TEKNIK UJI AGLUTINASI CEPAT DAN ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) UNTUK MENDETEKSI ANTIBODI MYCOPLASMA GALLISEPTICUM Zulqoyah Layla dan M.B. Poerwadikarta Balai Penelitian Veteriner, Bogor PENDAHULUAN Penyakit pernafasan menahun (PPM) pada ayam sampai sekarang dilaporkan masih tersebar diseluruh dunia (FAO-OIE-WHO, 1992). Penyebab utama penyakit ini adalah kuman Mycoplasma gallisepticum (Mg), sedang kuman lain yang sering menyertai adalah kuman Eschericia coli (Jordan, 1979; Yoder, 1991). Penyebaran penyakit PPM dapat terjadi secara vertikal dari induk ke anaknya melalui indung telur atau secara horizontal dengan kontak langsung dari ayam yang terinfeksi ke ayam yang peka. Penyebaran penyakit dapat juga terjadi secara tidak langsung melalui debu percikan ludah dari penderita ataupun melalui pakan, air minum dan burung liar yang memasuki kandang (Yoder, 1991). Faktor lain seperti kelembaban, kebersihan kandang, ventilasi kandang dan kondisi air minum juga dapat memudahkan terjadinya penyakit ini. PPM dapat diamati keberadaannya dengan melakukan uji serologi secara teratur. Teknik aglutinasi cepat (AC) (Ronohardjo, 1974 ; Sri Purnomo dan Setyo Raharjeng, 1974 ; Sri Purnomo dkk., 1986) dan teknik Enzym Linked Immunosorbent Assay (ELISA) merupakan teknik uji serologi yang dapat digunakan untuk mendeteksi adanya infeksi kuman mycoplasma pada tubuh ayam (Soeripto dkk., 1993). Tulisan ini bertujuan untuk mengemukakan teknik AC dan ELISA sebagai alat untuk mendeteksi antibodi Mg dan membandingkan sensitifitas dan spesifisitas dari kedua teknik tersebut. PENYIAPAN MEDIA PERTUMBUHAN Media yang digunakan untuk pertumbuhan kuman Mg adalah media cair khusus untuk mycoplasma yang dibuat berdasarkan metode Frey dkk. (1968). Media khusus tersebut mengandung bahan-bahan, antara lain 156
Lokakarya Fungsional Non Penelib' mycoplasma broth base (oxoid), D-glucose (BDH Chemicals), L.cystein HCI (BDH Chemicals), Thallous acetate (BDH Chemicals) Yeast ekstrak (Difco), Phenol red (Chroma strains) dan aquabidest. Media tersebut memiliki ph 7,8 dan disterilkan pada suhu 121 C selama 15 menit. Selain itu kedalam media cair tersebut ditambahkan secara aseptik bahan penyubur yang terdiri dari larutan DNA dan serum babi yang sudah diinaktifkan, untuk menghambat pertumbuhan bakteri lain dan pads media tersebut ditambahkan Thalous acetate dan Amoxicilin. Media untuk pembuatan antigen ELISA, sebagai bahan penyuburnya digunakan foetal Calf serum sebagai pengganti serum babi. PENYIAPAN ANTIGEN MG Antigen yang digunakan untuk keperluan uji serologik Mycoplasma gallisepticum dibuat dari isolat Mg galur S6 yang diperoleh dari Institute of Medical and Veterinary Science, Adelaide, Australia. Untuk Uji aglutinasi cepat, Antigen Mg tersebut disiapkan dari sel biakan kuman yang ditumbuhkan pada media cair khusus mycoplasma. Setelah itu, sel biakan kuman tersebut diendapkan dengan cara pemusingan pada putaran 10.000 rpm selama 15 menit dan dicuci 3 kali menggunakan larutan penyangga fosfat. Selanjutnya endapan sel biakan Mg tersebut dihitung jumlah selnya berdasarkan kekeruhan standard 2 x Mc Farlan no.10 dan diukur menggunakan spektrophotometer pada panjang gelombang 546 nm dan diberi larutan zat warna gentiana violet 0.03%, yang dapat digunakan sebagai indikator dalam reaksi aglutinasi, dan larutan merthiolate 0.01 sebagai bahan pengawet. Untuk uji ELISA, antigen dibuat dari protein membran sel Mg galur S6 yang ditumbuhkan pada medium cair khusus mycoplasma dengan penambahan foetal Calf serum. Protein membran tersebut diperoleh dengan cara sonifikasi sel Mg dan dihitung menggunakan spektrophotometer pada panjang gelombang 650 nm dengan standar bovine serum albumin (BSA). BAHAN PEMERIKSAAN Serum darah ayam yang diuji aglutinasi diperoleh dari 75 ekor ayam yang diinfeksi dengan kuman Mg dan 80 ekor ayam normal yang tidak diinfeksi dengan kuman Mg. Serum kontrol positif Mg yang digunakan adalah serum ayam yang secara serologis diketahui positif Mg, balk dengan uji AC maupun dengan uji ELISA antibodi Mg. Untuk serum kontrol negatif digunakan serum normal dari ayam bebas mycoplasma spesific pathogen free (SPF). 1 5 7
lokakarya Fungsional Non Peneli6 TEKNIK UJI AGLUTINASI CEPAT Teknik uji aglutinasi cepat dilakukan dengan mencampur serum yang akan diuji dengan antigen Mg berwama. Sebanyak 25 µi serum darah ayam dan 25 µl antigen Mg berwarna pada cawan aglutinasi (WHO plate). Selanjutnya cawan tersebut digoyang dengan menggunakan alat penggoyang (rotary agglutinator-analite), sehingga serum dan antigen Mg tercampur secara merata. Pembacaan reaksi aglutinasi dibaca setelah 2 menit kemudian. Kriteria pembacaan reaksi adalah sebagai berikut 1.Negatif (-) = tidak terjadi reaksi aglutinasi (penggumpalan), 2.Positif ringan (+) = terjadi reaksi penggumpalan halus, 3.Positif (++) = reaksi penggumpalan terlihat agak kasar, 4.Positif kuat (+++) = reaksi penggumpalan terlihat kasar dan jelas. Adanya penggumpalan antara antigen dengan serum menunjukan bahwa serum tersebut mengandung antibodi terhadap Mg. Dengan kata lain, bahwa serum ayam tersebut diperoleh dad ayam yang terinfeksi atau pernah terinfeksi kuman Mycoplasma gallisepticum. TEKNIK UJI ELISA Teknik ELISA pertama kali diperkenalkan pada tahun 1972 oleh Engval dan Perlman. Teknik ini dapat digunakan untuk mendeteksi zat antibodi atau antigen. Prinsip dari uji ELISA adalah reaksi kompleks antigen-antibodi dengan melibatkan peran enzim kojugasi anti spesien imunoglobulin dan substrat sebagai indikator dalam reaksi. Teknik ini merupakan uji serologik kwantitatif dan dilakukan dengan menggunakan pelat mikrotiter. Untuk mendeteksi kadar antibodi terhadap Mg pada serum darah ayam, pengerjaan uji Elisa dilakukan sebagai berikut : Melapisi (coating) sumuran pelat mikrotiter dasar U (Titirtex, 96 sumuran) dengan antigen membran protein Mg galur S6 yang telah diencerkan 1 :400 dalam larutan penyangga karbonat/bikarbonat 0.1 M. Antigen tersebut ditambahkan pada tiap sumuran dari pelat mikrotiter sebanyak 100 ui dan di simpan pada temperatur 4 C selama satu malam. Pada kondisi seperti itu, antigen akan melekat secara pasif pada pelat ELISA. Selanjutnya, pelat yang dilapisi antigen tersebut dicuci dengan larutan pencuci, yang terbuat dari larutan penyangga phosphat (PBS) yang mengandung 0.5% Tween-20. Pada pencucian tersebut antigen yang tidak melekat akan terbuang. Kemudian sebanyak 100 µl serum ayam yang diperiksa, dengan enceran 1 :200 dalam larutan PBS yang mengandung 0.5% Tween-20, ditambahkan kedalam sumuran pelat tersebut secara ganda (duplikat) dan diinkubasikan pada temperatur kamar selama 1 jam. Setelah itu, dengan larutan pencuci pelat yang berisi serum tersebut dicuci dan pada 158
Lokakarya Fungsional Non Penelifi setiap sumuran pelat ditambahkan 100 ul larutan konjugat rabbit anti chicken IgG-HRPx, yang diencerkan 1 :2500 dalam PBS-Tween 0.5% dengan penambahan kasein 0.2%. Pelat yang diisi konjugat tersebut diinkubasikan lagi pada temperatur kamar selama 1 jam. Kemudian pada setiap sumuran ditambahkan 100 ul larutan substrat yang terbuat dari ABTS dan H202 dalam 0.1 M larutan penyangga sitrat (ph 4,2). Pembacaan reaksi Elisa dilakukan setelah pelat diinkubasikan pada temperatur kamar selama 1 jam dengan menggunakan alat Titertek Multiscan MCC (Flow Lab Australia) pada panjang gelombang 414 nm. Perlu ditambahkan, bahwa setiap pencucian pelat mikrotiter dilakukan 3 kali dan pada setiap pengujian serum selalu disertakan serum kontrol positif dan negatif. Untuk mementukan spesifisitas dan sensitifitas dari kedua reaksi serologi tersebut, maka dilakukan pengujian dengan membandingkan hasil uji negatif dan positif berdasarkan metode Bladock (1995). Pengujian tersebut dapat dilihat pada tabel 1. dibawah ini. Tabel 1. Perbandingan reaksi serologis AC dan ELISA pada serum darah ayam Uji Seroligis Uji Elisa Negatif Positif Jumlah AC Negatif a b (a+b) Positif d (c+d) Jumlah (a+c) (b+d) (a+b+c+d) Batasan yang digunakan untuk menganalisa spesifisitas dan sensitifitas kedua uji serologis tersebut adalah sebagai berikut - Spesifisitas uji serologis merupakan proporsi dari jumlah reaksi negatif dalam jumlah populasi negatif secara serologis. Untuk uji AC dan uji ELISA adalah a/(a+b). - Sensitifitas uji serologis merupakan proporsi dari jumlah reaksi positif dalam jumlah populasi positif. Untuk uji AC dan uji ELISA sensitifitasnya adalah d/(c+d). Sebagai contoh, bahwa hasil dari kedua reaksi serologis yang digunakan, AC dan ELISA, dapat dibandingkan spesifisitas dan sensitifitasnya berdasarkan batasan pengujian tersebut diatas. 159
Lokakarya Fungsional Non Penelid Tabel 2. Perbandingan reaksi AC dan ELISA antibodi pada pengujian serum darah ayam terhadap Mycoplasma gallisepticum Status Serum Jumlah AC ELISA + _ + Negatif 80 0 80 4 76 Positif 75 41 34 46 29 Jumlah 155 41 114 50 105 Spesifisitas (%) 100% (80/80) 95%(76/80) Sensitifitas (%) 55%(41/75) 61%(46/75) Berdasarkan hasil analisis menunjukkan bahwa spesifisitas reaksi serologis uji AC (100%) menunjukkan lebih tinggi dari uji ELISA (95%). Sedangkan sensitifitasnya uji ELISA (61%) menunjukkan nilai lebih tinggi dari uji AC (55%). Perbedaan tersebut dapat dikarenakan deteksi antibodi oleh kedua teknik serologis tersebut relatif berlainan, seperti halnya AC lebih cenderung mendeteksi lmunoglobulin(ig) M, sedangkan ELISA mendeteksi IgG. Secara serologis, keberadaan respons IgM biasanya dapat dideteksi pada awal infeksi sedangkan untuk respons immunoglobulin selanjutnya yang terdeteksi adalah IgG (Soeripto dkk., 1993). Hasil-hasil yang dikemukakan diatas merupakan hasil pengujian tahap awal, dan masih belum dapat ditarik kesimpulan dengan balk. Namun demikian, teknik yang dilakukan sudah memberikan harapan balk untuk dikembangkan. Selain itu, satu hal yang perlu dipertimbangkan untuk menguji tingkat akurasi teknik ELISA masih diperlukan sampel lebih banyak. KESIMPULAN Dari tulisan ini dapat disimpulkan sebagai berlikut 1. Uji serologis AC dan ELISA dapat digunakan sebagai alat untuk mendeteksi adanya infeksi Mg pada ayam. 2. Spesifisitas reaksi serologis pada uji AC lebih tinggi dibanding dengan uji ELISA. 3. Sensitifitas reaksi serologis pada uji ELISA lebih tinggi dibanding dengan uji AC. 160
Lokakarya Fungsional Non Penem DAFTAR BACAAN Bladock F.C. 1995. Evaluasi Epidemiologi terhadap Uji Imunologi. Dalam : Teknik ELISA dalam Diagnosis dan Penelitian. edisi 1, Dr. Wayan T. Artama (Penterjemaah). Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Gajah Mada, Gajah Mada University Press. 1995. hal.167-176 FAO-OIE-WHO. 1992. Animal Health Year Book 1992. FAO-OIE-WHO, Geneva, Rome, Paris. Frey,R.P.Hanson and D.P.Anderson.1968. A medium for the isolation of Avian mycoplasma.am.j. Vet,Res.29 : 2164-2171 Jordan, F.T.W., 1979. Avian Mycoplasmas, In : The Mycoplasmas volume II. Human and Animal Mycoplasmas. J.G.TULLY and R.F.WHITCOMB. Academic Press, New York, San Francisco. London.p 1-40. Ronohardjo,P.1974.lnfefeksi Mycoplasma gallisepticum pada ayam petelur dan ayam kampung yang sudah dewasa.bulletin LPPH 5 : 42-46. Sri Purnomo dan Setyo Rahajeng.1974. Mycoplasmosis pada ayam di Indonesia. Aglutinasi cepat serum-serum ayam pembibit terhadap antigen berwarna Mycoplasma gallisepticum. Bulletin LPPH 11 ; 23-28 Sri Purnomo, Supar, R. Napitupulu, N. Kurniasih dan S. Hardjoutomo. 1986. Mycoplasmosis pada unggas di Indonesia. Uji lapangan pemakaian antigen berwarna Mycoplasma gallisepticum pada ayam ras petelur. Penyakit Hewan. 31 ;40-44 Soeripto, M.B. Poerwadikarta and Z. Layla. 1993. The use of Elisa for the detection of chronic respiratory disease in chickens. Penyakit Hewan. 25 ;(46A) ;11-14 161