IDENTIFIKASI BEGOMOVIRUS INDONESIA PADA TOMAT DAN ANALISIS DIVERSITAS GENETIK GEN AV1 SERTA PEMANFAATANNYA UNTUK PENGEMBANGAN TANAMAN TAHAN VIRUS

Transkripsi

1 IDENTIFIKASI BEGOMOVIRUS INDONESIA PADA TOMAT DAN ANALISIS DIVERSITAS GENETIK GEN AV1 SERTA PEMANFAATANNYA UNTUK PENGEMBANGAN TANAMAN TAHAN VIRUS TRI JOKO SANTOSO ` SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

2 PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa Identifikasi Begomovirus Indonesia Pada Tomat Dan Analisis Diversitas Genetik Gen AV1 serta Pemanfaatannya Untuk Pengembangan Tanaman Tahan Virus adalah karya saya dengan arahan komisi pembimbing dan belum pernah diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini. Bogor, November 2008 Tri Joko Santoso NRP A ii

3 ABSTRACT TRI JOKO SANTOSO. Identification of Indonesian Begomoviruses in Tomato and Genetic Diversity Analysis of AV1 Gene as well Its Use for Developing Virus Resistant Plant. Under directions of SUDARSONO, HAJRIAL ASWIDINNOOR, SRI HENDRASTUTI HIDAYAT, and MUHAMMAD HERMAN. Tomato (Lycopersicon esculentum, Mill) is one of the most important vegetables in Indonesia, both economically and nutritionally. Production, however, is severely hampered by a leaf curl disease caused by Tomato (yellow) leaf curl virus (TYLCV/ToLCV), one of members of the genus Begomovirus, the family Geminiviridae. Recently, there is no effectively way to control this disease. The use of resistant tomato plants is undoubtedly the best way to control Begomovirus. Genetic engineering technologies give the opportunity to develop transgenic tomatoes resistant to Begomovirus through pathogen derived resistance (PDR) approach. Begomovirus AV1 gene is a gene expressing coat protein which responsible for particle encapsidation and have a role in specivicity determinant of virus transmission and symptom developmment. The objectives of this research were (1) to detect Begomoviruses infecting tomato in several of tomato production areas of East Java, Central Java, Special Province of Jogjakarta and West Java by using PCR technique. (2) to analyze genetic diversity of Begomovirus isolates infecting tomato based on the PCR-RFLP technique, (3) to identify and analyze the genetic diversity of Begomovirus isolates infecting tomato based on nucleic acid and amino acid of AV1 gene, (4) to construct the AV1 gene of Begomovirus into pbi121 expression vector plasmid and generate tobacco transformants through A. tumefaciens-mediated transformation with AV1 gene cassette, (5) to obtain transgenic tobacco plants carrying AV1 gene and resistant to Begomovirus, (6) to generate tomato lines carrying resistance against Begomovirus (TYLCV) combined with resistance to CMV through conventional breeding program. The results of this research showed that the symptomed plants collected from several tomato production areas of East Java, Central Java, Special Province of Jogjakarta and West Java indicated that those plants have been infected by Begomovirus following PCR detection using a pair of degenerate primers. Phylogenetic analysis based on the PCR-RFLP technique showed that the eight Begomovirus isolates were divided into three different groups. Meanwhile, identity of nucleic and amino acid of AV1 gene among Begomoviruses indicated that the isolates determined in this research were Indonesian isolates of AYVV and phylogenetic analysis of the eight Begomovirus isolates based on the nucleotide and predicted amino acid sequence analysis of AV1 gene indicated they belonged into two different clades. In the experiments of genetic transformation, results of the experiments showed that (i) Indonesian Begomovirus AV1 gene was successfully amplified and inserted in pbi121 expression vector plasmid, (ii) tobacco transformants carrying kanamycin-resistant gene (nptii gene) were regenerated and established in glasshouse, (iii) there was a positive correlation between the presence of the AV1 gene in T0 generation putative transgenic tobacco plants and the resistant phenotype to Begomovirus, (iv) transgenic plants with a single copy integration of the transgene exhibited more resistant than the multiple copy one and non transgenic plant. The resistance phenotype of AV1 gene expression was indicated with no symptom in T0 generation putative iii

4 transgenic tobacco plants and the accumulation of the virus in the transgenic plants tissue. Result of conventional breeding showed that F1-doublecross plants (crossing between F1-TYLCV and F1-CMV plants) revealed a resistant phenotype indicating integration of both two resistance genes in one plant has been occured following effication and PCR analysis. The resistant-doublecross F1 plants then were selected for the horticultural traits and subjected to performing the advanced breeding for developing Indonesian multiple virus resistance tomatoes. Keywords : Begomovirus, genetic diversity, PCR-RFLP technique, TYLCV, AV1 gene, genetic transformation, Nicotiana tabaccum, transgenic plant iv

5 RINGKASAN TRI JOKO SANTOSO. Identifikasi Begomovirus Indonesia Pada Tomat dan Analisis Diversitas Genetik Gen AV1 serta Pemanfaatannya Untuk Pengembangan Tanaman Tahan Virus. Dibimbing oleh SUDARSONO, HAJRIAL ASWIDINNOOR, SRI HENDRASTUTI HIDAYAT, dan MUHAMMAD HERMAN. Tomat (Lycopersicon esculentum, Mill) merupakan salah satu tanaman sayuran yang penting di Indonesia, baik secara ekonomi atau kandungan nutrisinya. Produksi tomat sangat dipengaruhi oleh penyakit keriting daun yang disebabkan oleh Tomato (yellow) leaf curl virus (TYLCV/ToLCV), salah satu anggota dari genus Begomovirus, famili Geminiviridae. Pada saat ini, belum ada cara yang secara efektif mengendalikan penyakit ini. Penggunaan tanaman tomat tahan merupakan cara yang terbaik untuk mengendalikan Begomovirus. Teknik rekayasa genetik memberikan peluang untuk mengembangkan tomat transgenik tahan terhadap Begomovirus melalui pendekatan ketahanan yang berasal dari patogen (PDR). Gen AV1 dari Begomovirus merupakan gen yang mengekspresikan protein selubung yaitu suatu protein yang bertanggung jawab dalam enkapsidasi partikel virus dan berperan di dalam penentuan spesifisitas penularan virus dan perkembangan gejala. Tujuan penelitian ini adalah (1) untuk mendeteksi Begomovirus yang menginfeksi tanaman tomat pada beberapa daerah area produksi tomat di Jawa Timur, Jawa Tengah, Daerah Istimewa Jogjakarta dan Jawa Barat menggunakan teknik PCR, (2) mempelajari keragaman genetik isolatisolat Begomovirus yang menginfeksi tomat dari beberapa area produksi di Indonesia berdasarkan teknik PCR-RFLP, (3) mengidentifikasi dan menganalisis diversitas Begomovirus yang berasosiasi dengan penyakit keriting daun pada tomat berdasarkan sekuen asam nukleat dan asam amino prediksi dari gen AV1, (4) untuk mendapatkan konstruksi gen AV1 pada vektor ekspresi dan transforman tembakau hasil transformasi genetik dengan gen AV1 menggunakan vektor bakteri A. tumefaciens, (5) untuk mendapatkan tanaman tembakau transgenik yang membawa gen AV1 dan tahan terhadap Begomovirus, (6) untuk mendapatkan galur-galur tanaman tomat yang tahan terhadap Begomovirus (TYLCV) yang dikombinasikan dengan ketahanan terhadap CMV. Deteksi Begomovirus dilakukan dengan mengamplifikasi genom Begomovirus dengan teknik PCR menggunakan sepasang primer degenerate yang universal (top primer) untuk Begomovirus yaitu primer PAL1v1978-F dan PAR1c715-R. Hasil percobaan menunjukkan bahwa sampel-sampel tanaman tomat sakit yang dikoleksi dari beberapa daerah di Jawa Timur, Jawa Tengah, Daerah Istimewa Jogjakarta dan Jawa Barat mengindikasikan adanya infeksi oleh Begomovirus setelah dideteksi menggunakan teknik PCR dengan primer universal. Infeksi Begomovirus ditunjukkan oleh adanya pita DNA hasil amplifikasi PCR yang berukuran 1500 bp. Frekuensi kejadian penyakit yang berasosiasi dengan Begomovirus bervariasi antara 0-100%. Frekuensi kejadian penyakit tertinggi (100%) terjadi di daerah Cibitung (Bogor) dan terendah (0%) terjadi di Pagerwangi (Lembang). Fragmen DNA berukuran 1500 bp produk amplifikasi PCR menggunakan v

6 primer universal untuk Begomovirus dipotong dengan menggunakan empat macam enzim restriksi, yaitu DraI, EcoRI, RsaI dan PstI untuk melihat keragaman genetiknya. Pola pemotongan dengan enzim restriksi dari delapan isolat Begomovirus dan fragmen RFLP prediksi isolat Begomovirus dari DNA database GenBank digunakan untuk menentukan identitas genetik dan keragaman di antara isolat-isolat Begomovirus tersebut. Produk amplifikasi PCR yang dipotong dengan empat macam enzim restriksi mengindikasikan bahwa ada polimorfisme dari fragmen-fragmen DNA di antara 8 isolat Begomovirus yang berasal dari daerah-daerah di Jawa dan Sumatera tersebut. Analisis filogenetik menunjukkan bahwa isolat-isolat Begomovirus terbagi menjadi 3 kelompok yang berbeda. Isolat-isolat Brastagi, Bogor, Sragen, Ketep dan Boyolali berkerabat dekat dengan Tomato Leaf Curl Virus-Java (ToLCV-Java) atau ToLCV-Java (A), isolat Malang dan Blitar berkerabat dekat dengan Ageratum Yellow Vein Virus- China (AYVV-China), sedangkan isolat Kaliurang berkerabat dengan Tomato Yellow Leaf Curl Virus-China (TYLCV-China) atau ToLCV-Laos. Amplifikasi PCR menggunakan asam nukleat total dan primer spesifik untuk gen AV1 Begomovirus, sekuensing secara langsung dari produk PCR, dan analisis sekuen asam nukleotida dan asam amino menggunakan BLAST telah dilakukan. Hasil dari percobaan adalah (i) adanya pita DNA hasil amplifikasi PCR membuktikan bahwa sampel-sampel tomat yang sakit terinfeksi oleh Begomovirus (ii) hasil analisis BLAST menggunakan sekuen nukelotida dan asam amino menunjukkan bahwa fragmen DNA hasil amplifikasi PCR adalah gen AV1 dari Begomovirus, (iii) identitas asam nukleat dan asam amino dari gen AV1 di antara isolat-isolat Begomovirus mengindikasikan bahwa isolat-isolat tersebut adalah isolat Ageratum yellow vein virus (AYVV) Indonesia, dan (iv) hasil analisis filogenetik mengindikasikan bahwa delapan isolat Begomovirus tersebut terbagi menjadi dua kelompok yang berbeda. Serangkaian tahapan untuk konstruksi gen AV1 Begomovirus juga telah dilakukan diantaranya adalah amplifikasi gen AV1 menggunakan primer spesifik, transformasi ke bakteri E. coli DH5α dan kloning gen tersebut ke vektor ekspresi pbi121. Transformasi genetik dilakukan dengan cara eksplan potongan daun tanaman tembakau yang ditumbuhkan secara in vitro ditransformasi melalui kokultivasi dengan A. tumefaciens yang mengandung konstruksi gen AV1. Hasil percobaan menunjukan bahwa gen AV1-Begomovirus berhasil diamplifikasi dan disisipkan ke dalam vektor ekspresi pbi121. Tanaman-tanaman tembakau hasil transformasi genetik dengan gen AV1 telah dihasilkan dan diaklimatisasi di rumah kaca dan diketahui telah membawa gen ketahanan terhadap kanamisin (gen nptii) dan gen AV1. Analisis molekuler dan uji keefektifan gen AV1 pada tanaman-tanaman tembakau transgenik putatif generasi T0 untuk mendapatkan ketahanan terhadap Begomovirus menunjukkan bahwa terdapat korelasi yang positif antara keberadaan atau integrasi gen AV1 Begomovirus pada tanaman tembakau transgenik dengan fenotipe ketahanan terhadap infeksi virus. Integrasi gen AV1 yang bersifat kopi tunggal lebih tahan terhadap infeksi virus dibandingkan integrasi gen yang multi-kopi. Ketahanan yang diperoleh dari ekspresi gen AV1 Begomovirus diindikasikan dengan tidak adanya gejala dan akumulasi virus pada jaringan tanaman. Analisis hibridisasi Northern atau Western perlu dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya akumulasi mrna atau protein, sehingga vi

7 mekanisme ketahanan yang terjadi dapat dijelaskan lebih detail. Pemuliaan konvensional dilakukan untuk mendapatkan galur-galur tomat yang tahan TYLCV (Begomovirus) yang dikombinasikan dengan ketahanan terhadap CMV. Materi tanaman yang digunakan dalam percobaan adalah tanaman generasi F1-TYLCV (hasil persilangan galur tahan dan rentan TYLCV) dan tanaman generasi F1-CMV (hasil persilangan galur rentan dan galur transgenik tahan CMV). Hasil percobaan menunjukkan bahwa bioasai tanaman-tanaman F1- doublecross (F1DC-Intan/R //FLA456/Intan dan F 1 DC-CL6046/R //FLA456/CL6046) dengan TYLCV diperoleh masing-masing 10 dan 9 tanaman yang menunjukkan fenotipe tahan. Hal ini mengindikasikan bahwa tanaman-tanaman F1-kombinasi tersebut telah membawa gen ketahanan terhadap TYLCV. Deteksi gen CP-CMV dengan teknik PCR mengindikasikan bahwa gen tersebut juga telah terbawa pada tanaman-tanaman F1-DC. Dengan demikian, pada penelitian ini telah diperoleh tanaman-tanaman F1-doublecross/F1-DC (hasil persilangan antara F1-TYLCV tahan dan F1-CMV tahan) yang memperlihatkan fenotipe yang tahan terhadap TYLCV dan membawa gen ketahanan terhadap CMV. Tanaman-tanaman F1-DC ini akan dijadikan sebagai materi untuk pengembangan varietas tomat tahan TYLCV dan CMV selanjutnya. Kata kunci: Tomat (Lycopersicon esculentum, Mill), Begomovirus, teknik PCR- RFLP, gen AV1, TYLCV, keragaman genetik, transformasi genetik, tembakau (Nicotiana tabaccum), tanaman transgenik vii

8 Hak Cipta milik IPB, tahun 2008 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB viii

9 IDENTIFIKASI BEGOMOVIRUS INDONESIA PADA TOMAT DAN ANALISIS DIVERSITAS GENETIK GEN AV1 SERTA PEMANFAATANNYA UNTUK PENGEMBANGAN TANAMAN TAHAN VIRUS TRI JOKO SANTOSO Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Agronomi SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008 ix

10 x

11 Penguji pada Ujian Tertutup : Dr. Ir. Endang Nurhayati, MS Penguji pada Ujian Terbuka : Dr. Ir. Agus Purwito, MSc.Agr Dr. Ir. Ati Srie Duriat, APU (Profesor riset) xi

12 PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan pada Allah SWT atas segala karunia- Nya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Disertasi ini berjudul Identifikasi Begomovirus Indonesia Pada Tomat dan Analisis Diversitas Genetik Gen AV1 serta Pemanfaatannya Untuk Pengembangan Tanaman Tahan Virus. Disertasi ini memuat dua bab yang merupakan pengembangan dari naskah artikel yang diajukan ke jurnal ilmiah. Bab 4 berjudul Identitas dan keragaman genetik Begomovirus yang berasosiasi dengan penyakit keriting pada tomat berdasarkan teknik PCR-RFLP telah diterbitkan (AgroBiogen 4[1]: 9-7. April 2008). Bab 5 berjudul Identity and sequence diversity of Begomovirus associated with yellow leaf curl disease of tomato in Indonesia juga telah diterbitkan (Microbiology Indonesia 2[1]: 1-7. April 2008). Pada kesempatan ini, penulis menyampaikan terima kasih yang sebesarbesarnya kepada Prof Dr Ir Sudarsono MSc selaku ketua komisi pembimbing, Dr Ir Hajrial Aswidinnoor MSc, Dr Ir Sri Hendrastuti Hidayat MSc dan Dr Muhammad Herman selaku anggota komisi pembimbing yang telah banyak membimbing dan mengarahkan penulis selama menjalani pendidikan dan penelitian di Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Terima kasih juga disampaikan kepada Dr Ir Endang Nurhayati MS, Dr Ir Agus Purwito MSc dan Dr Ir Ati Srie Duriat, APU (Profesor Riset) selaku dosen penguji luar komisi pada ujian tertutup dan terbuka yang telah banyak memberi masukan dan saran. Di samping itu, penulis juga menyampaikan terima kasih yang tidak terkira kepada Kepala Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian dan Sekretaris Badan Litbang Pertanian atas ijin dan kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk melanjutkan studi di Sekolah Pasca Sarjana, IPB. Demikian juga kepada pimpinan proyek USAID-ABSP II dan PTAAP II Badan Litbang Pertanian beserta staf yang telah membiayai sekolah ini. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Rektor IPB dan Ketua Program Studi Agronomi yang telah menerima penulis untuk menjadi mahasiawa program doktor dan atas bimbingan serta dorongan yang telah diberikan selama penulis menjalani masa studi. Penulis juga mengungkapkan terima kasih yang setulus-tulusnya kepada Bapak dan Ibu, Bapak dan Ibu mertua serta seluruh keluarga atas segala lantunan doa, jerih payah dan kasih sayangnya sehingga penulis mempunyai motivasi untuk menyelesaikan studi dan penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan untuk istri tercinta dan anak-anak tersayang atas kesabaran dan ketabahan dalam mendampingi, memberi motivasi dan inspirasi selama penulis menempuh studi. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada rekan-rekan staf peneliti serta para teknisi yang tergabung dalam tim penelitian transformasi padi di Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada semua pihak yang tidak bisa penulis sebutkan satu per satu yang telah memberi dukungan moril dan membantu dalam pelaksanaan penelitian. Penulis menyadari bahwa di dalam penyusunan tulisan ini masih banyak kekurangan dan kelemahan. Maka dari itu, penulis sangat berharap adanya kritik dan saran dari pembaca demi sempurnanya tulisan ini. Semoga tulian karya ilmiah xii

13 ini dapat bermanfaat di kemudian hari. Amien. Bogor, November 2008 Tri Joko Santoso xiii

14 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Klaten, Jawa Tengah, pada tanggal 19 Mei 1972 dari pasangan Bapak Ngadimin Hadi Sumarto dan Ibu Sri Natun sebagai anak kedua dari lima bersaudara. Pada tahun 2005 menikah dengan Atmitri Sisharmini MSi dan dikaruniai dua orang anak putri dan putra, Aulia Izzati Putri (2,5 tahun) dan Rais Arkan Nugraha (6 bulan). Pada tahun 1984 penulis menyelesaikan pendidikan SD di SDN II Meger, Ceper, Klaten kemudian melanjutkan ke SMPN I Ceper dan lulus pada tahun Pada tahun 1990 lulus dari SMAN I Klaten. Penulis memperoleh gelar Sarjana Pertanian dari Fakultas Pertanian, Universitas Gadjah Mada di Yogyakarta pada tahun Pada tahun 2004 memperoleh gelar Magister Sains dari Program Studi Bioteknologi, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor melalui beasiswa pendidikan dan dana penelitian dari proyek ARMP II, Badan Litbang Pertanian, Departemen Pertanian. Pada tahun 2004 melanjutkan studi program Doktor (S3) dengan biaya dari proyek USAID-ABSP II dan PTAAP (Departemen Pertanian) pada program Studi Agronomi Institut Pertanian Bogor. Penulis saat ini bekerja sebagai staf peneliti di Kelompok Peneliti Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB BIOGEN) Bogor, sejak tahun 1996 sampai sekarang. xiv

15 DAFTAR ISI DAFTAR TABEL... xviii DAFTAR GAMBAR... xx DAFTAR LAMPIRAN... xxiii I. PENDAHULUAN Latar Belakang... 1 Tujuan Penelitian... 6 Strategi dan Alur Penelitian... 6 II. TINJAUAN PUSTAKA Famili Geminiviridae... 9 Karakterisasi molekuler dari Begomovirus Keragaman genetik dari Begomovirus Teknik deteksi dan identifikasi Begomovirus Pemuliaan konvensional untuk ketahanan terhadap Begomovirus.. 17 Rekayasa genetik untuk ketahanan terhadap Begomovirus III. DETEKSI BEGOMOVIRUS YANG MENGINFEKSI TOMAT MENGGUNAKAN TEKNIK POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Abstrak Abstract Pendahuluan Bahan dan Metode Hasil Pembahasan Simpulan Daftar Pustaka IV. IDENTITAS DAN KERAGAMAN GENETIK BEGOMOVIRUS YANG BERASOSIASI DENGAN PENYAKIT KERITING PADA TOMAT BERDASARKAN TEKNIK PCR-RFLP Abstrak Abstract Pendahuluan Bahan dan Metode Hasil Pembahasan Simpulan Daftar Pustaka xv

16 V. IDENTITY AND SEQUENCE DIVERSITY OF BEGOMOVIRUS ASSOCIATED WITH YELLOW LEAF CURL DISEASE OF TOMATO IN INDONESIA Abstrak Abstract Introduction Materials and Method Results Discussions Conclusion References VI. KONSTRUKSI GEN AVI BEGOMOVIRUS PADA VEKTOR EKSPRESI DAN INTRODUKSINYA KE TEMBAKAU MENGGUNAKAN Agrobacterium tumefaciens Abstrak Abstract Pendahuluan Bahan dan Metode Hasil Pembahasan Simpulan Daftar Pustaka VII. ANALISIS MOLEKULER DAN UJI KEEFEKTIFAN GEN AV1 PADA TANAMAN TEMBAKAU TRANSGENIK UNTUK KETAHAHAN TERHADAP BEGOMOVIRUS Abstrak Abstract Pendahuluan Bahan dan Metode Hasil Pembahasan Simpulan Daftar Pustaka VIII. PENDEKATAN KONVENSIONAL UNTUK KETAHANAN TOMAT TERHADAP BEGOMOVIRUS YANG DIKOMBINASIKAN DENGAN KETAHANAN TERHADAP CMV Abstrak Abstract Pendahuluan Bahan dan Metode xvi

17 Hasil Pembahasan Simpulan Daftar Pustaka IX. PEMBAHASAN UMUM X. SIMPULAN UMUM DAN SARAN DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN xvii

18 DAFTAR TABEL Halaman 1. Deskripsi gejala dominan pada tanaman tomat sakit yang ditemukan di beberapa lokasi pengambilan sampel Frekuensi kejadian penyakit yang disebabkan oleh infeksi Begomovirus dari beberapa lokasi pengambilan sampel Ukuran fragmen DNA yang dihasilkan dari pemotongan produk PCR dari 8 isolat Begomovirus dan prediksi RFLP isolat-isolat dari DNA database menggunakan enzim restriksi DraI, EcoRI, RsaI dan PstI Isolate identity, observed symptoms on collected tomato samples, location of collected samples, and number of determined nucleic acid and predicted amino acid sequences based on the polymerase chain reaction amplified putative AV1 gene Percentages of sequence identities of AV1 gene among suspected Begomoviruses isolates determined in this research and three Begomoviruses available in the GenBank database Distance matrices (%) based on predicted AV1 gene amino acid sequences of suspected Begomoviruses isolates determined in this research, Ageratum yellow vein virus (AYVV), Soybean crinkle leaf virus (SCLV), Pepper leaf curl virus (PepLCV), Tomato leaf curl virus (ToLCV), and Cassava mosaic virus (CasMV) Jumlah tunas dan planlet yang dihasilkan serta persentase tunas menjadi planlet pada transformasi genetik tembakau dengan gen AV1 Begomovirus melalui bantuan A. tumefaciens Deteksi PCR gen AV1 dan bioasai tanaman tembakau transgenik putatif generasi T0 dengan Begomovirus di rumah kaca Kategori respon tanaman tembakau transgenik putatif setelah dianalisis PCR dan bioasai Hubungan antara analisis PCR, bioasai, jumlah kopi dan keberadaan virus target dalam tanaman transgenik Materi tanaman yang digunakan dalam penelitian Skoring keparahan gejala pada tanaman yang terinfeksi xviii

19 Begomovirus Skoring keparahan gejala pada tanaman yang terserang CMV Konfirmasi ketahanan tetua terhadap TYLCV melalui penularan dengan serangga vektor kutu kebul di rumah kaca Skrining beberapa galur tomat terhadap TYLCV melalui penularan dengan serangga vektor kutu kebul di rumah kaca Skrining beberapa tanaman tomat terhadap CMV menggunakan penularan secara mekanis di rumah kaca Berat benih yang dihasilkan dari masing-masing F1-silang ganda Skrining tomat F1-IC-Intan/R //FLA456/Intan (39) terhadap TYLCV melalui penularan dengan serangga vektor kutu kebul di rumah kaca Skrining tomat F 1 IC-CL6046/R //FLA456/CL6046 (38) terhadap TYLCV melalui penularan dengan serangga vektor kutu kebul di rumah kaca tanaman xix

20 DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Diagram alur strategi penelitian dan keterkaitan antar percobaan dari selutruh kegiatan penelitian Taksonomi dari famili Geminiviridae: tipe spesies, organisasi genom, tanaman inang dan vektor serangganya Organisasi genom masing-masing genus dari famili Geminiviridae dan serangga vektor utamanya Morfologi gejala pada tanaman tomat yang diduga terinfeksi oleh Begomovirus yang ditemukan di lapang Elektroforesis gel dari fragmen DNA hasil optimasi teknik amplifikasi PCR menggunakan primer universal untuk mendeteksi Begomovirus pada sampel koleksi Laboratorium Virologi, PS Proteksi Tanaman, IPB Gel elektroforesis fragmen DNA produk amplifikasi PCR menggunakan primer universal untuk mendeteksi Begomovirus pada tanaman tomat sakit yang dikoleksi dari Malang dan Blitar Tipe gejala pada tanaman tomat sakit yang ditemukan di daerah Pagerwangi, Lembang, Jawa Barat Tanaman tomat sakit yang diduga terinfeksi Begomovirus yang ditemukan di lapang Elektroforesis hasil amplifikasi PCR DNA Begomovirus pada sampel tanaman tomat menggunakan primer universal dari 8 daerah yang berbeda pada agarosa gel 1% Elektroforesis fragmen DNA produk amplifikasi PCR dari genom Begomovirus yang dipotong dengan ensim restriksi (a) DraI (b) EcoRI (c) RsaI dan (d) PstI pada gel agarosa 1% Dendrogram hasil analisis fragmen DNA restriksi dari isolat-isolat Begomovirus asal tomat dari 8 daerah yang berbeda menggunakan program NTSYSpc Dendrogram yang dihasilkan oleh analisis keragaman genetik berdasarkan fragmen situs restriksi dari isolat-isolat Begomovirus yang terdiri dari 8 isolat lokal Indonesia dan isolat-isolat dari database bank gen menggunakan program NTSYSpc Tomato plants exhibited various leaf-curl symptoms. Subsequent experiment indicated they were infected by Begomoviruses xx

21 14. Agarose gel electropherogram of polymerase chain reaction (PCR) amplified DNA fragments of putative AV1. The DNA fragments were amplified by PCR using AV1 specific primers and total nucleic acid of diseased tomato sample Alignment of partial amino acid sequences predicted from determine nucleotide sequences of AV1 gene of eight Begomovirus isolates determined in this research and seven Begomovirus isolates available from GenBank DNA database Phylogenetic relationship based on predicted AV1 gene amino acid sequences of suspected Begomoviruses isolates determined in this research, and other Begomoviruses available in the GenBank DNA database Elektroforesis pada gel agarosa 1%. (a) produk amplifikasi gen AV1 dari dua isolat Begomovirus (CP 8 dan CP11) menggunakan primer spesifik CPPROTEIN-V1 dan CPPROTEIN-C1. (b) DNA plasmid rekombinan pcp8 (1-6) dan pcp11 (1-6) hasil isolasi dari koloni tunggal bakteri E. coli DH5α Peta plasmid biner pbi121 yang membawa gen pelapor gus dan gen marker nptii pada struktur T-DNAnya Elektroforesis fragmen gen AV1 yang dipotong dari vektor pgem-t easy dan fragmen gen GUS dari vektor ekspresi pbi121 dengan enzim restriksi XbaI dan SacI pada gel agarosa 1%. AV1 = fragmen gen AV1 yang berukuran 780 bp; GUS = fragmen gen GUS yang berukuran 2000 bp Elektroforesis hasil verifikasi insersi fragmen gen AV1 dengan enzim restriksi XbaI dan SacI Peta konstruksi plasmid biner pbi-cp yang membawa gen AV1 Begomovirus dengan promoter 35S-CaMV dan terminator nos, dan gen marker nptii pada struktur T-DNA Transformasi genetik tembakau dengan gen AV1 melalui vektor A. tumefaciens Elektroforesis gel hasil amplifikasi gen nptii pada 46 tanaman tembakau transgenik putatif generasi T0 menggunakan primer PCR spesifik Deteksi PCR gen AV1 pada 46 tanaman tembakau transgenik putatif generasi T0 menggunakan primer spesifik Bioasai tanaman tembakau transgenik menggunakan vektor serangga kutu kebul xxi

22 26. Analisis hibridisasi Southern Blot pada sampel tanaman tembakau trasngenik putatif generasi T0 yang positif PCR dan 2 tanaman yang negatif PCR (no.10 & 20) dengan pelacak gen AV Deteksi keberadaan Begomovirus dengan teknik PCR menggunakan primer universal pada tanaman tembakau transgenik generasi T0 setelah bioasai Skrining tanaman F1-TYLCV (F1 FLA456/Intan dan FLA456/CL6046) dengan TYLCV menggunakan vektor kutu kebul di rumah kaca Beberapa gejala tanaman F1-CMV setelah inokulasi dengan CMV Amplifikasi gen CP pada tanaman generasi F1 Intan/R ; Varietas Intan; Air; Galur transgenik R menggunakan teknik PCR Amplifikasi gen CP-CMV pada tanaman generasi F1 CL6046/R ; Varietas CL6046; Air; Galur transgenik R menggunakan teknik PCR Amplifikasi gen CP-CMV pada tanaman generasi F 1 IC-Intan/R //FLA456/Intan (39); Varietas Intan; Air; Galur transgenik R (+) menggunakan teknik PCR Amplifikasi gen CP-CMV pada tanaman generasi F 1 IC-CL6046/R //FLA456/CL6046 (38); Varietas CL6046; Air; Galur transgenik R (+) menggunakan teknik PCR xxii

23 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Amplifikasi PCR dengan primer universal untuk mendeteksi Begomovirus pada tanaman tomat dari beberapa daerah Komposisi Media Dasar Murashige and Skoog Deskripsi Varietas/Galur Tomat xxiii

24 I. PENDAHULUAN Latar Belakang Tomat (Lycopersicum esculentum Mill.) adalah salah satu komoditas sayuran penting secara ekonomi yang dibudidayakan hampir di seluruh dunia termasuk Indonesia. Komoditas ini mempunyai banyak fungsi di antaranya adalah bahwa buah tomat dapat berfungsi sebagai sayuran, buah meja, minuman, bahkan sebagai bahan kosmetik dan obat-obatan (Duriat 1996). Di bidang kesehatan, tomat merupakan salah satu komoditas yang mendapat perhatian besar karena selain kandungan vitamin dan mineral, tomat juga mengandung senyawa antioksidan yang bermanfaat untuk pencegahan penyakit kronis termasuk di antaranya adalah penyakit jantung koroner dan beberapa penyakit kanker (Weisburger 1998). Buah tomat kaya akan senyawa-senyawa karotenoid termasuk likopin (lycopene). Tomat juga termasuk dalam lima besar tanaman sayuran penting di Indonesia selain kubis, bawang putih, kacang kapri dan cabai. Produksi tomat pada tahun 2006 mencapai hampir ton dengan produktifitas 11,74 ton/ha dan luas panen ha (Deptan 2007). Infeksi virus daun (kuning) menggulung yang menyebabkan penyakit keriting daun pada tomat [Tomato (Yellow) Leaf Curl Virus, TYLCV/ToLCV] dari salah satu anggota genus Begomovirus (Famili Geminiviridae), adalah salah satu kendala biotik yang serius pada produksi tomat di seluruh dunia. Gejalagejala tanaman yang terinfeksi virus ini diantaranya adalah penghambatan pertumbuhan, daun menguning dan menggulung (keriting) serta tanaman menjadi kerdil. Virus ini dapat menginfeksi tanaman tomat baik pada tanaman muda atau tua yang ditanam di lapang terbuka atau di rumah kaca, dan menyebabkan kehilangan produksi yang dapat mencapai 100% apabila menginfeksi tanaman sewaktu masih muda. Virus ini telah ditemukan di beberapa negara tropik, subtropik dan mediterania seperti negara-negara di Timur Tengah, Eropa Barat Daya, Afrika, Asia Tenggara dan kepulauan Karibia (Green & Kalloo 1994; Czosnek & Laterrot 1997; Jones 2003), bahkan juga ditemukan di daerah dengan iklim temperate (Moriones & NavasCastillo 2000) yang kejadian penyakitnya berkisar antara % dan dapat menyebabkan kehilangan hasil sampai 100% (Polston & Anderson 1997; Dellate 2005). Di Indonesia, serangan yang berat dari

25 virus ini dapat menginfeksi hampir % tanaman tomat dan mengakibatkan pengurangan hasil antara % (AVRDC Centerpoint newsletter spring 2003 issue). Sudiono et al. (2001) melaporkan bahwa serangan virus daun kuning menggulung pada tanaman tomat di daerah Bogor dan sekitarnya mencapai 50-70%. Usaha pengendalian penyakit keriting yang disebabkan infeksi TYLCV sampai saat ini masih sulit untuk dilakukan karena tidak ada pestisida yang dapat diaplikasikan secara langsung untuk mengontrol virus tersebut. Pengendalian biasanya dilakukan secara tidak langsung antara lain dengan mengurangi sumber inokulum dengan cara mencabut atau menghilangkan tanaman-tanaman yang telah menunjukkan gejala serangan virus, mengendalikan perkembangan serangga vektor, melakukan pergiliran tanaman, dan pemberantasan gulma yang dapat menjadi inang pembawa virus. Akan tetapi cara-cara pengendalian ini terkadang kurang efektif karena proses penularan virus ini dapat terjadi dengan cepat mengingat penularan virus ini dilakukan oleh serangga vektor. Penggunaan varietas tahan merupakan pilihan yang tepat untuk mengendalikan virus karena metode ini relatif lebih aman dan murah bila dibandingkan dengan metode pengendalian yang lain. Terdapat dua pendekatan utama untuk pengembangan ketahanan genetik terhadap virus yang tergantung pada sumber gen yang digunakan (Dasgupta et al. 2003). Gen ketahanan dapat berasal dari virus itu sendiri atau berasal dari sumber yang lain. Pendekatan pertama didasarkan pada konsep ketahanan yang berasal dari patogen (pathogen-derived resistance, PDR). Pendekatan PDR memanfaatan elemen genetik yang berupa gen utuh atau bagian gen dari genom virus kemudian diklon dan diintroduksikan ke tanaman, yang selanjutnya akan mempengaruhi satu atau beberapa tahap penting dalam siklus hidup virus. Pemanfaatan gen selubung protein (coat protein gene) (Vidya et al. 2000) merupakan salah satu contoh dari pendekatan PDR ini. Pendekatan yang kedua adalah ketahanan yang berasal bukan dari patogen (non pathogen-derived resistance), yang didasarkan pada pemanfaatan gen-gen ketahanan dari tanaman inang dan gen-gen lain yang bertanggungjawab untuk adaptasi dan respon tanaman inang terhadap serangan patogen, dan untuk memperoleh tanaman transgenik yang tahan terhadap virus 2

26 tersebut. Penggunaan pendekatan non-pdr, diantaranya dilakukan oleh Hanson et al. (2000). Meskipun tidak sepopuler pendekatan PDR, pendekatan non PDR memberikan harapan dan peluang yang besar untuk mengembangkan ketahanan yang bersifat durabel (dapat bertahan lama dan berkelanjutan) ketika dikombinasikan dengan pendekatan PDR. Galur-galur tomat hasil pemuliaan secara konvensional yang mempunyai ketahanan terhadap TYLCV (Begomovirus) telah dikembangkan oleh The Asian Vegetables Research and Development Center (AVRDC), Taiwan dan telah diuji serta terbukti efektif terhadap beberapa strain TYLCV Asia termasuk diantaranya Taiwan, India Selatan dan Thailand (AVRDC Centerpoint newsletter spring 2003 issue). Galur-galur tomat yang tahan CMV juga telah dikembangkan oleh AVRDC melalui pendekatan rekayasa genetik menggunakan gen protein selubung (coat protein gene). Sampai sekarang ini, galur transgenik tahan CMV tersebut telah dievaluasi di lapang dan menunjukkan tingkat ketahanan yang memadai untuk mengendalikan infeksi virus. Melalui proyek kerjasama ABSP II yang didanai oleh USAID, persilangan antara tomat varietas Indonesia (Intan dan CL6046) dengan varietas tomat yang tahan TYLCV (FLA 456 dan FLA 478) atau varietas tomat transgenik tahan CMV (R ) telah dilakukan di AVRDC dan menghasilkan tanaman tomat generasi F1 dari masing-masing persilangan (tanaman F1-TYLCV dan F1-CMV). Tanaman tomat generasi F1-TYLCV dan F1-CMV tersebut kemudian didonasikan ke Indonesia (BB BIOGEN) sebagai materi untuk pengembangan tomat tahan multi-virus. Pendekatan konvensional untuk pengembangan varietas tahan virus memiliki beberapa keterbatasan. Di antaranya adalah sumber gen ketahanan belum ditemukan pada koleksi plasmanutfah tomat di Indonesia. Selain itu, kultivar tahan yang dihasilkan melalui pemuliaan konvensional dengan memanfaatkan gen-gen ketahanan dari kerabat liar akan cepat terpatahkan. Kondisi tersebut disebabkan perubahan dari virus yang cepat akibat adanya rekombinasi dan adanya variasi genetik yang tinggi dari virus. Kultivar tahan yang dihasilkan mungkin hanya spesifik untuk strain atau isolat tertentu. Oleh karena itu, diperlukan pendekatan lain seperti pemanfaatan teknik rekayasa genetik untuk mengembangkan kultivar tomat tahan virus dengan durabilitas 3

27 ketahanan yang tinggi. Pemanfaatan teknik rekayasa genetik memberikan wahana baru bagi para pemulia tanaman untuk memperoleh gen baru yang lebih luas (Greenberg & Glick 1993). Di samping itu, munculnya teknik rekayasa genetik dapat mengatasi masalah inkompatibilitas dan linkage drag karena introgresi gen-gen penting dilakukan dengan mengintroduksikan gen secara langsung ke dalam genom tanaman. Sifat ketahanan tanaman terhadap beberapa cekaman biotik seperti misalnya gulma, virus, serangga dan mikroorganisme telah dapat diperbaiki dengan pendekatan ini. Demikian pula terhadap cekaman abiotik dan modifikasi kualitas dan kuantitas produk tanaman (Bennet 1993). Teknologi rekayasa genetik dapat digunakan sebagai mitra dan pelengkap teknik pemuliaan tanaman konvensional yang telah digunakan dengan sukses selama bertahun-tahun (Riazudin 1994). Suatu gen yang tidak terdapat pada suatu spesies tanaman tertentu dimungkinkan untuk dapat diperoleh dari organisme lain, seperti bakteri, virus, binatang dan tanaman lain dan dipindahkan ke tanaman (Herman 1996). Sebagai contoh gen penyandi protein selubung virus (virus coat protein gene), diisolasi dari virus untuk memperoleh resistensi non-konvensional terhadap virus. Gen ini digabungkan dengan suatu sekuen pengendali (promoter dan terminator) dan ditransformasikan ke dalam tanaman. Bila gen tersebut terekspresi ke dalam tanaman akan terjadi akumulasi protein pembungkus virus. Mekanisme resistensi ini berperan pada tingkat awal proses replikasi virus, dengan menghalangi proses replikasi secara tidak terkendali dari partikel virus (Aswidinnoor 1995). Mekanisme lain yang juga berperan di dalam ketahanan terhadap virus yang dikembangkan melalui pendekatan rekayasa genetik adalah mekanisme pembungkaman gen paska transkripsi (post transcriptional gene silencing) (Dasgupta et al. 2003). Berdasarkan informasi ini, perlu dilakukan pemanfaatan gen-gen Begomovirus untuk pengembangan varietas tahan. Di dalam pengembangan tanaman tomat tahan virus, adanya informasi tentang keragaman genetik virus akan dapat bermanfaat dalam hal pemilihan lokasi untuk pengujian (uji multi-lokasi). Selain itu, informasi mengenai suatu strain virus yang dominan menginfeksi tanaman tomat perlu diketahui sehingga dapat diambil langkah-langkah pengendaliannya. Isolat-isolat Begomovirus di 4

28 negara India dan Taiwan, telah berhasil diidentifikasi secara molekuler. Urutan DNA genom dari isolat-isolat tersebut telah dapat dibandingkan sehingga dapat diketahui tingkat kesamaannya (Zeidan et al. 1998). Kemajuan di bidang biologi molekuler telah menghadirkan beberapa teknik yang dapat digunakan untuk mendeteksi dan mengidentifikasi virus. Salah satu teknik molekuler yang banyak diaplikasikan adalah Polymerase Chain Reaction (PCR) karena teknik ini sangat sensitif dan spesifik untuk mendeteksi dan mengidentifikasi patogen-patogen tanaman. Selain itu, PCR dapat digunakan untuk mengetahui komposisi populasi patogen dan diversitas genetik virus (Rojas et al. 1993). Spesifisitas PCR didasarkan pada penggunaan primer-primer oligonukleotida yang komplementer dengan daerah yang mengapit sekuen DNA yang diamplifikasi. Deteksi virus dengan metode serologi mempunyai beberapa kelemahan diantaranya adalah rendahnya titer dari antigen sehingga virus sulit untuk dideteksi, adanya reaksi silang antibodi dengan antigen heterolog dan adanya pengaruh pengaturan produksi antibodi oleh lingkungan dan tahap perkembangan dari tanaman. Sedangkan metode deteksi dengan PCR mempunyai keuntungan antara lain metode ini hanya membutuhkan sampel DNA yang sedikit yang dapat diperoleh dari jaringan tanaman yang segar, disimpan di lemari es atau bahkan jaringan yang telah kering. Selain itu deteksinya tidak dipengaruhi oleh tahap perkembangan tanaman dan faktor lingkungan. Teknik ini juga relatif lebih mudah untuk dilakukan dan memungkinkan untuk analisis sekuen (sequencing) berdasarkan fragmen produk PCR yang terbentuk. Di Indonesia, keragaman genetik Begomovirus pada tingkat molekuler (urutan basa DNA) belum banyak dilaporkan. Usaha identifikasi melalui teknik hibridisasi asam nukleat dan polymerase chain reaction (PCR) telah dirintis oleh beberapa peneliti (Hidayat et al. 1999; Aidawati et al. 2005). Namun demikian, informasi yang lebih mendetail mengenai urutan sekuen DNA dari Begomovirus yang mungkin berkaitan dengan sekuen-sekuen fungsional atau yang dapat menunjukkan adanya keragaman genetik di antara Begomovirus belum pernah dilakukan. 5

29 Tujuan Penelitian 1. Memperoleh informasi tentang adanya infeksi Begomovirus pada pertanaman tomat di beberapa daerah sentra produksi melalui deteksi menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) dan menentukan identitas serta keragaman genetiknya berdasarkan teknik PCR-RFLP dan analisis sekuen nukleotida dan asam amino gen AV1. 2. Memperoleh klon gen AV1 Begomovirus pada vektor kloning dan mendapatkan konstruksi gen tersebut pada vektor ekspresi untuk digunakan dalam kegiatan transformasi genetik tanaman. 3. Mendapatkan tanaman-tanaman tembakau transgenik (sebagai tanaman model) yang membawa gen AV1 untuk mempelajari keefektifan gen tersebut dalam hubungannya dengan ketahanan terhadap Begomovirus. 4. Mendapatkan galur-galur tanaman tomat yang tahan terhadap Begomovirus (TYLCV) yang dikombinasikan dengan ketahanan terhadap CMV melalui pendekatan konvensional Strategi dan Alur Penelitian Untuk dapat mencapai tujuan-tujuan tersebut di atas maka strategi penelitian yang dilakukan meliputi beberapa pendekatan, yaitu diantaranya adalah melakukan survei dan mengumpulkan tanaman tomat sakit atau bagiannya yang menunjukkan gejala-gejala spesifik terinfeksi oleh Begomovirus dari beberapa sentra produksi di Indonesia. Asam nukleat total dari jaringan tanaman tomat sakit diisolasi dan digunakan sebagai cetakan untuk amplifikasi DNA genom Begomovirus dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan menggunakan primer universal (top primer) untuk Begomovirus (Percobaan 1). Hal ini diharapkan akan diperoleh informasi tentang adanya kejadian penyakit akibat infeksi Begomovirus pada sentra-sentra produksi di beberapa daerah dan juga didapatkan isolat-isolat Begomovirus yang dapat digunakan untuk materi percobaan selanjutnya. Isolat-isolat Begomovirus yang menginfeksi tomat yang telah dikoleksi dari beberapa daerah sentra produksi tomat dianalisis diversitas atau keragaman 6

30 genetiknya untuk menentukan identitas dan hubungan kekerabatan antar isolat Begomovirus tersebut. Studi diversitas genetik dilakukan dengan melihat adanya perbedaan situs enzim restriksi dari masing-masing isolat Begomovirus berdasarkan teknik PCR-RFLP (Percobaan 2). Untuk mempelajari secara lebih detail adanya diversitas genetik di antara isolat Begomovirus, dilakukan analisis sekuen nukleotida dan asam amino dari gen AV1 yang merupakan gen yang mempunyai sekuen yang konservatif (conserved sequences) (Percobaan 3). Di samping informasi tentang keragaman genetik dari isolat-isolat Begomovirus yang menginfeksi tomat, dari penelitian 3 juga diharapkan dapat diperoleh identitas genetik Begomovirus Indonesia dengan Begomovirus yang ada di database DNA (GenBank). Upaya untuk mengendalikan penyakit yang berasosiasi dengan Begomovirus dapat ditempuh dengan menggunakan varietas-varietas tomat yang tahan, maka pada penelitian disertasi ini dilakukan dua pendekatan yang berbeda untuk merakit tanaman tahan terhadap Begomovirus. Pertama, pendekatan nonkonvensional melalui teknik rekayasa genetik dengan menggunakan gen yang berasal dari Begomovirus itu sendiri, yang sering disebut dengan pathogenderived resistance (PDR). Untuk pendekatan ini dilakukan konstruksi gen AV1 Begomovirus (menyandikan protein selubung) pada vektor ekspresi dan konstruk gen AV1 diintroduksikan ke tanaman tembakau menggunakan vektor bakteri A. tumefaciens (Percobaan 4). Transformasi genetik tanaman tembakau (tanaman model) dengan gen AV1 dimaksudkan untuk mempelajari fungsi dan efektifitas gen AV1 sebelum diintroduksikan ke tanaman target. Tanaman-tanaman tembakau transgenik putatif yang dihasilkan pada penelitian 4 digunakan sebagai materi untuk analisis deteksi keberadaaan gen AV1 pada genom menggunakan teknik PCR dan Southern Blot serta untuk evaluasi keefektifan gen AV1 terhadap Begomovirus (Percobaan 5). Kedua, pendekatan konvensional dilakukan dengan memanfaatkan gen ketahanan terhadap TYCLV yang ada pada galur-galur dari AVRDC melalui persilangan dengan tomat-tomat Indonesia untuk mendapatkan tanaman tomat Indonesia yang tahan terhadap TYLCV (Begomovirus) (Percobaan 6). Untuk memudahkan pemahaman terhadap strategi penelitian yang digunakan maka dibuat diagram alur penelitian (Gambar 1). 7

31 Koleksi tanaman tomat terinfeksi Begomovirus Deteksi Begomovirus yang menginfeksi tomat (Percobaan 1) Amplifikasi PCR DNA Begomovirus dengan primer universal (top primer) Amplifikasi PCR DNA Begomovirus dengan primer spesifik gen AV1 Pemotongan produk PCR dengan enzim restriksi Analisis keragaman genetik Begomovirus berdasarkan teknik PCR-RFLP (Percobaan 2) Analisis sekuen produk PCR berdasarkan primer gen AV1 Analisis keragaman genetik Begomovirus berdasarkan sekuen gen AV1 (Percobaan 3) Gen AV1 dari isolat Begomovirus terpilih Konstruksi, introduksi gen AV1 pada tanaman model tembakau dan analisis molekuler serta bioasai (Percobaan 4 & 5) TOMAT TAHAN BEGOMOVIRUS Galur F1-TYLCV (+ CMV ) Persilangan untuk mendapatkan galur TYLCV dikombinasikan dg CMV (Percobaan 6) Galur F1-TYLCV Galur F1-CMV TYLCV X Galur tomat rentan Galur tomat rentan X CMV Gambar 1 Diagram alur strategi penelitian dan keterkaitan antar percobaan dari seluruh kegiatan penelitian 8

32 II. TINJAUAN PUSTAKA Famili Geminiviridae Geminivirus merupakan salah satu kelompok virus tanaman terbesar dan penting yang meliputi virus-virus yang menginfeksi sejumlah spesies tanaman baik monokotil atau dikotil. Geminivirus ini secara struktural mempunyai morfologi berupa partikel virion isometrik kembar yang selalu berpasangan (twinned-geminate) yang berukuran sekitar nm dan secara genetik mempunyai sebuah DNA genom yang terdiri dari satu atau dua molekul DNA berutas tunggal (ssdna) yang berbentuk sirkuler (Gutierrez 2000). Taksonomi dari famili Geminiviridae terdiri dari empat genus yaitu Mastrevirus, Curtovirus, Topocuvirus dan Begomovirus (van Regenmortel et al. 1999) yang dibedakan berdasarkan organisasi genetik, tanaman inang dan vektor yang menginfeksi (Gambar 2). Organisasi genetik dari masing-masing genus dari famili Geminiviridae berbeda satu sama lain (Gambar 3). (Ribeiro 2006) Whitefly Gambar 2 Taksonomi dari famili Geminiviridae: tipe spesies, organisasi genom, tanaman inang dan vektor serangganya. BeYDN: Bean yellow dwarf virus, TYDN: Tobacco yellow dwarf virus 9

33 Mastrevirus mempunyai sebuah genom monopartit, terdiri dari sebuah DNA utas tunggal berbentuk sirkuler (circular ssdna) dengan ukuran sekitar 2,6 2,8 kb. Kelompok virus ini biasanya menginfeksi tanaman monokotil dan ditularkan oleh kutu daun (leafhoppers, Hemiptera dari famili Cicadellidae) dengan cara persisten, sirkulatif dan non-propagatif. Genom dari genus ini mengkodekan empat protein: dua pada utas v-sense (movement protein, MP dan capsid protein, CP) dan dua pada utas c-sense (RepA dan Rep). Genus ini banyak ditemukan di Afrika dan termasuk dalam genus ini adalah Maize streak virus (MSV) dan Wheat dwarf virus (Agrios 1997; van Regenmortel et al. 1999; Gutierrez 2000). Curtovirus mempunyai sebuah genom monopartit dan ditularkan oleh kutu daun (leafhopper) dengan cara persisten, sirkulatif dan non-propagatif. Virus ini menginfeksi tanaman dikotil. Protein selubungnya lebih mirip dengan protein selubung dari genus Mastrevirus, akan tetapi ssdna tunggalnya diorganisasi lebih mirip dengan DNA A bipartit dari genus Begomovirus. Di samping menyandikan movement protein (MP) dan coat protein (CP), genom dari genus ini juga menyandikan protein (V2) pada utas v-sense-nya sedangkan empat protein dikodekan pada utas c-sense. Protein-protein tersebut adalah Rep, Rep yang homolog pada genus mastrevirus, protein C2, REn (Replication enhancer protein) dan protein C4. Virus yang termasuk dalam genus ini adalah beet curly top virus (BCTV). Genus ini kebanyakan ditemukan di India, Amerika dan negara-negara Mediterania (van Regenmortel et al. 1999). Genus Topocuvirus sebenarnya hampir mirip dengan Curtovirus dan hanya dibedakan dalam famili vektor yang menularkan. Virus dari genus ini ditularkan oleh treehopper (Hemiptera: Micrutalis malleifera) dan bukan kutu daun dan menginfeksi tanaman dikotil. Hasil penelitian menunjukkan bahwa genus ini merupakan hasil rekombinasi dengan virus lain dari genus yang berbeda (Briddon et al. 1996). Virus dari genus ini pertama kali ditemukan di Florida (Stoner & Hogan 1950). Genom dari virus genus ini adalah berukuran sekitar 2861 nukleotida dan mengkodekan 6 protein yang mirip dengan Curtovirus (Briddon et al. 1996). Hanya satu virus yang termasuk dalam genus ini yaitu Tomato pseudo-curly top virus. 10

34 Gambar 3 Organisasi genom masing-masing genus dari famili Geminiviridae dan serangga vektor utamanya. MSV=Maize streak virus, BCTV=Beet curly top virus, TPCTV=Tomato pseudo-curly top virus, TGMV=Tomato golden mosaic virus, TYLCV=Tomato yellow leaf curl virus 11

35 Genus Begomovirus meliputi virus-virus yang menginfeksi tanaman dikotil. Genus ini terdiri dari virus-virus dengan genom bipartit yang mempunyai gen-gen yang terletak pada dua molekul DNA utas tunggal sirkuler yang berbeda (DNA A dan DNA B dengan ukuran masing-masig 2,6-2,8 kb)) atau monopartit dengan semua gen-nya terletak pada satu DNA utas tunggal sirkuler (2,8 kb). Begomovirus ini ditularkan oleh serangga kutu kebul (whiteflies) dari genus Bemisia dengan sifat penularan persisten, sirkulatif dan non-propagatif. Komponen DNA A dan DNA B mengandung gen-gen yang menyandikan protein pada utas sense virus (v-sense) dan utas sense komplementer (c-sense). Komponen DNA A mengandung satu gen (AV1) pada v-sense dan 3 gen (AC1, AC2, dan AC3) pada c-sense. Pada komponen DNA B mempunyai satu gen (BV1) pada v-sense dan satu gen (BC1) pada c-sense. Produk protein dari gen BV1 ditempatkan pada inti sel dan berfungsi mengikat DNA, sehingga genom virus yang baru dibentuk dapat dipindahkan ke sitoplasma. Produk protein BC1 ditempatkan pada dinding sel dan membran seluler, dan berfungsi untuk meningkatkan kerja eksklusif dari plasmodesmata dalam pergerakan virus dari sel ke sel. Kedua movement protein ini berhubungan dalam penentuan kisaran inang virus, namum hanya gen BC1 yang berperan dalam menentukan keparahan gejala dan patogenisitas pada Begomovirus. Contoh virus yang termasuk kelompok ini adalah Bean golden mosaic virus (BGMV) dan Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) (van Regenmortel et al. 1999). Karakteristik molekuler dari Begomovirus Genom dari Begomovirus dapat berupa monopartite (Mediterania, Amerika Tengah dan Utara, serta sebagian negara di Asia) atau bipartit (Thailand) (Fauquet et al. 2003; Fauquet & Stanley 2003). Genom bipartit Begomovirus terdiri dari 2 komponen ssdna (DNA A dan DNA B) dengan ukuran hampir sama. Urutan nukleotida DNA A dan DNA B adalah cukup berbeda, kecuali untuk common region pendek berukuran sekitar 200 nukleotida yang sangat mirip. Daerah tersebut meliputi sebuah struktur stem-loop yang mengandung nanonukleotida TAATATTAC, yang merupakan sekuen konservatif pada genom 12