TINJAUAN PUSTAKA Mobilitas Unsur Fosfat Tanah asam adalah pembatas bagi pertumbuhan tanaman karena menyebabkan ion Fe, Al, Mn, dan Ca akan mengikat kuat ion fosfat (P). ph tanah berpengaruh terhadap bentuk ion P, jumlah dan tingkat dekomposisi bahan organik, serta kegiatan jasad mikro (Brady 1974, Ismunadji et al. 1991). Toksik H + lebih mendominasi tanah lapisan atas dan ion hidrogen dari fosfat inorganic asam fosfat (H 3 PO 4 ) mengalami ionisasi membentuk ion H 2 PO 4 -, HPO 4 2-, PO 4 3- akan di ikat menjadi Al-P, Fe-P dan Mn-P. Dalam keadaaan netral atau alkalin akan diikat menjadi Ca-P (Marschner 1995; Ismunadji et al. 1991). Alumunium (Al) di dalam tanah larut dan bersifat racun bagi tanaman. Kelarutan Al menjadi tinggi pada kondisi asam. Pada kondisi asam Al lebih mengikat ion fosfat dari H 2 PO - 4, (HPO 4 ) 2- dan PO 3-4. Mula-mula ikatan tersebut - bersifat koloidal dan lambat, selanjutnya menjadi kristal varisit AlPO 4 2H 2 dan 2- strengit FePO 4 (Nyakpa et al. 1988; Havlin et al. 1999). Alumunium mendominasi ikatan dengan P pada lapisan sub soil dan pada kondisi asam (ph 4.0) bentuk ikatan Al 3+ adalah Al(H 2 O 2 ) 3+ 6. Johnson dan Wood (1990) menemukan kation Al 3+ dapat mengikat PO 4 3+ pada DNA sehingga menghambat proses replikasi DNA bakteri bintil akar. Ketika ph meningkat, Al berada dalam bentuk Al(OH) 2+ dan Al(OH) 2 + akan reaktif mengikat ion H 2 PO 4 -, HPO 4 2- sebagai unsur fosfat yang dapat diserap oleh tanaman. Ketika mendekati ph netral dalam bentuk Al(OH) 3, pada kondisi basa dalam bentuk Al(OH) 4 - dan akan berikatan dengan PO 4 3- membentuk komplek (Al(OH) 4 ) 3 PO 4 (Marschner 1995; Delhaize dan Ryan 1995). Ion Al ini memiliki afinitas yang tinggi dan sangat menganggu terhadap biomolekul anionik seperti asam lemak, karbohidrat, protein dan asam nukleat (Aniol 1984; de Lima & Copeland 1994; Kochian 1995; Sivaguru et al. 1999). Al juga dapat menimbulkan cekaman oksidatif dengan terbentuknya oksigen radikal (ROS) (Panda et al., 2003).
5 Dalam tanah mineral, P terdiri atas dua bentuk yaitu P-organik (3,75% dari P total) seperti fitin, fosfolipid, asam nukleat dan koenzim, dan P-inorganik (25 90%) dari P total) seperti Ca 3 (PO 4 ) 2 dan Al(OH) 4 ) 2 H 2 PO 4 (Sutedjo 1994; Cosgrove 1967). Bahan-bahan penyumbang fosfat di tanah berasal dari pupuk kandang, sisa tanaman, pupuk buatan dan mineral/batuan tanah. Asam fitat dan fitin merupakan fraksi terbesar dari P-organik. Selain itu menurut Alexander (1977) bahwa sel-sel mikroba sangat kaya dengan asam nukleat dan jika mikroba itu mati maka asam nukleatnya siap untuk dimineralisasi. Mikroba Pelarut Fosfat Mikroba pelarut fosfat yang pertama dikomersialisasi adalah Fosfobacterin dari bakteri Bacillus megaterium var.phosphaticum (Smith et al., 1965). Beberapa jenis cendawan dilaporkan mampu melarutkan Al-P dan Fe-P seperti Aspergillus sp dan Pinicillium (Das 1963), Sclerotium dan Fusarium (Alexander, 1978). Banyak jenis bakteri pelarut P antara lain genus Pseudomonas, Bacillus, Mycobacterium, Micrococcus, Flavobacterium, Bacterium, Citrobacter, dan enterobacter (Premono 1994; Illmer et al. 1995). Bakteri Pseudomonas putida, Citrobacter intermedium dan Serratia mesenteroides mampu meningkatkan kelarutan batuan fosfat 6 19 kali lipat (Premono et al. 1991) sedangkan Pseudomonas fluorescens dan P. putida mampu meningkatkan P terlarut pada tanah asam sampai 50 % ( Premono, 1994). P. aeroginosa salah satu bakteri pelarut fosfat, yang bersifat gram negatif. Hasil penelitian terhadap Pseudomonas sp oleh Surya (2006) menunjukkan bahwa pertumbuhan optimal mikroba ini pada ph 6 pada media modifikasi HKsuk dimana dalam 24 jam diperoleh populasi maksimum 1.97 x 10 9 sel dengan laju pertumbuhan spesifik maksimum 0,5807 sel per jam yang dicapai sampai pada jam ke-4 dalam kultur dan melambat setelah jam ke-8. Mekanisme pelarutan unsur P terikat oleh bakteri pelarut fosfat terjadi karena adanya beberapa enzim fosfatase (fosfomonoesterase, fosfodiesterase
6 trifosfomonoesterase dan fosfoamidase) yang terdapat di dalam tanah. Enzimenzim tersebut bertanggung jawab dalam hidrolisis bahan organik yang -2 mengandung fosfor menjadi fosfat organik (HPO 4 dan HPO -1 4 ) yang tersedia bagi tanaman (Tabatabai 1982). Menurut Pikovskaya dalam Bora dan Bezbaruah (1999) bahwa bakteri pelarut fosfat menghasilkan zona bening disekitar koloni yang mengandung 20 gram batuan fosfat sebanding dengan 5 gram tricalcium fosfat. Zona bening mengindikasikan fosfat terlarut yang disebabkan oleh aktivitas enzim Fosfomonoesterase (FMEase). Fosfomono esterase merupakan enzim hidrolase yang berperan dalam Penambahan H 2 O pada ikatan ester fosfat (Lehninger 1995). Enzim FMEase dihasilkan secara dominan dibawah kondisi ketersediaan fosfat rendah. Enzim FMEase dapat dibagi menjadi FMEase asam dan FMEase alkali tergantung jenis subtrat dan ph optimumnya. Dalam kisaran basa FMEase intraseluler pada umumnya tinggi, sedangkan FMEase ekstraseluler tinggi pada kondisi kisaran asam (Schinner et al., 1996). Sumber fosfat yang mampu menginduksi produksi enzim FMEase ini adalah fenilfosfat dan p-nitrofenilfosfat yang mengindikasikan kemampuan hidrolisis bentuk p-organik (Ruiz et al. 2000). FMEase mengubah subtrat menjadi gugus alkohol (ROH) dan asam fosfat. Reaksi hidrololisis p-nitrofosfat oleh FMEase sebagai berikut: p-nitrofenilfosfat + H 2 O -- FMEase p-nitrofenol + H 3 PO 4. Selain oleh reaksi di atas, sumber fosfat organik adalah phytat (myo-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakisphosphat) yang banyak tersimpan dalam jaringan tanaman seperti sereal dan biji-bijian. Fitat diuraikan oleh phytase (Myo-inositolheksakisphosphate phosphohydrolase (EC 3.1.3.8)) menjadi inositol dan asam orthophosphoric pertama ditemukan oleh Suzuki et al., 1907 (Wang, X., et al., 2004). Enzim phytase disandikan oleh gen Phy K-W seperti pada Klebseilla
7 pneumoniae XY-5. Beberapa jenis Bacillus memproduksi phytase yang melarutkan fosfat dari Myo-inositol-heksakisphosphate. Ekspresi gen promotor PhyC tergantung pada ketersediaan unsur fosfat dan regulator PhoP yang penting dalam transkripsi gen PhyC. Ikatan PhoP~P pada kotak PhoP mendorong transkripsi PhyC dan menandakan meningkatnya konsentrasi PhoP~P. Letak posisi PhoP berada pada sekuen -35 dan 30 sebelum promotor PhyC. DNAse1 yang berada pada sekuen 80 dari lokasi PhyC bekerja menguraikan ikatan PhoP~P menjadi PhoP yang kemudian berinteraksi dengan promotor PhyC sehingga menjadi aktif melakukan transkripsi (Makarewicz et al. 2006). Peran Transposon dalam Mutagenesis Metode transposon merupakan salah satu metode yang sering digunakan untuk analisis genetika molekuler pada berbagai macam bakteri (Voelker dan Dybvig 1998) dan fungi (Firon et al. 2003). Transposon merupakan elemen DNA yang dapat meloncat atau menyisip dari satu tempat ke tempat lainnya di dalam DNA (Snyder & Champness 2003). Beberapa contoh penggunaan transposon dalam teknik mutagenesis adalah seperti untuk mengidentifikasi gen yang terlibat dalam virulensi bakteri Listeria monocytogenes pathogen pada manusia, analisis penanda molukuler pada Bradyrhyzobium japonicum (Wahyudi, et al. 1998), isolasi gen yang berperan dalam pembentukan magnet pada Magnetospirillum magneticum (Wahyudi et al., 2001), pengklonan fragmen DNA genom yang terlibat dalam toleransi terhadap asam dan alumunium pada B. Japonicum (Astuti et al. 2006). Transposon seperti mini Tn5 telah digunakan dalam mutagenesis dan pengklonan DNA bakteri gram negatif (Bruijn & Lupski 1984) seperti pada Eubacteria (de Lorenzo et al. 1990). Penggunaan Mini Tn5 transposon lebih disukai karena frekuensi transposisinya tinggi, spesififas DNA target yang relatif rendah (Goryshin et al. 1998), dan sedikit memiliki homologi dengan sekuen DNA
8 genom beberapa spesies bakteri (Berg & Ber 1983). Mini Tn5Km1 adalah salah satu tipe turunan dari transposon Tn5 yang membawa gen penanda resistensi kanamisin (de Lorenzo et al. 1990) sehingga penyisipannya ke dalam genom bakteri menyebabkan bakteri tersebut menjadi resisten terhadap kanamisin. Penyisipan transposon ini bersifat acak dan penyisipannya bersifat stabil pada genom bakteri (Herrero et al. 1990). Reiznikoff and Wiliam (2002) menyatakan bahwa mekanisme transposisi transposon terjadi melalui beberapa tahap dengan pemotongan dan penyambungan. Pertama ikatan Tnp 19 pb secara dimerisasi membentuk Tnp-DNA struktur komplek synaptic, kemudian melengkung (flanking) kedua ujungnya membentuk ikatan cincin dan lepas dari utas DNA sebagai donor. Selanjutnya cincin DNA yang mengandung transposon menempel pada untai DNA target. Dengan kehadiran ion Mg 2+ cincin DNA transposon mengudar dan masuk tersambung dengan DNA target sehingga membentuk untaian DNA mutagenesis. Bakteri tanah gram negatif seperti Pseudomonas dapat dimutasikan dengan transposon. Mini transposons Tn5 memiliki situs gen resisten kanamisin, kloramfenikol, streptomycin-spectinomycin, dan tetrasiklin yang digunakan sebagai penanda seleksi pengklonan spesifik NotI yang diapit oleh terminal 19 pb urutan sekuen dari Tn5 (de Lorenzo et.al. 1990).