27 BAB III BAHAN, ALAT DAN METODE 3.1 Bahan Indometasin ( Kunze Indopharm ) Indometasin pembanding ( PPOM ) /3-siklodekstrin ( Roquette ) Natrium nitrit P.g. ( E. Merk ) Kalium dihidrogen fosfat P.a. 1( E. Merk ) Etanol 95 % P.a. 1C E. Merk ) Etil eter p.a. ( E. Merk ) Kloroform p.a. ( E. Merk ) Aseton p.a. ( E. Merk ) Larutan ammonia 28 % p.a. ( E. Merk ) Natrium hidroksida p.a. ( E. Merk > Tembaga sulfat P.g. ( E. Merk ) Etil asetat p.a. < E. Merk ) Asam klorida p.a. ( E. Merk > Asam sulfat P.g. ( E. Merk ) Lempeng silika gel GF tebal 0,250 mm 3.2 AIat-alat Spektrofotometer UV-VIS merk Shimad2U type UV-160A dan type UV-140-02 Infra Red Spectrophotometer (IR) merk Shimadzu type IR-435-V-04
Differential Thermal Analyser (DTA) merk Shimadzu type DT-30 Hot Plate Stirrer merk Corning type PC-351 Millipore Membrane Filter 0,45 micron Freeze Dryer type FD-A dari Mitamura Riken Kogyo Inc Timbangan analitik merk CHYO type JP 160 Ayakan 80/100 USP standart Eksikator Hampa Alat uji disolusi merk Erweka type DT 3.3 Metode 3.3.1. Pemeriksaan kualitatif bahan penelitiaan a. Indometasin i. Pemeriksaan organoleptis Pada pemeriksaan secara organoleptis, -indometasin diperiksa bentuk, warna, rasa, bau. Hasil pengamatan dibandingkan data dan dari pustaka (10 ). ii. Reaksi warna Larutkan 100 mg indometasin dalam 100 ml air yang mengandung 0,5 ml larutan Natrium hidroksida P 5% b/v. Pada 1 ml larutan tersebut diatas tambahkan 1 ml larutan natrium nitrit P 0,1% b/v, biarkan selama 5 menit, tambah 0,5 asam sulfat P sehingga terbentuk warna kuning tua. Pada 1 ml lainnya tambahkan larutan Hatriua nitrit P 0,1% b/v,
29 biarkan selama 5 menit, tambahkan 0,5 ml asam klorida pekat sehingga terjadi warna hijau (10). iii. Analisa termal DTA Analisa termal dilakukan terhadap substansi indometasin dan indometasin pembanding dengan menggunakan alat "Differential Thermal Analyser". Pemeriksaan ini dilakukan dengan cara: 6 mg sampel dimasukkan ke "sample pan", lalu ditutup. Sel sampel "S" dan kosong "R" diletakkan pada "sample holder", kemudian alat dipanaskan. Perubahan sampel selama pemanasan direkam. iv. Pemeriksaan spektrum infra merah Pemeriksaan spektrum infra merah ini dilakukan terhadap substansi indometasin dan indometasin pembanding dari PPOM. Analisa ini dilakukan dengan cara 1 mg sampel digerus halus, kemudian ditambahkan 100 mg serbuk KBr kering, digerus dalam mortir. Campuran ditekan dengan alat penekan hidrolik khusus, sehingga terbentuk lempeng bulat dan tipis yang tembus sinar. Lempeng ini dianalisa dangan " Infra Red
30 Spectrophotometer. Kemudian diamati spektrum IR dari sampel (25). b. /3-siklodekstrin i. Pemeriksaan organoleptis Secara organoleptis, ^-siklodekstrin diperiksa bentuk,warna, rasa dan baunya. Hasil dibandingkan dengan data dari pustaka (19). ii. Reaksi warna Pada larutan sampel ditambahkan HC1 pekat kemudian dipanaskan pada penangas air. Lalu ditambahkan 5 ml reagent Fehling, sehingga terjadi endapan merah (18). iii. Analisa termal DTA. Dengan menggunakan alat "Differential Thermal Analyser ". Hasil analisa termal dapat dibandingkan dengan data dari pustaka (19). 3.3.2. Pengaruh /?-si klodekstrin terhadap panjang gelombang maksimun indometasin a. Pembuatan larutan baku induk indometasin Ditimbang teliti 50 mg Indometasin, dilarutkan dengan 50 ml etanol 952, kemudian larutan diencerkan dengan air suling hingga 500 ml.
31 b. Pembuatan iarutan baku kerja indometasin Larutan baku kerja Indometasin dibuat dengan cara mengencerkan larutan baku induk hingga volume tertentu. Dibuat larutan baku kerja dengan konsentrasi 8 mg/1, '10 mg/1, c. Penentuan panjang gelombang maksimun Penentuan panjang gelombang maksimum menggunakan alat spektrofotometer UV-VIS.- Panjang gelombang maksimum ditentukan dengan menggunakan baku kerja 8 mg/1 dan 10 mg/1 yang diukur absorpsinya pada panjang gelombang antara 200-500 nm. d. Pengaruh ^siklodekstrin terhadap peneiapan kadar indometasin secara spektrofotometri UV-VIS Pengaruh 3-siklodekstr in terhadap panjang gelombang maksimum dan penetapan kadar indometasin secara spektrofotometri UV-VIS ditentukan dengan cara mengamati panjang gelombang maksimum dan absorbsi larutan baku indometasin 10 mg/1 pada berbagai konsentrasi ^-siklodesktrin. Nilai panjang gelombang maksimum dan absorbsi yang diperoleh, dibandingkan dangan nilai panjang gelombang maksimum dan absorbsi indometasin yang tidak mengandung (S-siklodesktrin.
32 3.3.3. Pembuatan senyawa inklusi indometasin /"J-siklodekstrin dengan metode " freeze drying M Pada pembuatan senyawa inklusi dengan metode "freeze drying" menggunakan perbandingan molar indometasin dan /^-siklodekstrin 1 : 1. Metode ini dibuat dengan cara : Indometasin dan /3-siklodekstr in dicampur, kemudian dilarutkan dalam sejumlah aqua dan ditambah 7 tetes larutan ammonia 28%. Larutan ini dibeku keringkan, kemudian dikeringkan pada suhu 50 C, dan dicuci dengan etil eter. Eesidu dipisahkan dengan larutannya dan dikeringkan dalam eksikator hampa pada suhu kamar. (6). 3.3.4. Pembuatan senyawa inklusi indometasin - ftsiklodekstrin dengan metode pengulian " kneading " Pada pembuatan senyawa inklusi dengan metode pengulian menggunakan perbandingan molar antara indometasin - /3-siklodekstr in = 1 : 1 Metode ini dibuat dengan cara : Indometasin dan ft siklodekstrin dicampur dalam mortir kemudian ditambah sejumlah air sampai terbentuk pasta dan diuli selama lebih kurang 40 menit. Campuran ini kemudian dikeringkan, dicuci dengan etil eter dan dikeringkan lagi (7).
3.3.5. Pembuatan campuran fisik indometasin - ft siklodekstrin 33 Indometasin dalain jumlah tertentu dimasukkan mortir kemudian ditambahkan /9-siklodekstrin dalam jumlah yang sesuai dengan komposisi, kemudian dicampur sarapai homogen dan akhirnya dimasukkan dalam eksikator hampa. 3.3.6 Analisa kromatografi lapis tipis Sejumlah sampel senyawa inklusi dilarutkan dalam etanol 95%, kemudian ditotolkan pada silika gel GF setebal 0,25 mm, dan dieluasi lempeng dengan fase gerak kloroform ; aseton = 1 : 4 dan fase gerak kloroform : asam asetat = 9 5 : 5. Noda yang diperoleh dilihat dengan sinar UV. Kemudian dibandingkan harga Rf senyawa inklusi indometasin -ft- siklodekstrin dengan substansi indometasin. 3.3.7. Analisa termal DTA Senyawa inklusi yang telah dibuat ditentukan titik leleh dan kurva endotermiknya dengan DTA. Sebagai pembanding digunakan indometasin bebas, /?-siklodetrin bebas, dan campuran fisik indometasin - ^-siklodekstrin. Percobaan ini dilakukan dengan cara : 6 mg sampel dimasukkan ke "sample pan", lalu ditutup. Sel sampel "S" dan kosong "R" diletakkan
35 3.3.9.2. Pembuatan larutan baku induk indometasin dalam media disolusi Ditimbang teliti 50 mg Indometasin, dilarutkan dengan 50 ml etanol 95%, kemudian larutan diencerkan dengan media disolusi hingga 500 ml. 3.3.9.3. Pembuatan larutan baku kerja indometasin dalam media disolusj Larutan baku kerja Indometasin dibuat dengan caru. mengencerkan larutan baku induk hingga volume tertentu. Dibuat larutan baku kerja ddengan konsentrasi 1 mg/1, 2 mg/1, 3 mg/1, 4 mg/1, 6 mg/1, 8mg/l, 10 mg/1. 3.3.9.4. Penentusm panjang gelombang maksimum Panjang gelombang maksimun ditentukan dengan menggunakan baku kerja 8 mg/1 dan 10 mg/1 yang diukur absorsinya pada panjang gelombang antara 200-500 nm. 3.3.9.5. Pembuatan kurva baku indometasin Diamati absorbsi pada berbagai larutan baku indometasin, pada panjang konsentrasi gelombang maksimum. Sebagai blanko digunakan media disolusi larutan dapar fosfat ph 7,2. Dari nilai absorbsi dibuat kurva absorbsi terhadap kadar indometasin, kemudian ditentukan persaraaan garis lurus dan nilai faktor korelasinya (r).
36 3.3.9.6. Penentuan laju disolusi Dimasukkan 750 ml campuran dapar fosfat ph 7,2 : air = 1 : 4 sebagai media disolusi kedalam bejana disolusi. Bejana disolusi diatur suhunya (37-0,5) C. Ditimbang sampel yang setara dengan 25 mg indometasin, kemudian dimasukkan pada keranjang alat pengaduk. Setelah suhu dalam bejana disolusi mencapai 37 C, kemudian alat pengaduk dimasukkan kedalam bejana setinggi 2-0,2 cm dari dasar bejana. Kecepatan motor diatur 100 rpm. Cuplikan diambil sebanyak 5 ml pada interval waktu : 5 ; 10 ; 15 ; 20 ;30 ; 45 ;60 ; 70 ; 80 dan 90 menit, masing-masing disaring dengan 0,45 mikron "millipore filter", lalu diencerkan dengan media disolusi. Setiap kali setelah pengambilan sampel kedalam media disolusi ditambahkan 5 ml larutan media disolusi untuk menjaga agar volume konstan. Kemudian diukur absorbsinya dengan spektrofotomater UV pada panjang gelombang maksimum. Sebagai blanko digunakan media disolusi. Penentuan laju disolusi ini dilakukan terhadap indometasin bebas, campuran fisik indometasin -/^-siklodekstr in, dan produk indometasin -/^-siklodekstr in. Hasil yang inklusi didapat
37 digambarkan dalain bentuk grafik kurva konsentrasi terlarut terhadap waktu (5.). 3.4. Pengolahan dan analisa data Setelah dilakukan penentuan laju disolusi indometasin bebas, campuran fisik indometasin /^-siklodekstrin, serta senyawa inklusi indometasin /^-siklodekstrin, kemudian dihitung harga efisiensi disolusinya dengan membandingkan AUC dari laju disolusi berbagai perlakuan dengan AUC dari kadar indometasin terlarut 100%. Kemudian harga efisiensi disolusi dari berbagai perlakuan tersebut dibandingkan dengan lainnya, untuk melihat apakah ada perbedaan bermakna dengan menggunakan metode statistik. Metode statistik yang digunakan adalah analisis variasi dengan rancangan acak lengkap atau " analysis of variance pro Completely Randomized Design" ( ANOVA pro CRD ). Jika ada perbedaan bermakna dilanjutkan perhitungan dengan Uji Honestly Significant Different (HSD test) dari Tukey (11).