I. PENDAHULUAN Latar Belakang

I. PENDAHULUAN Latar Belakang Tomat (Lycopersicum esculentum Mill.) adalah salah satu komoditas sayuran penting secara ekonomi yang dibudidayakan hampir di seluruh dunia termasuk Indonesia. Komoditas ini mempunyai banyak fungsi di antaranya adalah bahwa buah tomat dapat berfungsi sebagai sayuran, buah meja, minuman, bahkan sebagai bahan kosmetik dan obat-obatan (Duriat 1996). Di bidang kesehatan, tomat merupakan salah satu komoditas yang mendapat perhatian besar karena selain kandungan vitamin dan mineral, tomat juga mengandung senyawa antioksidan yang bermanfaat untuk pencegahan penyakit kronis termasuk di antaranya adalah penyakit jantung koroner dan beberapa penyakit kanker (Weisburger 1998). Buah tomat kaya akan senyawa-senyawa karotenoid termasuk likopin (lycopene). Tomat juga termasuk dalam lima besar tanaman sayuran penting di Indonesia selain kubis, bawang putih, kacang kapri dan cabai. Produksi tomat pada tahun 2006 mencapai hampir 640.385 ton dengan produktifitas 11,74 ton/ha dan luas panen 54.527 ha (Deptan 2007). Infeksi virus daun (kuning) menggulung yang menyebabkan penyakit keriting daun pada tomat [Tomato (Yellow) Leaf Curl Virus, TYLCV/ToLCV] dari salah satu anggota genus Begomovirus (Famili Geminiviridae), adalah salah satu kendala biotik yang serius pada produksi tomat di seluruh dunia. Gejalagejala tanaman yang terinfeksi virus ini diantaranya adalah penghambatan pertumbuhan, daun menguning dan menggulung (keriting) serta tanaman menjadi kerdil. Virus ini dapat menginfeksi tanaman tomat baik pada tanaman muda atau tua yang ditanam di lapang terbuka atau di rumah kaca, dan menyebabkan kehilangan produksi yang dapat mencapai 100% apabila menginfeksi tanaman sewaktu masih muda. Virus ini telah ditemukan di beberapa negara tropik, subtropik dan mediterania seperti negara-negara di Timur Tengah, Eropa Barat Daya, Afrika, Asia Tenggara dan kepulauan Karibia (Green & Kalloo 1994; Czosnek & Laterrot 1997; Jones 2003), bahkan juga ditemukan di daerah dengan iklim temperate (Moriones & NavasCastillo 2000) yang kejadian penyakitnya berkisar antara 20-100% dan dapat menyebabkan kehilangan hasil sampai 100% (Polston & Anderson 1997; Dellate 2005). Di Indonesia, serangan yang berat dari

virus ini dapat menginfeksi hampir 90-100% tanaman tomat dan mengakibatkan pengurangan hasil antara 50-100% (AVRDC Centerpoint newsletter spring 2003 issue). Sudiono et al. (2001) melaporkan bahwa serangan virus daun kuning menggulung pada tanaman tomat di daerah Bogor dan sekitarnya mencapai 50-70%. Usaha pengendalian penyakit keriting yang disebabkan infeksi TYLCV sampai saat ini masih sulit untuk dilakukan karena tidak ada pestisida yang dapat diaplikasikan secara langsung untuk mengontrol virus tersebut. Pengendalian biasanya dilakukan secara tidak langsung antara lain dengan mengurangi sumber inokulum dengan cara mencabut atau menghilangkan tanaman-tanaman yang telah menunjukkan gejala serangan virus, mengendalikan perkembangan serangga vektor, melakukan pergiliran tanaman, dan pemberantasan gulma yang dapat menjadi inang pembawa virus. Akan tetapi cara-cara pengendalian ini terkadang kurang efektif karena proses penularan virus ini dapat terjadi dengan cepat mengingat penularan virus ini dilakukan oleh serangga vektor. Penggunaan varietas tahan merupakan pilihan yang tepat untuk mengendalikan virus karena metode ini relatif lebih aman dan murah bila dibandingkan dengan metode pengendalian yang lain. Terdapat dua pendekatan utama untuk pengembangan ketahanan genetik terhadap virus yang tergantung pada sumber gen yang digunakan (Dasgupta et al. 2003). Gen ketahanan dapat berasal dari virus itu sendiri atau berasal dari sumber yang lain. Pendekatan pertama didasarkan pada konsep ketahanan yang berasal dari patogen (pathogen-derived resistance, PDR). Pendekatan PDR memanfaatan elemen genetik yang berupa gen utuh atau bagian gen dari genom virus kemudian diklon dan diintroduksikan ke tanaman, yang selanjutnya akan mempengaruhi satu atau beberapa tahap penting dalam siklus hidup virus. Pemanfaatan gen selubung protein (coat protein gene) (Vidya et al. 2000) merupakan salah satu contoh dari pendekatan PDR ini. Pendekatan yang kedua adalah ketahanan yang berasal bukan dari patogen (non pathogen-derived resistance), yang didasarkan pada pemanfaatan gen-gen ketahanan dari tanaman inang dan gen-gen lain yang bertanggungjawab untuk adaptasi dan respon tanaman inang terhadap serangan patogen, dan untuk memperoleh tanaman transgenik yang tahan terhadap virus 2

tersebut. Penggunaan pendekatan non-pdr, diantaranya dilakukan oleh Hanson et al. (2000). Meskipun tidak sepopuler pendekatan PDR, pendekatan non PDR memberikan harapan dan peluang yang besar untuk mengembangkan ketahanan yang bersifat durabel (dapat bertahan lama dan berkelanjutan) ketika dikombinasikan dengan pendekatan PDR. Galur-galur tomat hasil pemuliaan secara konvensional yang mempunyai ketahanan terhadap TYLCV (Begomovirus) telah dikembangkan oleh The Asian Vegetables Research and Development Center (AVRDC), Taiwan dan telah diuji serta terbukti efektif terhadap beberapa strain TYLCV Asia termasuk diantaranya Taiwan, India Selatan dan Thailand (AVRDC Centerpoint newsletter spring 2003 issue). Galur-galur tomat yang tahan CMV juga telah dikembangkan oleh AVRDC melalui pendekatan rekayasa genetik menggunakan gen protein selubung (coat protein gene). Sampai sekarang ini, galur transgenik tahan CMV tersebut telah dievaluasi di lapang dan menunjukkan tingkat ketahanan yang memadai untuk mengendalikan infeksi virus. Melalui proyek kerjasama ABSP II yang didanai oleh USAID, persilangan antara tomat varietas Indonesia (Intan dan CL6046) dengan varietas tomat yang tahan TYLCV (FLA 456 dan FLA 478) atau varietas tomat transgenik tahan CMV (R7-110-11) telah dilakukan di AVRDC dan menghasilkan tanaman tomat generasi F1 dari masing-masing persilangan (tanaman F1-TYLCV dan F1-CMV). Tanaman tomat generasi F1-TYLCV dan F1-CMV tersebut kemudian didonasikan ke Indonesia (BB BIOGEN) sebagai materi untuk pengembangan tomat tahan multi-virus. Pendekatan konvensional untuk pengembangan varietas tahan virus memiliki beberapa keterbatasan. Di antaranya adalah sumber gen ketahanan belum ditemukan pada koleksi plasmanutfah tomat di Indonesia. Selain itu, kultivar tahan yang dihasilkan melalui pemuliaan konvensional dengan memanfaatkan gen-gen ketahanan dari kerabat liar akan cepat terpatahkan. Kondisi tersebut disebabkan perubahan dari virus yang cepat akibat adanya rekombinasi dan adanya variasi genetik yang tinggi dari virus. Kultivar tahan yang dihasilkan mungkin hanya spesifik untuk strain atau isolat tertentu. Oleh karena itu, diperlukan pendekatan lain seperti pemanfaatan teknik rekayasa genetik untuk mengembangkan kultivar tomat tahan virus dengan durabilitas 3

ketahanan yang tinggi. Pemanfaatan teknik rekayasa genetik memberikan wahana baru bagi para pemulia tanaman untuk memperoleh gen baru yang lebih luas (Greenberg & Glick 1993). Di samping itu, munculnya teknik rekayasa genetik dapat mengatasi masalah inkompatibilitas dan linkage drag karena introgresi gen-gen penting dilakukan dengan mengintroduksikan gen secara langsung ke dalam genom tanaman. Sifat ketahanan tanaman terhadap beberapa cekaman biotik seperti misalnya gulma, virus, serangga dan mikroorganisme telah dapat diperbaiki dengan pendekatan ini. Demikian pula terhadap cekaman abiotik dan modifikasi kualitas dan kuantitas produk tanaman (Bennet 1993). Teknologi rekayasa genetik dapat digunakan sebagai mitra dan pelengkap teknik pemuliaan tanaman konvensional yang telah digunakan dengan sukses selama bertahun-tahun (Riazudin 1994). Suatu gen yang tidak terdapat pada suatu spesies tanaman tertentu dimungkinkan untuk dapat diperoleh dari organisme lain, seperti bakteri, virus, binatang dan tanaman lain dan dipindahkan ke tanaman (Herman 1996). Sebagai contoh gen penyandi protein selubung virus (virus coat protein gene), diisolasi dari virus untuk memperoleh resistensi non-konvensional terhadap virus. Gen ini digabungkan dengan suatu sekuen pengendali (promoter dan terminator) dan ditransformasikan ke dalam tanaman. Bila gen tersebut terekspresi ke dalam tanaman akan terjadi akumulasi protein pembungkus virus. Mekanisme resistensi ini berperan pada tingkat awal proses replikasi virus, dengan menghalangi proses replikasi secara tidak terkendali dari partikel virus (Aswidinnoor 1995). Mekanisme lain yang juga berperan di dalam ketahanan terhadap virus yang dikembangkan melalui pendekatan rekayasa genetik adalah mekanisme pembungkaman gen paska transkripsi (post transcriptional gene silencing) (Dasgupta et al. 2003). Berdasarkan informasi ini, perlu dilakukan pemanfaatan gen-gen Begomovirus untuk pengembangan varietas tahan. Di dalam pengembangan tanaman tomat tahan virus, adanya informasi tentang keragaman genetik virus akan dapat bermanfaat dalam hal pemilihan lokasi untuk pengujian (uji multi-lokasi). Selain itu, informasi mengenai suatu strain virus yang dominan menginfeksi tanaman tomat perlu diketahui sehingga dapat diambil langkah-langkah pengendaliannya. Isolat-isolat Begomovirus di 4

negara India dan Taiwan, telah berhasil diidentifikasi secara molekuler. Urutan DNA genom dari isolat-isolat tersebut telah dapat dibandingkan sehingga dapat diketahui tingkat kesamaannya (Zeidan et al. 1998). Kemajuan di bidang biologi molekuler telah menghadirkan beberapa teknik yang dapat digunakan untuk mendeteksi dan mengidentifikasi virus. Salah satu teknik molekuler yang banyak diaplikasikan adalah Polymerase Chain Reaction (PCR) karena teknik ini sangat sensitif dan spesifik untuk mendeteksi dan mengidentifikasi patogen-patogen tanaman. Selain itu, PCR dapat digunakan untuk mengetahui komposisi populasi patogen dan diversitas genetik virus (Rojas et al. 1993). Spesifisitas PCR didasarkan pada penggunaan primer-primer oligonukleotida yang komplementer dengan daerah yang mengapit sekuen DNA yang diamplifikasi. Deteksi virus dengan metode serologi mempunyai beberapa kelemahan diantaranya adalah rendahnya titer dari antigen sehingga virus sulit untuk dideteksi, adanya reaksi silang antibodi dengan antigen heterolog dan adanya pengaruh pengaturan produksi antibodi oleh lingkungan dan tahap perkembangan dari tanaman. Sedangkan metode deteksi dengan PCR mempunyai keuntungan antara lain metode ini hanya membutuhkan sampel DNA yang sedikit yang dapat diperoleh dari jaringan tanaman yang segar, disimpan di lemari es atau bahkan jaringan yang telah kering. Selain itu deteksinya tidak dipengaruhi oleh tahap perkembangan tanaman dan faktor lingkungan. Teknik ini juga relatif lebih mudah untuk dilakukan dan memungkinkan untuk analisis sekuen (sequencing) berdasarkan fragmen produk PCR yang terbentuk. Di Indonesia, keragaman genetik Begomovirus pada tingkat molekuler (urutan basa DNA) belum banyak dilaporkan. Usaha identifikasi melalui teknik hibridisasi asam nukleat dan polymerase chain reaction (PCR) telah dirintis oleh beberapa peneliti (Hidayat et al. 1999; Aidawati et al. 2005). Namun demikian, informasi yang lebih mendetail mengenai urutan sekuen DNA dari Begomovirus yang mungkin berkaitan dengan sekuen-sekuen fungsional atau yang dapat menunjukkan adanya keragaman genetik di antara Begomovirus belum pernah dilakukan. 5

Tujuan Penelitian 1. Memperoleh informasi tentang adanya infeksi Begomovirus pada pertanaman tomat di beberapa daerah sentra produksi melalui deteksi menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) dan menentukan identitas serta keragaman genetiknya berdasarkan teknik PCR-RFLP dan analisis sekuen nukleotida dan asam amino gen AV1. 2. Memperoleh klon gen AV1 Begomovirus pada vektor kloning dan mendapatkan konstruksi gen tersebut pada vektor ekspresi untuk digunakan dalam kegiatan transformasi genetik tanaman. 3. Mendapatkan tanaman-tanaman tembakau transgenik (sebagai tanaman model) yang membawa gen AV1 untuk mempelajari keefektifan gen tersebut dalam hubungannya dengan ketahanan terhadap Begomovirus. 4. Mendapatkan galur-galur tanaman tomat yang tahan terhadap Begomovirus (TYLCV) yang dikombinasikan dengan ketahanan terhadap CMV melalui pendekatan konvensional Strategi dan Alur Penelitian Untuk dapat mencapai tujuan-tujuan tersebut di atas maka strategi penelitian yang dilakukan meliputi beberapa pendekatan, yaitu diantaranya adalah melakukan survei dan mengumpulkan tanaman tomat sakit atau bagiannya yang menunjukkan gejala-gejala spesifik terinfeksi oleh Begomovirus dari beberapa sentra produksi di Indonesia. Asam nukleat total dari jaringan tanaman tomat sakit diisolasi dan digunakan sebagai cetakan untuk amplifikasi DNA genom Begomovirus dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan menggunakan primer universal (top primer) untuk Begomovirus (Percobaan 1). Hal ini diharapkan akan diperoleh informasi tentang adanya kejadian penyakit akibat infeksi Begomovirus pada sentra-sentra produksi di beberapa daerah dan juga didapatkan isolat-isolat Begomovirus yang dapat digunakan untuk materi percobaan selanjutnya. Isolat-isolat Begomovirus yang menginfeksi tomat yang telah dikoleksi dari beberapa daerah sentra produksi tomat dianalisis diversitas atau keragaman 6

genetiknya untuk menentukan identitas dan hubungan kekerabatan antar isolat Begomovirus tersebut. Studi diversitas genetik dilakukan dengan melihat adanya perbedaan situs enzim restriksi dari masing-masing isolat Begomovirus berdasarkan teknik PCR-RFLP (Percobaan 2). Untuk mempelajari secara lebih detail adanya diversitas genetik di antara isolat Begomovirus, dilakukan analisis sekuen nukleotida dan asam amino dari gen AV1 yang merupakan gen yang mempunyai sekuen yang konservatif (conserved sequences) (Percobaan 3). Di samping informasi tentang keragaman genetik dari isolat-isolat Begomovirus yang menginfeksi tomat, dari penelitian 3 juga diharapkan dapat diperoleh identitas genetik Begomovirus Indonesia dengan Begomovirus yang ada di database DNA (GenBank). Upaya untuk mengendalikan penyakit yang berasosiasi dengan Begomovirus dapat ditempuh dengan menggunakan varietas-varietas tomat yang tahan, maka pada penelitian disertasi ini dilakukan dua pendekatan yang berbeda untuk merakit tanaman tahan terhadap Begomovirus. Pertama, pendekatan nonkonvensional melalui teknik rekayasa genetik dengan menggunakan gen yang berasal dari Begomovirus itu sendiri, yang sering disebut dengan pathogenderived resistance (PDR). Untuk pendekatan ini dilakukan konstruksi gen AV1 Begomovirus (menyandikan protein selubung) pada vektor ekspresi dan konstruk gen AV1 diintroduksikan ke tanaman tembakau menggunakan vektor bakteri A. tumefaciens (Percobaan 4). Transformasi genetik tanaman tembakau (tanaman model) dengan gen AV1 dimaksudkan untuk mempelajari fungsi dan efektifitas gen AV1 sebelum diintroduksikan ke tanaman target. Tanaman-tanaman tembakau transgenik putatif yang dihasilkan pada penelitian 4 digunakan sebagai materi untuk analisis deteksi keberadaaan gen AV1 pada genom menggunakan teknik PCR dan Southern Blot serta untuk evaluasi keefektifan gen AV1 terhadap Begomovirus (Percobaan 5). Kedua, pendekatan konvensional dilakukan dengan memanfaatkan gen ketahanan terhadap TYCLV yang ada pada galur-galur dari AVRDC melalui persilangan dengan tomat-tomat Indonesia untuk mendapatkan tanaman tomat Indonesia yang tahan terhadap TYLCV (Begomovirus) (Percobaan 6). Untuk memudahkan pemahaman terhadap strategi penelitian yang digunakan maka dibuat diagram alur penelitian (Gambar 1). 7

Koleksi tanaman tomat terinfeksi Begomovirus Deteksi Begomovirus yang menginfeksi tomat (Percobaan 1) Amplifikasi PCR DNA Begomovirus dengan primer universal (top primer) Amplifikasi PCR DNA Begomovirus dengan primer spesifik gen AV1 Pemotongan produk PCR dengan enzim restriksi Analisis keragaman genetik Begomovirus berdasarkan teknik PCR-RFLP (Percobaan 2) Analisis sekuen produk PCR berdasarkan primer gen AV1 Analisis keragaman genetik Begomovirus berdasarkan sekuen gen AV1 (Percobaan 3) Gen AV1 dari isolat Begomovirus terpilih Konstruksi, introduksi gen AV1 pada tanaman model tembakau dan analisis molekuler serta bioasai (Percobaan 4 & 5) TOMAT TAHAN BEGOMOVIRUS Galur F1-TYLCV (+ CMV ) Persilangan untuk mendapatkan galur TYLCV dikombinasikan dg CMV (Percobaan 6) Galur F1-TYLCV Galur F1-CMV TYLCV X Galur tomat rentan Galur tomat rentan X CMV Gambar 1 Diagram alur strategi penelitian dan keterkaitan antar percobaan dari seluruh kegiatan penelitian 8