5 instrumen sering diabaikan. Proses pemisahan dikatakan baik bergantung pada kondisi kolom, detektor dan pompa instrumen KCKT. 2.6 Jenis Pemisahan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dari kedua fasa, yaitu fasa diam dan fasa gerak, salah satu di antaranya selalu harus lebih polar daripada yang lainnya. Misalnya, heksana yang dipakai pada kolom silika kepolarannya jauh lebih rendah daripada permukaan silika. Jika fasa yang lebih polar itu fasa diam, ini disebut kromatografi normal. Jika fasa yang kepolarannya lebih rendah ialah fasa diam, ini dikenal sebagai kromatografi fasa balik (Gritter, dkk., 1985). Kromatografi fasa balik menggunakan fasa diam dari silika yang dimodifikasi secara kimiawi. Fasa diam yang paling popular digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C 18 ) yang relatif non polar sedangkan fasa geraknya relatif lebih polar daripada fasa diam. Kondisi kepolaran kedua fasa ini merupakan kebalikan dari kromatografi fasa normal sehingga disebut kromatografi fasa balik (Meyer, 2010). 2.7 Komponen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Instrumentasi KCKT terdiri atas wadah fasa gerak, pompa, injektor, kolom, detektor, dan pengolah data. Diagram skematik alat KCKT ditunjukkan pada Gambar 2.2 9

6 Gambar 2.2 Diagram Skematik Alat KCKT (Rohman, 2009) Wadah Fasa Gerak Wadah fasa gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fasa gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fasa gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fasa gerak, sebab dengan adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat membuat pelarut untuk fasa gerak, maka akan sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut dengan kemurnian yang sangat tinggi, dan lebih terpilih lagi jika pelarut-pelarut yang akan digunakan berderajat KCKT (HPLC grade). Adanya pengotor dalam pelarut dapat menyebabkan gangguan pada sistem kromatografi. Adanya partikel yang kecil dapat berkumpul dalam kolom atau dalam tabung sempit, sehingga dapat mengakibatkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung tersebut (Gandjar dan Rohman, 2007) Pompa Ada dua jenis pompa yang digunakan: tekanan-tetap dan pendesakantetap. Pompa pendesakan tetap dapat dibagi lagi menjadi pompa torak dan pompa semprit. Pompa torak menghasilkan aliran yang berdenyut, jadi memerlukan 10

7 peredam denyut atau peredam elektronik untuk menghasilkan garis alas detektor yang stabil jika detektor peka terhadap aliran. Kelebihan utamanya ialah tandonnya tidak terbatas. Pompa semprit menghasilkan aliran yang tak berdenyut, tetapi tandonnya terbatas (Jhonson dan Stevenson, 1978) Injektor Menurut Jhonson dan Stevenson (1978), ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan, yaitu: a. aliran henti: Aliran dihentikan, penyuntikan dilakukan pada tekanan atmosfir; sistem ditutup, dan aliran dilanjutkan lagi (biasanya sistem aliran utama tetap berada dalam tekanan kerja). Cara ini dapat dipakai karena difusi di dalam zat cair kecil, jadi umumnya daya pisah tidak dipengaruhi; b. septum: Ini adalah injektor langsung pada aliran, yang sama dengan injektor yang lazim dipakai pada kromatografi gas. Injektor tersebut dapat dipakai pada tekanan sampai sekitar atmosfir akan tetapi septum tidak dapat dipakai untuk semua pelarut kromatografi cair. Selain itu, partikel kecil terlepas dari septum dan cenderung menyumbat; c. katup jalan-kitar: jenis injektor ini, biasanya dipakai untuk menyuntikkan volum lebih besar dari pada 10 µl dan sekarang dipakai dalam sistem yang diotomatkan (volume yang lebih kecil dapat disuntikkan secara manual memakai adaptor khusus). Pada kedudukan mengisi, jalan-kitar cuplikan diisi pada tekanan atmosfir. Jika katup dijalankan (dibuka), cuplikan di dalam jalan-kitar teralirkan ke dalam kolom. Tipe injektor katup jalan-kitar secara skematik ditunjukkan pada Gambar

8 Gambar 2.3 Tipe Injektor Katup jalan-kitar (De Lux Putra, 2007) Kolom Kolom merupakan jantung kromatografi. Keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada pemilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Menurut Johnson dan Stevenson (1978), kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok: a. kolom analitik: garis tengah dalam 2 6 mm. Untuk kemasan mikropartikel berpori, biasanya cm. b. kolom preparatif: umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom cm. Kolom hampir selalu terbuat dari baja nirkarat. Kolom biasanya dipakai pada suhu kamar, tetapi suhu yang lebih tinggi dapat juga dipakai, terutama dalam kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Kemasan bergantung pada ragam KCKT yang dilakukan Fasa Diam Fasa diam dapat berupa permukaan zat padat yang berfungsi sebagai medium yang menjerap, atau permukaan zat cair yang terdapat pada sejenis zat padat. Banyak sistem fasa diam baru telah dikembangkan untuk KCKT, dan pemakaian bahan tersebut sangat meningkatkan keefisienan dan kemampuan metode itu. Sebagian besar bahan itu didasarkan pada silika (Gritter, dkk., 1985). 12

9 Kebanyakan fasa diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Oktadesil silika (ODS atau C 18 ) merupakan fasa diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang maupun tinggi (Gandjar dan Rohman, 2007). Sekarang ini, gel silika ODS atau fasa-fasa sejenis seperti gel silika oktil digunakan untuk >80% analisis farmasi namun fasa-fasa lain hanya digunakan jika diperlukan selektivitas khusus, misalnya untuk senyawa-senyawa yang sangat mudah larut dalam air atau untuk pemisahan bioanalisis yang menjadi penting karena matriks sampel tersebut menghasilkan banyak puncak yang mengganggu (Watson, 2005) Detektor Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrofotometri massa, golongan detektor yang spesifik hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor utraviolet-visible, detektor fluoresensi, elektrokimia. Idealnya, suatu detektor mempunyai karakteristik sebagai berikut: (a) mempunyai respon terhadap zat terlarut yang cepat dan reprodusibel; (b) mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi analit pada kadar yang sangat kecil dan (c) stabil dalam pengoperasiannya (Gandjar dan Rohman, 2007). 13

10 2.7.7 Pengolah Data Alat pengumpul data seperti komputer, integrator, dan rekorder dihubungkan ke detektor. Alat ini akan mengukur sinyal elektronik yang dihasilkan oleh detektor dan memplotkannya sebagai suatu kromatogram yang selanjutnya dievaluasi oleh seorang analis (Gandjar dan Rohman, 2007) Fasa Gerak Fasa gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fasa diam, dan sifat komponen-komponen sampel (Gandjar dan Rohman, 2007). Pada KCKT, susunan pelarut atau fasa gerak merupakan salah satu hal penting yang mempengaruhi proses pemisahan. Berbagai macam pelarut dipakai dalam semua jenis KCKT, tetapi ada beberapa syarat fasa gerak yang digunakan dalam KCKT. Menurut Jhonson dan Stevenson (1978), kriteria fasa gerak yang ideal adalah sebagai berikut: (a) murni; (b) tidak bereaksi dengan kemasan; (c) sesuai dengan detektor; (d) dapat melarutkan cuplikan; (e) mempunyai viskositas rendah; (f) memungkinkan memperoleh kembali cuplikan dengan mudah, jika diperlukan; (g) harganya relatif Elusi Gradien dan Isokratik Menurut Gritter, dkk., (1985), elusi pada KCKT dapat dibagi menjadi dua sistem yaitu: a. Sistem elusi isokratik Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam atau lebih fasa gerak dengan perbandingan tetap (komposisi fasa gerak tetap selama elusi). 14

11 b. Sistem elusi gradien Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran fasa gerak yang perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu (komposisi fasa gerak berubah-ubah selama elusi). Elusi gradien digunakan pada situasi yang membutuhkan pemprograman temperatur dalam kromatografi gas, dan ini dibutuhkan ketika range dari waktu retensi dari pelarut dalam kolom besar sehingga tidak dapat terlarut dan elusi dalam waktu tertentu menggunakan satu jenis atau campuran pelarut (Lindsay, 1987). 2.8 Validasi Metode Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Validasi metode dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Suatu metode analisis harus divalidasi untuk verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi masalah dalam analisis. Parameter analisis yang ditentukan pada validasi adalah akurasi, presisi, batas deteksi, batas kuantitasi, spesifikasi, linieritas dan rentang, kekasaran (Ruggedness) dan ketahanan (Robustness) (Harmita, 2004). Akurasi/kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (% recovery). Presisi/keseksamaan adalah ukuran kedekatan antar serangkaian hasil analisis yang diperoleh dari beberapa 15

12 kali pengukuran pada sampel yang sama. Presisi dinyatakan dengan Simpangan Baku Relatif (Relative Standar Deviation, RSD) (Harmita, 2004). Batas deteksi (Limit of Detection, LOD) adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blanko. Batas kuantitasi (Limit of Quantitation, LOQ) merupakan kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama. LOD dan LOQ dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi (Harmita, 2004). 16