MUTASI DAERAH D-LOOP mtdna SEL DARAH, EPITEL, DAN RAMBUT DARI INDIVIDU YANG BERBEDA

i MUTASI DAERAH D-LOOP mtdna SEL DARAH, EPITEL, DAN RAMBUT DARI INDIVIDU YANG BERBEDA TESIS Karya tulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister dari Institut Teknologi Bandung Oleh RAFIUDDIN NIM : 20405018 Program Studi Kimia INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2007

ii HUMAN D-LOOP mtdna MUTATIONS OF BLOOD CELLS, EPITHEL CELLS, AND HAIR FOLLICLES FROM CERTAIN INDIVIDUAL WITH DIFFERENT AGES By Rafiuddin NIM. : 20504018 One of the unique characteristics of mtdna is its mutation rate which is relatively higher than the DNA nucleus. The high mutation rate of mtdna causes high level of polymorphism among individuals. In mtdna, there is a noncoding region known as displacement loop (D-loop) which has two hypervariable regions, I and II (HVR I and HVR II). However, there have not been any information whether the sequence of D-loop mtdna nucleotides is similar either for different cells of certain individual or for individuals with different ages. This study is aimed at obtaining the information of human D-loop mtdna mutation for different cells in each individual of five individuals with different ages. This study consists of several stages, namely preparation of DNA template, amplification, nucleotides sequencing, and mutation analysis. Preparation of mtdna template employing cell lysis method, then followed by amplification of D-loop mtdna using the Polymerase Chain Reaction (PCR) with M1 and HV2R primers, then the analysis of PCR result using agarose gel electrophoresis with the puc19/hinfi as standard. Amplified DNA was sequenced using the dideoxy Sanger method with M1 and M2 primers. DNASTAR program was used to analyzed nucleotides mutation with the Cambridge Reference Sequence (CRS) method as standard. There were 12 different cells as samples (blood cells, epithel cells and hair follicles) which were originated from five individuals with different ages (10, 20, 30, 40, and 80 years-old respectively). PCR amplification results of all template DNA samples showed a single band of DNA fragment which was estimated as 1 kb length. The result of nucleotide sequence, in the form of electropherogram, indicated that the seven samples (from three individuals) and five samples (from two individuals) were 200 and 600 base pairs respectively, with the total of about 5.500 base pairs readable nucleotide sequence.the result of the nucleotide sequence analysis using CRS as the standard sequence indicated that the position and the type of mutation of the 30 and 40 years old individuals were similar for blood cells, epithel cells, and hair folicles. In addition, the analysis of different cells in 10, 20, and 80 years old individuals also indicated the similar position and type of nucleotide sequence mutation for blood cells and hair folicles in each of individual.

iii This work demonstrated that the nucleotide sequence of D-loop mtdna for different cells such as blood cells, epithel cells and hair folicles of each individual showed similar mutation. This is due to the same source of cell namely ovum. The ovum has one type of mtdna which is differentiated align with the growth of embrio. This differentiation did not cause nucleotide sequence mutation of mtdna in the blood cells, epithel cells, and hair follicles of an individual. It is suggested that for the mtdna based forensic identification, single type of the above cells would be adequate and would contribute to the more simple identification process in forensic. Keywords : Human mtdna mutation, mtdna D-Loop, epithel cells, blood cells, hair follicles.

iv ABSTRAK MUTASI DAERAH D-LOOP mtdna SEL DARAH, EPITEL, DAN RAMBUT DARI INDIVIDU YANG BERBEDA Oleh Rafiuddin NIM. : 20504018 Salah satu sifat unik mtdna adalah laju mutasi yang relatif lebih tinggi dibandingkan DNA inti. Laju mutasi mtdna yang tinggi menyebabkan adanya perbedaan urutan nukleotida mtdna antar individu (tingkat polimorfisme yang tinggi). Pada mtdna terdapat daerah pengontrol yang tidak mengode (noncoding region), yang dikenal dengan daerah displacement loop (D-loop) yang memiliki dua daerah dengan variasi yang tinggi yaitu hypervariable region I (HVR I) dan hypervariable region II (HVR II). Namun belum ada informasi apakah urutan nukleotida D-loop mtdna sama untuk sel-sel yang berbeda pada individu tertentu. Demikian juga belum ada informasi mengenai pertanyaan di atas yang berkaitan dengan umur yang berbeda. Tujuan penelitian ini untuk memperoleh informasi urutan nukleotida daerah D-loop mtdna sel yang berbeda pada tiap individu untuk lima individu dengan umur berbeda. Tahapan penelitian yang dilakukan meliputi penyiapan templat mtdna dengan cara lisis sel. Amplifikasi fragmen D-loop mtdna dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan primer M1 dan HV2R. Analisis hasil PCR dengan bantuan elektroforesis gel agarosa menggunakan standar puc19 yang dipotong-potong oleh enzim restriksi HinfI (puc19/hinfi). Selain itu, penentuan urutan nukleotida dengan metode dideoksi Sanger menggunakan primer M1 dan M2, analisa mutasi dengan bantuan program Seqman DNASTAR dengan cara membandingkan urutan nukleotida sampel dengan Cambridge Reference Sequence (CRS). Cara tersebut memberikan informasi tentang jumlah, jenis, dan posisi mutasi pada tiap sampel. Sampel yang dianalisis sebanyak dua belas sel yang berbeda (darah, epitel, dan rambut) berasal dari lima individu dengan umur berbeda (10, 20, 30, 40, dan 80 tahun). Amplifikasi PCR berhasil diamati pada gel agarosa sebagai pita tunggal DNA yang diperkirakan berukuran 1 kb untuk semua sampel. Urutan nukleotida, dalam bentuk elektroforegram, menunjukkan bahwa tujuh sampel (dari tiga individu) dan lima sampel (dari dua individu) masing-masing berjumlah 200 dan 600 pasang basa, dan totalnya berjumlah kurang lebih 5.500 pasang basa, telah berhasil diperoleh. Hasil analisis urutan nukleotida menggunakan program seqman DNASTAR dengan CRS sebagai rujukan menunjukkan bahwa untuk tiga sel yang berbeda, yaitu sel darah, sel epitel, dan sel rambut, pada individu berumur 30 tahun dan 40 tahun, posisi dan jenis mutasi masing-masing individu tersebut adalah sama. Sementara itu, analisis urutan nukleotida sel darah dan sel

v rambut individu berumur 10, 20, dan 80 tahun juga menunjukkan posisi dan jenis mutasi yang sama. Dengan demikian, urutan nukleotida D-loop mtdna pada sel berbeda yaitu sel darah, epitel, dan rambut untuk tiap individu menunjukkan mutasi yang sama. Hal ini disebabkan karena sel-sel tersebut bersumber dari satu sel telur yang memiliki satu jenis mtdna kemudian terdiferensiasi seiring dengan perkembangan embrio. Pada fase perkembangan selanjutnya menjadi manusia dewasa, diferensisasi ini tidak menyebabkan adanya perubahan pada urutan nukleotida mtdna pada sel darah, epitel, dan rambut dalam satu individu. Dengan demikian, ketiga jenis sel tersebut dapat dikatakan mewakili keseluruhan jenis sel yang ada pada tubuh manusia. Atas dasar hal-hal di atas, dapat diusulkan untuk menggunakan salah satu dari sel rambut atau darah atau epitel dalam keperluan forensik oleh karena urutan nukleotida D-loop mtdna sama pada ketiga sel tersebut untuk berbagai individu dengan umur berbeda. Diharapkan, hasil penelitian ini dapat bermanfaat untuk memudahkan proses identifikasi dalam bidang forensik. Kata kunci : Mutasi mtdna manusia, D-Loop mtdna, sel epitel, sel darah, akar rambut

vi MUTASI DAERAH D-LOOP mtdna SEL DARAH, EPITEL, DAN RAMBUT DARI INDIVIDU YANG BERBEDA Oleh Rafiuddin NIM : 20504018 Program Studi Kimia Institut Teknologi Bandung Menyetujui Pembimbing Tanggal, Agustus 2007 (Achmad Saifuddin Noer, M.Si., Ph.D)

vii PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS Tesis S2 yang tidak dipublikasikan terdaftar dan tersedia diperpustakaan Institut Teknologi Bandung, dan terbuka untuk umum dengan ketentuan bahwa hak cipta ada pada pengarang dengan mengikuti aturan HaKI yang berlaku di Institut Teknologi Bandung. Referensi kepustakaan diperkenankan dicatat, tetapi pengutipan atau peringkasan hanya dapat dilakukan seizin pengarang dan harus disertai dengan kebiasaan ilmiah untuk menyebutkan sumbernya. Memperbanyak atau menerbitkan sebagian atau seluruh tesis haruslah seizin Direktur program Pascasarjana, Institut Teknologi Bandung

viii UCAPAN TERIMA KASIH Puji syukur alhamdulillah yaa Allah hanya kepada Engkaulah kupanjatkan segala karuniamu ini, berkat pertolonganmu jualah sehingga tesis ini dapat selesai. Penulis mengucapkan terimakasih dan penghargaan yang sebesar-besarnya kepada bapak H. Achmad Saifuddin Noer, M.Si., Ph.D sebagai pembimbing, atas segala saran, bimbingan dan nasehatnya selama penelitian berlangsung hingga penulisan tesis ini selesai. Demikian juga, penulis menyampaikan terimakasih kepada ibu Ati yang senantiasa membantu dalam menyiapkan reagen yang diperlukan selama penelitian. Terimakasih kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi DEPDIKNAS atas bantuan BPPS untuk program pendidikan magister ini. Penulis juga sampaikan penghargaan dan terimakasih kepada Rektor dan Dekan FKIP Universitas Haluoleo Kendari atas ijin dan persetujuan yang diberikan dalam mengikuti program magister di ITB. Terimakasih dan penghargaan disampaikan kepada ketua dan sekretaris jurusan kimia ITB beserta segenap staf administrasi, serta ketua laboratorium biokimia dan para laboran yang telah memberikan pelayanan yang baik. Terimakasih dan penghargaan yang setinggi tingginya disampaikan kepada semua dosen kimia khususnya kelompok bidang keahlian biokimia, atas pengajaran dan pembelajaran biokimia yang diberikan, baik melalui mata kuliah maupun dalam kegiatan akademik lainnya. Terima kasih tak lupa penulis sampaikan kepada teman-teman kelompok penelitian mtdna, khususnya Puti Syahrani, S.Si., M.Si yang berkenan membaca dan mengoreksi tesis ini dan selalu terbuka untuk berdiskusi. Demikian juga, teman-teman penulis yang baik, mereka adalah Karin, Pak Tanto, Anton, Iman, Bambang, Mira, Dea, Pak Ari, Ira, dan Aji. Demikian juga, penghargaan dan terimakasih disampaikan kepada para sukarelawan yang telah menunjukkan

ix kebaikannya dan berkenan memberikan sampel darah, epitel dan akar rambut untuk penelitian ini. Terimakasih yang tak terhingga kepada kedua orangtuaku ummi dan tettaku yang do anya tak pernah putus untuk anaknya. Demikian juga, istriku tercinta Jusni Arief, M.Si dan anak-anakku Akhmad Zul Faudzan Rafiuddin dan Akhmad Afdal Yusuf Rafiuddin yang masih lucu-lucunya, mereka adalah sumber inspirasi dan motivasi. Serta, do a dan dukungan dari keempat adikku : Sirajuddin, S.IP., M.Si, Ratna Dewi, S.Si., Apt, Rosmala Dewi, dan Akhmad Nasrul. Akhirnya semoga tesis ini dapat ikut serta berkontribusi dalam pengembangan penelitian DNA mitokondria berikutnya. Amin. Bandung, Agustus 2007 Penulis Rafiuddin Dipertahankan didepan sidang magister pada hari Rabu, 15 Agustus 2007

x DAFTAR ISI ABSTRACT... ii ABSTRAK... iv PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS... vii UCAPAN TERIMA KASIH.. viii DAFTAR ISI. x DAFTAR TABEL... xi DAFTAR GAMBAR... xii DAFTAR LAMPIRAN... xiii DAFTAR SINGKATAN... xiv Bab. I. Pendahuluan... 1 1.1. Latarbelakang... 1 1.2. Tujuan Penelitian... 2 Bab II. Tinjauan Pustaka... 3 II. 1. Genom mitokondria... 3 II. 2. DNA Mitokondria (mtdna) sebagai materi genetik... 7 II. 3. Daerah D-loop mtdna...9 II. 4. Laju mutasi mtdna...10 II. 5. Peran mutasi mtdna pada penuaan...11 II. 6. Peran mtdna dalam identifikasi forensik.....12 II. 7. Polymerase Chain Reaction (PCR)... 13 II. 8. Direct Sequensing dengan metode dideoksi Sanger...14 Bab III. Metodologi Penelitian... 16 III. 1. Pengambilan sampel... 17 III. 2. Penyiapan templat mtdna... 17 III. 3. Amplifikasi fragmen 1 kb D-loop mtdna dengan teknik PCR...18 III. 4. Penentuan Urutan Nukleotida (Sekuensing)...20 III. 5. Analisis urutan nukleotida dan mutasi dengan program Seqman DNASTAR...21 Bab IV. Hasil dan Pembahasan...22 IV. 1. Sampel mtdna...22 IV. 2. Fragmen 1 kb daerah D-loop hasil PCR...24 IV. 3. Hasil sekuensing fragmen 1 kb D-loop mtdna...25 IV. 4. Mutasi D-loop mtdna dari sampel sel berbeda...28 Bab V. Kesimpulan... 38 DAFTAR PUSTAKA...39 LAMPIRAN...43

xi DAFTAR TABEL Tabel II.1. Hubungan fungsi mitokondria dengan inti...8 Tabel III.1. Tabel III.2. Tabel IV.1. Tabel IV.2. Tabel IV.3. Tabel IV.4. Tabel IV.5. Tabel IV.6. Tabel IV.7. Tabel IV.8. Tabel IV.9. Jenis, posisi dan ukuran primer amplifikasi...18 Jenis, posisi dan ukuran primer sekuensing...20 Data dua belas sampel mtdna yang dianalisis...22 Pola distribusi sampel mtdna yang dianalisis...23 Urutan nukleotida daerah D-loop mtdna sel darah, epitel, dan rambut individu umur 30 tahun...27 Ringkasan mutasi pada sampel sel darah, epitel, dan rambut individu umur 30 tahun...30 Ringkasan mutasi pada sampel sel darah, epitel, dan rambut individu umur 40 tahun...31 Ringkasan mutasi pada sampel sel darah dan rambut individu umur 10 tahun...33 Ringkasan mutasi pada sampel sel darah dan rambut individu umur 20 tahun...35 Ringkasan mutasi pada sampel sel darah dan rambut individu umur 80 tahun...36 Total mutasi daerah D-loop mtdna pada dua belas sampel dari lima individu dibandingkan dengan CRS...37

xii DAFTAR GAMBAR Gambar II. 1. Gambar II. 2. Struktur Mitokondria...4 Struktur molekul DNA...5 Gambar II.3. Reaksi Fosforilasi Oksidatif...6 Gambar II.4. Struktur DNA Mitokondria...7 Gambar III.1 Gambar IV.1 Gambar IV.2 Gambar IV.3. Gambar IV.4. Gambar IV.5. Gambar IV.6. Gambar IV.7. Gambar IV.8. Gambar IV.9. Gambar IV.10. Diagram alur penelitian...16 Contoh fragmen 1 kb daerah D-loop mtdna...24 Posisi ukuran fragmen hasil PCR pada daerah D-loop...25 Contoh hasil sekuensing berupa elektroforegram daerah D-loop mtdna sel darah individu umur 30 tahun (TD30)..26 Contoh hasil sekuensing berupa elektroforegram daerah D-loop mtdna sel epitel individu umur 30 tahun (TE30). 26 Contoh hasil sekuensing berupa elektroforegram daerah D-loop mtdna sel epitel individu umur 30 tahun (TE30)..26 Elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan mutasi pada sel darah, epitel, dan rambut individu umur 30 tahun..29 Contoh elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan mutasi yang sama pada sel darah, epitel, dan rambut umur 40 tahun......30 Contoh elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan mutasi yang sama pada sel darah dan rambut umur 10 tahun... 33 Elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan mutasi pada sel darah dan rambut individu umur 20 tahun...34 Elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan mutasi pada sel darah dan rambut individu umur 80 tahun...35

xiii DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1 Hasil Sekuensing dalam bentuk elektroforegram... 44 Lampiran 2 Urutan nukleotida sampel... 52 Lampiran 3 Elektroforegram sampel yang menunjukkan mutasi 54 Lampiran 4 Lokasi fungsi DNA mitokondria manusia... 62

xiv DAFTAR SINGKATAN SINGKATAN Nama Pertama kali ditemukan di halaman A : Adenin 20 ATP : Adenosine triphosphate 3 C : Cytosine 20 CRS : Cambridge reference Sequence 21 datp : Deoxyadenosine triphosphate 19 dctp : Deoxycytidine triphosphate 19 ddh2o : akua bidestilasi 19 D-loop : Displacement loop 1 DNA : Deoxyribose Nukleic Acid 1 dntp : Deoxy nucleotide 5 -triphosphate 13 EDTA : Etilen Diamin Tetra Asetat 15 EtBr : Etidium Bromida 19 G : Guanine 20 H : Heavy 7 HV I : Hypervaribel I 1 HV II : Hypervaribel II 1 HV2R : Hypervaribel II Reverse 13 kb : kilo basa 18 L : Light 7 mtdna : mitochondrial DNA 1 pb : pasang basa 7 PCR : Polymerase Chain Reaction 13 pmol : pikomol 9 RNA : Riboxynucleic Acid 6 rrna : RNA ribosom 6 T : Thymine 20 TAE : Tris Asetat EDTA 19 TE : Tris-Ethylene diamine tetra aceticacid 18 trna : RNA transfer 6