VII. ANALISIS MOLEKULER DAN UJI KEEFEKTIFAN GEN AV1 PADA TANAMAN TEMBAKAU TRANSGENIK UNTUK KETAHAHAN TERHADAP BEGOMOVIRUS

Transkripsi

1 VII. ANALISIS MOLEKULER DAN UJI KEEFEKTIFAN GEN AV1 PADA TANAMAN TEMBAKAU TRANSGENIK UNTUK KETAHAHAN TERHADAP BEGOMOVIRUS Abstrak Transformasi genetik tanaman tembakau dengan gen AV1 Begomovirus telah dilakukan pada penelitian sebelumnya dan telah menghasilkan tanaman tembakau transgenik putatif yang membawa gen ketahanan terhadap antibiotik kanamisin. Tujuan penelitian ini adalah 1) untuk memperoleh tanaman tembakau transgenik generasi T0 yang membawa gen AV1 Begomovirus berdasarkan teknik PCR, 2) untuk mendapatkan informasi integrasi dan jumlah kopi gen AV1 pada genom tanaman tembakau transgenik generasi T0 dengan teknik Southern blot dan korelasinya dengan respon ketahanan, 3) memperoleh tanaman tembakau transgenik generasi T0 yang mempunyai ketahanan terhadap Begomovirus. Deteksi gen AV1 dengan PCR pada tanaman tembakau transgenik dilakukan menggunakan primer spesifik untuk gen AV1-Begomovirus. Sedangkan untuk analisis Southern blot dilakukan dengan menggunakan pelacak (probe) untuk gen AV1. Keefektifan gen AV1 pada tanaman tembakau transgenik diuji dengan skrining menggunakan virus target yang diinokulasikan dengan vektor kutu kebul. Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat korelasi yang positif antara keberadaan atau integrasi gen AV1 Begomovirus pada tanaman tembakau transgenik dengan fenotipe ketahanan terhadap infeksi virus. Integrasi gen AV1 yang bersifat kopi tunggal lebih tahan terhadap infeksi virus dibandingkan integrasi gen yang multi-kopi. Ketahanan yang diperoleh dari ekspresi gen AV1 Begomovirus diindikasikan dengan tidak adanya gejala dan akumulasi virus pada jaringan tanaman. Analisis hibridisasi Northern atau Western perlu dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya akumulasi mrna atau protein, sehingga mekanisme ketahanan yang terjadi dapat dijelaskan lebih detail. Kata kunci: Analisis molekuler, teknik PCR, Southern blot, gen AV1- Begomovirus, tembakau transgenik 91

2 Abstract Genetic transformation of tobacco plant using AV1 gene was conducted at the previously experiment and generated transgenic tobacco plants positively carrying the selectable marker nptii gene. The objectives of this experiment were: 1) to analyze the presence of begomovirus AV1 gene in T0 generation putative transgenic tobacco plants using PCR technique with specific primers and its correlation with resistance phenotype, 2) to analyze the integration and copy number of the transgene in T0 generation putative transgenic tobacco plants and its correlation with resistance response, 3) to screen the T0 generation putative transgenic tobacco plants with the target virus infection and to detect the presence of the virus in the transgenic plant tissue using universal primers. PCR detection of AV1 gene in tobacco transgenic was conducted by using specific primer for Begomovirus AV1 gene. Meanwhile, Southern blot analysis was conducted by using a AV1 gene probe. The effectiveness of AV1 gene in tobacco transgenic was tested by inoculation of target virus using Bemisia tabaci vector. Result of the experiments showed that there was a positive correlation between the presence of the AV1 transgene in T0 generation putative transgenic tobacco plants and the resistant phenotype. Transgenic plants with a single copy integration of the transgene exhibited more resistant than the multiple copy one. and non transgenic plant. The resistance phenotype of AV1 gene expression was indicated with no symptom in T0 generation putative transgenic tobacco plants and the accumulation of the virus in the transgenic plants tissue. Northern and Western hybridization analysis need to be perfomed for investigating the presence of mrna or protein accumulation so that the resistance mechanism of the AV1 gene could be explained more detail. Keywords: molecular analysis, PCR technique, Southern blot, Begomovirus AV1 gene, transgenic tobacco 92

3 Pendahuluan Saat ini, penyakit keriting yang berasosiasi dengan infeksi Begomovirus telah menjadi ancaman yang cukup serius pada beberapa komoditas sayuran seperti tomat dan cabai. Penyakit ini telah dilaporkan tersebar di banyak area produksi dua komoditas tersebut yang diindikasikan dengan teridentifikasinya Begomovirus pada area-area tersebut (Aidawati et al. 2005, Hidayat et al. 2006: Santoso et al (belum dipublikasi)). Teknik pengendalian penyakit keriting yang ada pada saat ini dirasakan belum efektif. Di samping karena memerlukan biaya yang mahal, teknik yang ada terkadang tidak ramah terhadap lingkungan dan manusia. Penggunaan varietas tahan merupakan cara pengendalian yang relatif lebih murah dan aman terhadap lingkungan. Namun demikian, sumber gen ketahanan terhadap penyakit keriting belum ditemukan di plasma nutfah baik tanaman tomat maupun cabai. Berdasarkan kenyataan ini, pendekatan bioteknologi dapat membantu di dalam perakitan tanaman yang tahan terhadap penyakit keriting ini. Ada dua pendekatan utama untuk pengembangan ketahanan genetik terhadap virus yang tergantung pada sumber gen yang digunakan (Dasgupta et al. 2003). Gen ketahanan dapat berasal dari virus itu sendiri atau berasal dari sumber yang lain. Pendekatan yang pertama didasarkan pada konsep ketahanan yang berasal dari patogen (pathogen-derived resistance, PDR). Pada pendekatan PDR ini, bagian dari gen atau gen utuh dari virus diintroduksikan ke dalam tanaman, yang selanjutnya akan mempengaruhi satu atau beberapa tahap penting dalam siklus hidup virus. Pemanfaatan gen selubung protein (coat protein gene) merupakan salah satu contoh dari pendekatan PDR ini (Vidya et al. 2000; Sinnisterra et al. 1999; Raj et al. 2005). Pendekatan yang kedua adalah ketahanan yang berasal bukan dari patogen (non pathogen-derived resistance), tetapi didasarkan pada pemanfaatan dari gen-gen ketahanan dari tanaman inang dan gengen lain yang bertanggungjawab untuk adaptasi tanaman inang dan respon terhadap serangan patogen. Penggunaan tipe ketahanan non-pdr, diantaranya oleh Hanson et al. (2000), meskipun tidak sepopuler pendekatan PDR, telah memberikan harapan yang besar untuk mengembangkan ketahanan yang durabel 93

4 (dapat bertahan lama dan berkelanjutan). Di dalam penelitian rekayasa genetik untuk menghasilkan tanaman transgenik biasanya melibatkan beberapa tahap dalam teknik biologi molekuler atau seluler, salah satunya adalah karakterisasi atau identifikasi gen yang telah diintroduksi ke dalam jaringan tanaman (Bennet, 1993). Keberhasilan teknik transformasi genetik ditandai dengan keberhasilan menyisipkan rangkaian gen yang diintroduksikan ke dalam genom tanaman, dapat diekspresikan dan tetap terpelihara dalam seluruh proses pembelahan sel berikutnya. Oleh karena itu, diperlukan upaya untuk mengkonfirmasi integritas gen yang diintroduksikan dan menentukan jumlah kopi gen tersebut di dalam genom tanaman serta menentukan gen tersebut dapat berfungsi dengan benar. Identifikasi jaringan yang tertransformasi dapat dilakukan dengan sejumlah teknik molekuler diantaranya adalah penggunaan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) (Chee et al. 1991; Nain et al. 2005) dan Southern blot (Chee et al. 1991). Teknik PCR merupakan metode deteksi secara cepat untuk mengetahui keberadaan transgen di dalam jaringan tanaman putatif transgenik. Selain itu, teknik Southern Blot juga merupakan teknik yang dapat digunakan untuk mendeteksi integrasi dan jumlah kopi transgen yang terintegrasi. Beberapa penelitian rekayasa genetik untuk mendapatkan tanaman transgenik tahan virus selalu melibatkan teknik molekuler PCR dan hibridisasi Southern untuk mendeteksi transgen yang diintroduksikan (Pascal et al. 1993; Raj et al. 2005). Pada percobaan sebelumnya, transformasi genetik tanaman tembakau dengan gen AV1-Begomovirus melalui vektor A. tumefaciens menghasilkan sekitar 1399 tanaman. Tanaman tembakau transgenik tersebut telah membawa gen ketahanan terhadap antibiotik kanamsin (nptii). Namun demikian, analisis secara molekuler untuk mendeteksi adanya gen AV1 pada tanaman tembakau transgenik putatif dan uji keefektifan dari gen tersebut untuk mendapatkan ketahanan terhadap Begomovirus belum dilakukan. Oleh karena ini, perlu dilakukan analisis molekuler dan uji keefektifan dari gen AV1 terhadap Begomovirus dari tanamantanaman tembakau transgenik putatif tersebut. Tujuan umum penelitian ini adalah untuk mendapatkan tanaman tembakau transgenik T0 yang membawa gen AV1 dan tahan terhadap infeksi Begomovirus. 94

5 Tujuan khusus penelitian adalah i) untuk menganalisis integrasi gen AV1 tanaman tembakau transgenik putatif generasi T0 menggunakan teknik PCR, ii) menentukan jumlah kopi dari transgen yang terintegrasi ke dalam genom tembakau transgenik T0, iii) menguji tanaman tembakau transgenik T0 yang membawa gen AV1 dengan infeksi Begomovirus. Bahan dan Metode Isolasi DNA genom total tanaman tembakau transgenik putatif. Isolasi DNA genom total tanaman temabakau transgenik putatif T0 menggunakan metode yang dikembangkan oleh Doyle & Doyle (1990) yang telah dimodifikasi dengan penambahan 2% polyvinil pyrolidone (PVP). Sebanyak 3 g daun tanaman dilembutkan dan ditambahkan dengan 700 µl bufer ekstraksi (20 mm EDTA, 100 mm Tris-HCl ph 8.0, 1.4 M NaCl, 2% CTAB, 2% PVP, dan 0.2% Mercaptoetanol) dan diinkubasi selama 15 menit pada penangas air 65 0 C. Selanjutnya ditambahkan larutan fenol-kloroform-isoamilalkohol (25:24:1) (v/v/v) sebanyak 700 µl. Tabung dibolak-balik secara hati-hati selama 5 menit. Suspensi disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan rpm. Supernatan diambil dan ditambahkan dengan 1/10x volume 3M Natrium asetat dan 0.7x volume isopropanol dingin dan dibolak-balik perlahan-lahan. Untuk mengendapkan DNA dilakukan sentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan rpm. Endapan DNA dicuci dengan ethanol 70% dan disentrifugasi kembali selama 5 menit pada rpm. Setelah itu pelet DNA dikeringkan dan dilarutkan kembali dengan bufer TE 1x. Suspensi DNA yang sudah larut siap digunakan untuk cetakan dalam proses PCR. Amplifikasi gen AV1 pada tanaman transgenik tembakau dengan PCR Amplifikasi gen AV1 pada genom tanaman tembakau transgenik putatif T0 dilakukan dengan menggunakan primer spesifik untuk gen AV1-Begomovirus. Amplifikasi PCR dilakukan pada volume total reaksi 25 µl yang mengandung 2-5 ul DNA genomik cetakan, dntps dengan konsentrasi 25 µm, sepasang primer spesifik masing-masing dengan konsentrasi 0,2 um, MgCl 2 dengan konsentrasi 95

6 1,5 mm, enzim Taq DNA polymerase 0.15 unit dalam larutan bufer 1X. Setiap reaksi dilakukan pada tabung mikro 200 ul. Reaksi amplifikasi dilakukan dengan program sebagai berikut: denaturasi awal pada suhu 94 0 C selama 5 menit sebanyak 1 siklus, denaturasi pada suhu 94 0 C selama 30 detik, penempelan primer pada suhu 55 0 C selama 1 menit, dan pemanjangan/sintesis DNA pada suhu 72 0 C selama 2 menit. Tahapan PCR diulang sebanyak 35 kali. Pada tahap terakhir proses PCR dilakukan pemanjangan akhir pada suhu 72 0 C selama 5 menit sebanyak 1 siklus. Selain DNA sampel, juga digunakan DNA plasmid pbi-cp sebagai kontrol positif (+) dan DNA tanaman tembakau non transgenik serta air (tanpa DNA cetakan) masing-masing digunakan sebagai kontrol negatif (-). Setelah proses PCR selesai, sampel produk PCR dielektroforesis dengan gel agarosa. Analisis Southern Blot untuk menentukan jumlah kopi transgen Analisis Southern Blot dilakukan sesuai dengan prosedur dari Panaud et al. (1993). DNA genom total yang diisolasi dari tanaman transgenik, dipotong dengan enzim restriksi HindIII kemudian dipisahkan dalam gel agarosa dan dipindah ke membran nylon Hybond N+. Proses hibridisasi dilakukan dengan menggunakan pelacak gen AV1 yang telah dilabel dengan pelabel non radioaktif dig-11-utp. Membran kemudian divisualisasi dengan pewarnaan NBT-BCIP. Bioasai tanaman transgenik dengan menginfeksi Begomovirus Tanaman tembakau transgenik putatif generasi T0 yang ditanam pada polibag dipindahkan ke kurungan kedap serangga untuk penularan Begomovirus menggunakan isolat Segunung. Virus ditularkan ke tanaman melalui vektor serangga kutu kebul (Bemisia tabaci). Sebelumnya di dalam kurungan telah ditempatkan tanaman sumber inokulum (tanaman yang telah terinfeksi oleh Begomovirus) yang sudah diinfestasi dengan serangga kutu kebul. Tanaman tembakau dibiarkan selama 3-7 hari agar kutu kebul dapat menularkan virus ke tanaman tersebut. Setelah itu tanaman dikeluarkan dan dihilangkan kutu kebulnya dengan aplikasi insektisida. Selanjutnya tanaman tembakau dipindahkan ke rumah kaca dan diamati gejala yang muncul pada 2 minggu setelah inokulasi. 96

7 Pengamatan gejala tanaman tembakau terinfeksi oleh begomovirus dilakukan dengan kategori: (-) tidak terinfeksi, tidak ada gejala yang muncul dan (+) terinfeksi, muncul gejala pada tanaman yang diindikasikan dengan adanya mosaik atau penggulungan daun seperti kerupuk. Untuk mengetahui keberadaan Begomovirus dalam tanaman tembakau yang telah dibioasai, maka dikonfirmasi dengan teknik PCR menggunakan primer universal. Isolasi DNA total tanaman yang terinfeksi virus dilakukan dengan menggunakan metode yang dikembangkan oleh Doyle & Doyle (1990) seperti yang telah dilakukan sebelumnya. Amplifikasi PCR untuk mendeteksi adanya Begomovirus dilakukan sesuai dengan prosedur dari Rojas et al. (1993). dengan total reaksi 25 µl mengandung 2-5 ul DNA genomik cetakan dan sepasang primer universal yaitu primer PAL1v1978 dan PAR1c715. Keberadaan Begomovirus dalam jaringan tanaman tembakau transgenik setelah bioasai diindikasikan dengan teramplifikasinya fragmen DNA berukuran 1500 bp. Hasil Analisis PCR untuk mendeteksi gen AV1 Analisis molekuler menggunakan teknik PCR dengan primer spesifik gen AV1 dilakukan untuk mendeteksi keberadaan gen yang diinginkan di dalam jaringan tanaman yang ditransformasi. Di samping digunakan untuk mendeteksi keberadaan transgen, analisis PCR juga dapat digunakan untuk skrining awal secara cepat terhadap tanaman hasil transformasi yang membawa transgen. Hasil analisis PCR pada 46 tanaman tembakau transgenik putatif generasi T0 menggunakan primer spesifik gen AV1 menunjukkan bahwa terdapat 35 tanaman yang mengandung gen AV1 (Gambar 24). Hal tersebut diindikasikan dengan terbentuknya pita DNA berukuran 780 bp. Persentase tanaman yang positif PCR (mengandung gen AV1) dibandingkan dengan tanaman yang dianalisis adalah sebesar 76,1%. Pada kedua kontrol negatif yang digunakan (tanaman tembakau yang tidak ditransformasi dan air) tidak menunjukkan adanya pita tersebut. 97

8 K- A P M Gen AV1 (780 bp) 1000 bp K- A P M Gen AV1 (780 bp) 1000 bp K- A P M Gen AV1 (780 bp) 1000 bp K- A P M Gen AV1 (780 bp) 1000 bp Gambar 24 Deteksi PCR gen AV1 pada 46 tanaman tembakau transgenik putatif generasi T0 menggunakan primer spesifik. 1-46=sampel tanaman tembakau transgenik putatif generasi T0, K-=tanaman tembakau non transforman, A=Air, P=Plasmid, M=1 Kb plus ladder (In vitrogen) Bioasai tanaman tembakau transgenik dengan Begomovirus Bioasai dilakukan terhadap 46 tanaman transgenik putatif generasi T0 dengan menginokulasi tanaman-tanaman tersebut dengan Begomovirus menggunakan vektor serangga kutu kebul (Gambar 25). Bioasai dari 46 tanaman 98

9 transgenik putatif generasi T0 dengan Begomovirus di rumah kaca menunjukkan adanya variasi respon setelah inokulasi (Tabel 8). Sebanyak 15 tanaman tembakau transgenik putatif positif menunjukkan gejala terinfeksi Begomovirus dan ada 2 tanaman yang mati sebelum dilakukan pengamatan. Untuk melihat korelasi hasil bioasai dengan hasil PCR dari masing-masing individu tanaman tembakau transgenik putatif maka kedua hasil pengujian dibandingkan. Terdapat kecenderungan bahwa tanaman tembakau yang positif PCR tidak menunjukkan adanya gejala terinfeksi Begomovirus (Tabel 8). Tabel 8 Deteksi PCR gen AV1 dan bioasai tanaman tembakau transgenik putatif generasi T0 dengan Begomovirus di rumah kaca No. Kode tanaman Hasil Hasil Hasil Hasil No. Kode tanaman PCR* bioasai** PCR* Bioasai** 1. CP8/II CP8/II CP11/I CP8/II CP11/I A CP8/II CP11/I B - mati*** 30. CP8/II CP11/I CP8/II CP11/I CP8/II CP11/I CP8/II CP11/I CP8/II CP11/I CP8/II CP8/II CP8/II CP8/II CP8/II CP8/II CP8/II.1.5.x CP8/II mati*** 39. CP8/III CP8/II CP8/III CP8/III CP8/III CP8/III CP8/III CP8/III CP8/III CP8/III CP8/III CP8/III CP11/IV CP8/III CP11/IV CP11/I Kontrol CP11/I Kontrol CP11/I Kontrol CP11/I Kontrol CP11/I Kontrol CP11/I * Hasil PCR: (+)=menghasilkan fragmen DNA berukuran 780 bp, ( )=tidak menghasilkan ** Hasil bioasai: (+)=muncul gejala terinfeksi Begomovirus, ( )=tidak muncul gejala *** mati=tanaman mati sebelum dilakukan pengamatan 99

10 Proses penularan virus dilakukan dengan menempatkan sampel tanaman ke dalam suatu kurungan yang di dalamnya sudah ada tanaman yang sakit terinfeksi virus dan serangga kutukebul sebagai vektor untuk menularkan (Gambar 25a dan 25b). Indikasi tanaman tembakau yang terinfeksi oleh begomovirus adalah munculnya gejala yang diawali dengan mosaik pada daun dan selanjutnya helaian daun akan menggulung, bergelombang tidak beraturan seperti bentuk kerupuk (Gambar 25c-f). a ba Tahan c d e f Rentan Gambar 25 Bioasai tanaman tembakau transgenik menggunakan vektor serangga kutukebul: a) Proses penularan virus oleh vektor kutu kebul pada kurungan kedap serangga, b) Kutu kebul yang menempel pada daun tanaman untuk menularkan virus (tanda panah), c) Gejala yang mulai muncul pada daun muda setelah inokulasi virus (2 minggu setelah inokulasi), d) Penampilan tanaman tembakau yang tahan dan rentan setelah inokulasi virus, e) dan f) Gejala infeksi virus pada daun tembakau yang menyerupai sepeti kerupuk 100

11 Tabel 9 Kategori respon tanaman tembakau transgenik putatif setelah dianalisis PCR dan bioasai Kategori Analisis PCR* Bioasai ** Jumlah tanaman Kontrol * Hasil PCR: (+)=menghasilkan fragmen DNA berukuran 780 bp, (-)=tidak menghasilkan ** Bioasai: (+)=menunjukkan gejala terinfeksi Begomovirus, (-)=tidak menunjukkan Berdasarkan hasil analisis PCR dan bioasai, respon tanaman tembakau transgenik putatif generasi T0 dapat dibedakan menjadi empat kategori (Tabel 9). Kategori 1 adalah respon tanaman yang tidak menunjukkan gejala (28 tanaman) dan positif PCR, kategori 2 adalah respon tanaman yang menunjukkan gejala dan positif PCR (7 tanaman), kategori 3 adalah respon tanaman yang menunjukkan gejala dan negatif PCR (8 tanaman), dan kategori 4 adalah respon tanaman yang tidak menunjukkan gejala dan negatif PCR (2 tanaman). Pada kontrol, semuanya menunjukkan gejala dan negatif PCR (5 tanaman). Analisis Southern Blot dan Konfirmasi Keberadaan Virus Teknik Southern blot digunakan untuk mengetahui keberadaan atau integrasi dari transgen yang diintroduksikan, dan juga digunakan untuk menentukan jumlah kopi dari transgen yang terintegrasi ke dalam genom tanaman tembakau. Hasil analisis Southern blot pada tanaman transgenik tembakau menggunakan pelacak gen AV1 menunjukkan bahwa dari 11 tanaman transgenik putatif generasi T0 yang diuji, diperoleh 5 tanaman yang menunjukkan integrasi gen dengan kopi tunggal dan 6 tanaman mempunyai integrasi gen lebih dari satu kopi atau multi kopi (Gambar 26). Lima tanaman tembakau transgenik yang mempunyai kopi tunggal adalah tanaman no. 2, 24, 27, 32 dan 35, sedangkan 6 tanaman dengan integrasi multi-kopi adalah tanaman no. 21, 23, 26, 34, 45 dan 46. Dua tanaman tembakau hasil transformasi generasi T0 yang negatif ketika dilakukan analisis PCR (tanaman no. 10 dan 20) juga disertakan dalam analisis Southern Blot. Kedua tanaman tersebut juga tidak menunjukkan adanya pita DNA 101

12 setelah hibridisasi dengan pelacak gen AV1. Demikian juga dengan dua tanaman yang tidak ditransformasi (NT), pita DNA tidak dihasilkan. Untuk kontrol positif (P) berupa plasmid yang mengandung gen AV1, menghasilkan satu pita DNA. Hasil deteksi keberadaan Begomovirus dengan teknik PCR pada beberapa sampel tanaman tembakau transgenik menggunakan primer universal menunjukkan pita DNA spesifik (Gambar 27). Virus terdeteksi pada enam tanaman yaitu sampel tanaman no 21, 23, 26, 34, 35 dan 45. Sedangkan pada tanaman no. 2, 24, 27, 32, dan 46, virus tidak berhasil terdeteksi. Sebagai kontrol disertakan tiga tanaman yang terdiri dari tanaman yang tidak ditransformasi, tetapi diinfeksi dengan virus (NT-I), tanaman yang tidak ditansformasi tetapi tidak diinfeksi oleh virus (NT-NI) dan tanaman yang terinfeksi oleh Begomovirus (K+). Dari ketiga tanaman kontrol, tanaman NT-I terdeteksi adanya virus di dalam jaringan tanaman. Pada tanaman NT-NI tidak terdeteksi adanya virus di dalam jaringan sementara untuk tanaman K+ terdeteksi dengan jelas. 12,0 kb 4,0 3,0 2,0 1,6 1,0 12,0 kb 4,0 3,0 2,0 1,6 1,0 M M NT NT P A NT NT P B Gambar 26 Analisis hibridisasi Southern Blot pada sampel tanaman tembakau trasngenik putatif generasi T0 yang positif PCR dan 2 tanaman yang negatif PCR (no.10 & 20) dengan pelacak gen AV1. NT=tanaman non transformasi, P=Plasmid dan M=1 Kb plus ladder. A. Hasil analisis Southern blot yang asli, B. Hasil analisis Southern blot replika 102

13 Dari data analisis PCR, bioasai, Southern blot dan keberadaan virus dari tanaman-tanaman tembakau transgenik generasi T0 maka dapat ditentukan hubungan antara data-data dari keempat parameter tersebut (Tabel 10). Dari hubungan antar parameter ini maka akan dapat ditentukan tingkat ketahanan tanaman tembakau transgenik generasi T0 terhadap infeksi Begomovirus NT-I NT-NI K+ A M 1500 bp 4000 bp Gambar 27 Deteksi keberadaan begomovirus dengan teknik PCR menggunakan primer universal pada tanaman tembakau transgenik generasi T0 setelah bioasai. Sampel tanaman diindikasikan dengan nomor. NT- I=Tanaman non transgenik yang diinokulasi virus, NT-NI=Tanaman non transgenik yang tidak diinokulasi, K+=Tanaman terinfeksi virus, A=Air dan M=1 Kb ladder (In vitrogen). Tabel 10 Hubungan antara analisis PCR, bioasai, jumlah kopi dan keberadaan virus target dalam tanaman transgenik No. Kode tanaman PCR* Bioasai** Jumlah kopi Ada/tidaknya virus*** Kategori 1. 2 (CP11/I.2.1.3) (satu) - Tahan (CP11/I.2.1.1) (tiga) + Rentan (CP11/I.2.2.2) (dua) + Rentan (CP11/I.3.4.1) (satu) - Tahan (CP11/I.6.3.1) (empat) + Rentan (CP8/II.1.3.1) (satu) - Tahan (CP8/II.5.1.1) (satu) - Tahan (CP8/II ) (dua) + Rentan (CP8/II ) (satu) + Toleran (CP11/IV.5.1.1) (dua) + Toleran (CP11/IV.9.1.1) (empat) - Rentan * PCR: (+)=menghasilkan fragmen DNA berukuran 780 bp, (-)=tidak menghasilkan ** Bioasai: (+)=menunjukkan gejala terinfeksi Begomovirus, (-)=tidak menunjukkan *** Ada/tidaknya virus: (+)=menghasilkan fragmen DNA spesifik berukuran 1500 bp, (-)=tidak menghasilkan fragmen DNA 103

14 Pembahasan Untuk mempelajari ekspresi gen AV1 yang menyandikan protein selubung di dalam hubungannya dengan ketahanan terhadap penyakit keriting daun yang disebabkan oleh infeksi Begomovirus maka gen AV1 diintroduksikan ke dalam genom tanaman tembakau yang bertindak sebagai tanaman model. Informasi mengenai integrasi dan jumlah kopi serta uji ekspresi gen AV1 pada tanaman model ini diharapkan akan diketahui keefektifan gen tersebut untuk mengendalikan penyakit keriting daun yang disebabkan oleh infeksi virus sehingga gen tersebut dapat digunakan untuk pengembangan varietas tomat atau cabai yang tahan terhadap Begomovirus. Pemanfaatan gen-gen virus untuk mendapatkan sifat ketahanan telah dilakukan oleh beberapa peneliti, diantaranya adalah gen BL1 dari Begomovirus bipartite yang menyandikan movement protein (Pascal et al. 2003), gen AV2 dari Begomovirus monopartit yang menyandikan movement protein (Mubin et al. 2007), gen CP dari Tobamovirus (Bendahmane et al. 1997). Analisis PCR untuk mengidentifikasi transgen menggunakan primer spesifik gen AV1 terhadap 46 tanaman transgenik putatif tembakau T0 menunjukkan bahwa diperoleh sebanyak 35 tanaman yang positif mengandung gen AV1 yang diindikasikan oleh teramplifikasinya fragmen DNA berukuran 780 bp (Gambar 24). Ini berarti bahwa dari 46 calon tanaman tembakau transgenik yang lolos seleksi dengan antibiotik kanamisin 100 mg/l tidak semuanya mengandung gen AV1. Jadi, sebanyak 11 tanaman bukan merupakan tanaman transgenik namun tanaman yang escape atau terhindar dari faktor seleksi kanamisin selama proses regenerasi secara in vitro. Skrining dengan Begomovirus menunjukkan adanya korelasi yang positif antara keberadaan gen AV1 dalam tanaman dengan respon ketahanan meskipun korelasi tersebut tidak menunjukkan angka 100%. Tanaman tembakau transgenik yang positif PCR (membawa gen AV1) sebagian besar memberikan respon tahan ketika tanaman-tanaman tersebut diinokulasi dengan Begomovirus dibandingkan dengan tanaman yang bukan transgenik. Dari 35 tanaman yang positif PCR diperoleh 28 tanaman tidak menunjukkan gejala terinfeksi oleh Begomovirus (Tabel 8). Tujuh tanaman yang positif PCR namun menunjukkan adanya gejala 104

15 diduga disebabkan oleh tidak efektifnya gen AV1 yang telah terintegrasi ke dalam genom tanaman dan disebut dengan istilah pembungkaman gen (gene silencing). Pada penelitian ini juga diamati adanya tanaman-tanaman yang tidak membawa gen AV1 (analisis PCR-nya negatif) menunjukkan gejala ketika terinfeksi oleh virus. Namun, terdapat 3 tanaman yang tidak positif PCR memberikan respon negatif yaitu tidak terdeteksi adanya gejala terinfeksi virus. Hal ini diduga disebabkan oleh tidak terjadinya proses penularan virus oleh serangga kutukebul pada ketiga tanaman tersebut. Salah satu kelemahan teknik bioasai dalam penelitian ini adalah proses penularan virus sangat tergantung dari mobilitas serangga kutukebul yang diinfestasikan, sehingga kemungkinan tidak terjadinya proses infeksi virus oleh kutukebul atau escape bisa terjadi. Analisis jumlah kopi dengan teknik Southern blot mengindikasikan bahwa integrasi gen AV1 menggunakan vektor A. tumefaciens pada tanaman tembakau dapat terjadi hanya satu kopi atau lebih (Gambar 26). Korelasi jumlah kopi gen AV1 dengan respon gejala mengindikasikan bahwa tanaman dengan integrasi gen hanya satu kopi mempunyai respon tidak menunjukkan gejala ketika diinokulasi virus. Hasil ini didukung oleh analisis deteksi keberadaan virus dengan PCR pada tanaman-tanaman tersebut dimana tidak terdeteksi adanya fragmen DNA spesifik dari Begomovirus, sehingga dikateorikan sebagai tanaman tahan (Gambar 27, Tabel 10). Sebaliknya, tanaman dengan integrasi gen AV1 lebih dari satu kopi menunjukkan adanya gejala terinfeksi virus dan didukung oleh terdeteksinya Begomovirus dalam tanaman sehingga dikategorikan rentan (Gambar 27, Tabel 10). Jumlah kopi gen lebih dari satu diduga akan menginduksi terjadinya pembungkaman gen (gene silencing) sehingga transgen menjadi tidak terkespresi dan tanaman menjadi tidak tahan serta virus dapat berkembang di dalam tanaman. Pembungkaman gen yang disebabkan oleh adanya transgen multikopi kemungkinan berhubungan dengan fenomena homology-dependent gene silencing dimana tidak terkespresinya satu atau lebih gen karena adanya kesamaan susunan nukleotida (homologi) (Meyer & Saedler 1996). Namun demikian, dugaan ini mungkin tidak terjadi pada sampel no 46 dimana tanaman mempunyai gen sebanyak 4 kopi namun tidak memperlihatkan respon gejala dan tidak ditemukan adanya virus di dalam jaringan tanaman. Kemungkinan ada mekanisme lain pada 105

16 tanaman tersebut sehingga tanaman menjadi tahan meskipun integrasinya lebih dari satu. Pada penelitian ini juga diamati adanya sampel tanaman (nomor 45) dengan integrasi gen AV1 multikopi (2 kopi gen) dan tidak menunjukkan gejala namun terdeteksi adanya virus di dalam jaringan tanaman tersebut. Hal ini diduga berhubungan dengan adanya respon toleran atau penyembuhan (recovery) dari tanaman tersebut. Gen-gen protein selubung dari virus telah dimanfaatkan secara luas di dalam teknik rekayasa genetik untuk perakitan tanaman tahan virus dengan genom RNA (Bendahmane et al. 1997; Chowrira et al. 1998; Srivastava & Raj 2008). Penelitian untuk memperoleh ketahanan terhadap Begomovirus menggunakan gen protein selubung juga telah dilakukan (Kunik et al. 1994) dan hasil penelitian menunjukkan bahwa ketahanan terhadap TYLCV berasosiasi dengan keberadaan dari produk transgen tersebut. Ketahanan yang diperoleh diindikasikan dengan tidak adanya keparahan gejala dan akumulasi virus pada jaringan tanaman. Pada penelitian ini, tanaman tembakau transgenik yang tahan Begomovirus mengindikasikan adanya fenomena yang sama seperti penelitian sebelumnya. Gen protein selubung yang digunakan dalam penelitian ini merupakan gen yang dikonstruksi secara utuh (full-length). Berdasarkan pola hubungan antara analisis PCR, bioasai, jumlah kopi dan keberadaan virus di dalam jaringan tanaman terlihat bahwa tanaman tembakau transgenik yang mengandung gen AV1 yang terintegrasi satu kopi memperlihatkan respon tahan yang diindikasikan dengan tidak adanya gejala yang terdeteksi dan akumulasi virus pada jaringan. Hal ini berbeda dengan ketahanan mendasarkan pada RNA (RNA-mediated resistance) dimana ketahanan ini sering berasosiasi dengan adanya integrasi multi-kopi dari transgen atau pengulangan tandem dari transgen (Sijen et al. 1996). Berdasarkan hal ini maka mekanisme ketahanan pada penelitian ini diduga bukan ketahanan yang mendasarkan pada RNA namun berasosiasi dengan keberadaan produk dari gen AV1. Jadi gen AV1 terintegrasi ke dalam genom tanaman tembakau dan mengekspresikan protein selubung (terbentuk produk protein) yang mempengaruhi siklus hidup dari virus dan tanaman memberikan respon ketahanan. Dengan kata lain bahwa gen AV1 terekspresi ke dalam tanaman dan terjadi akumulasi protein pembungkus sehingga ketika terjadi infeksi, virus akan 106

17 dibungkus oleh protein pembungkus tersebut dan virus tidak dapat berkembang. Mekanisme ketahanan ini berperan pada tingkat awal proses replikasi virus dengan menghalangi proses replikasi secara tidak terkendali dari partikel virus (Aswidinnoor 1995). Namun demikian, mekanisme ketahanan ini masih perlu dibuktikan lebih lanjut dengan melakukan analisis hibridisasi Northern atau Western untuk mempelajari ada tidaknya akumulasi mrna atau protein, sehingga mekanisme ketahanan yang terjadi dapat dijelaskan lebih detail. Simpulan 1. Telah diperoleh tanaman-tanaman tembakau transgenik yang membawa gen AV1 Begomovirus berdasarkan amplifikasi PCR 2. Analisis hibridisasi Southern blot menunjukkan bahwa integrasi gen AV1 pada genom tanaman tembakau yang bersifat satu kopi atau multi-kopi. Tanaman dengan integrasi gen satu kopi menunjukkan respon tahan terhadap infeksi virus dibandingkan integrasi gen yang multi-kopi. 3. Ketahanan yang diperoleh dari ekspresi gen AV1 Begomovirus pada tanaman tembakau transgenik diindikasikan dengan tidak adanya gejala dan akumulasi virus pada jaringan tanaman. Daftar Pustaka Aidawati N, Hidayat SH, Suseno R, Hidayat P, Sujiprihati S Identifikasi geminivirus yang menginfeksi tomat berdasarkan pada teknik Polymerase Chain Raction-Restriction Fragment Length Polymorphism. J Mikrobiol Indones 10:29-32 Aswidinnoor, H Transformasi gen: sumber baru keragaman genetik dalam pemuliaan tanaman. Zuriat. Vol. 6. No. 2: Bendahmane M, Fitchen JH, Zhang G, Beachy RN Studies of coat protein- Mediated Resistance to tobacco mosaic Tobamovirus: Correlation between assembly of mutant coat proteins and resistance. J Virol 71(10): Bennet J Genes for crop improvements. Genet. Eng. 16 : Chee PP, Drong RF, Slightom Using polymerase chain reaction to identify transgenic plant. Plant Mol Biol Manual C3:1-28 Chowrira GM, Cavileer TD, Gupta SK,Lurquin PF, Berger PH. Coat proteinmediated resistance to pea enation mosaic virus in transgenic Pisum sativum L. Transg Res 7:

18 Doyle JJ, Doyle JL Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12: Dasgupta I, Malathi VG, Mukherjee Genetic engineering for virus resistance. Current Scim 8(3): Hidayat SH, Chatchawankanpanich O, Rusli E, Aidawati N Begomovirus associated with pepper yellow leaf curl disease in west Java, Indonesia. J Indon Microbiol 11 (2): Kunik T, Salomon R, Zamair D, Zeidan M, Michelson L, Gafni Y, Czosnek H Transgenic tomato plants expressing the tomato yellow leaf curl virus capsid protein are resistant to the virus. Bio/Tech 12: Meyer P, Saedler H Homology-dependent gene silencing in plants. Ann Rev Plant Physiol Mol Biol. 47:23-48 Mubin M, Mansoor S, Hussain M, Zafar Y Silencing of the AV1 gene by antisense RNA protects transgenic plants against a bipartite begomovirus. Virol J 4(10):1-4 Nain V, Jaiswal R, Dalal M, Ramesh B, Kumar PA Polymerase Chain Reaction Analysis of Transgenic contaminated by Agrobacterium. Plant Mol Biol Rep 23:59-65 Panaud O, Magpantay G, McCouch SR A protocol for non-radioactive DNA labelling and detection in the RFLP analysis of rice and tomatoes using single copy probes. Plant Mol Biol. 11(1) Pascal E, Goodlove PE, Wu LC, Lazarowitz Transgenic tobacco plants expressing the Geminivirus BL1 protein exhibit symptoms of viral disease. Plant Cell 5: Raj SK, Singh R, Pandey SK and Singh BP Agrobacterium-mediated tomato transformation and regeneration of transgenic lines expressing Tomato leaf curl virus coat protein gene for resistance against TLCV infection. Current Sci 88 (10): Rojas MR, Gilbertson RL, Russel DR, Maxwell DP Use of degenerate primers in the polymerase chain reaction to detect whitefly-transmitted geminivirus. Plant Dis 77: Sinisterra XH, Polston JE, Abourized AM, Hiebert E Tobacco plants transformed with a modified coat protein of tomato mottle Begomovirus show resistance to virus infection. Phytopathol 89: Srivastava A, Raj SK Coat protein-mediated resistance against an Indian isolates of the Cucumber mosaic virus subgroup IB in Nicotiana benthamiana. J Biosci 33:00-00 Vidya CSS, Manoharan M, Kumar CTR, Savithri HS, Sita GL Agrobacterium-mediated transformation of tomato (Lycopersicon esculentum var. Pusa Ruby) with coat protein gene of Physalis mottle tymovirus. J Plant Physiol 156: