Bab III Metode Penelitian Metode yang dilakukan dalam penelitian ini terdiri dari empat tahapan, dimulai dengan pengumpulan sampel, kemudian lysis sel untuk mendapatkan template DNA, amplifikasi DNA secara in vitro menggunakan teknik PCR, sequencing dengan metode dideoksi sanger untuk menentukan urutan nukleotida dan analisis hasilnya dengan menggunakan program Seqman TM versi 4.0.0 dari DNASTAR. III.1 Alat Peralatan gelas yang digunakan meliputi gelas kimia, gelas ukur, labu takar, labu Erlenmeyer, cawan petri, dan botol reagen (Pyrex AS, Duran, Schott, Jerman). Peralatan non gelas yang digunakan meliputi Mikropipet Eppendorf dengan tip pipet mikro ukuran 0,5-2,5 L, 1-10 L, 10-100 L, dan 100-1000 L. Kemudian tabung mikro (Eppendorf, Jerman) ukuran 0,2 L, 0,5 L, dan 1,5 L. Selain itu digunakan juga alat-alat lain seperti gunting, pinset, alumunium foil, dan parafilm. Alat pengukur massa menggunakan neraca analitis digital Explorer (Ohaus, AS). Sterilisasi alat agar bebas bakteri menggunakan Autoclave Electric Pressure Steam Sterilized model No.25 (All American, AS). Untuk keperluan inkubasi dalam proses lysis digunakan penangas air LKB Bromma 2219 multitem, mikrosentrifuga tipe 5415 (Eppendorf) dan thermostatic circulator. Penyimpanan bahan-bahan seperti reagen untuk PCR dan lysis, larutan hasil lysis dan hasil PCR menggunakan deep freezer Caravell dengan suhu tetap yaitu -20 C. Proses PCR menggunakan alat PCR merek GeneAmp PCR system 2700 (Applied Biosystems, AS). Analisis hasil PCR dengan cara elektroforesis gel agarosa menggunakan perangkat elektroforesis Mini Dubcell GT BASe DNA Biorad (Biorad, AS) dan untuk visualisasi hasil elektroforesis digunakan lampu UV dengan panjang gelombang 260 nm. Gel hasil elektroforesis difoto dengan kamera digital Nikon Coolpix 8.1Megapixels. 19
III.2 Bahan Bahan yang digunakan berderajat pro analisis kecuali yang disebutkan lain. Gajah Sumatera (Elephas maximus sumatrensis) yang merupakan subspesies dari gajah Asia yang berada di Kebun Binatang Bandung, sedangkan bahan-bahan berikut diperoleh dari gudang zat Program Studi Kimia. Bahan-bahan yang digunakan yaitu NaOH (Merck), EtBr (Merck), CH COOH glasial (Merck), HCl (Pharmacia 3 Biotech), Tris base (Pharmacia Biotech), Etanol, EDTA (J. T. Baker), Tween-20 (Merck), proteinase K (USB Corporation), KCl (Amersham Pharmacia Biotech), MgCl 2 (Amersham Pharmacia Biotech), Taq DNA polimerase (Amersham Pharmacia Biotech), dntp (Amersham Pharmacia Biotech), gel agarosa (Boehringer Mannheim), Aluminium Foil, sukrosa (Merck), bromofenol biru (Pharmacia Biotech), aquabides (ddh 2 O), aqua dm. III.3 Penyiapan Sampel Sampel gajah Sumatera disiapkan dalam keadaan bersih yaitu setelah dimandikan pada pagi hari jam 08.00 09.00 WIB, agar kotoran ditubuh yang akan diambil rambutnya hilang dan rambut yang akan dianalisis tidak bercampur dengan pengotor. Setelah itu dilakukan pencabutan rambut oleh petugas. Rambut yang diambil harus dengan akarnya (folikel) yang mengandung sel paling banyak pada rambut. Plastik disiapkan untuk menyimpan rambut. Selanjutnya sampel rambut tersebut dibawa ke laboratorium biokimia ITB untuk dianalisis. Penanganan sampel akar rambut ini menggunakan sarung tangan, pinset dan gunting yang telah dicuci dengan etanol 70% [Maksum, 2003]. 20
III.4 Diagram Alir Penelitian Pengumpulan Data mtdna gajah dari GenBank Perancangan primer menggunakan program Genmon dan Primer select TM Pengumpulan sampel sel Sintesis Primer P22F dan P22R Lisis sel Amplifikasi dengan metode PCR Pemeriksaan hasil PCR dengan elektroforesis gel Sekuensing dengan metode dideoksi sanger Analisis hasil sekuensing menggunakan program Seqman TM dan Megalign TM versi 4.0.0 dari DNAstar. Gambar III.1 Diagram Alir Penelitian. Rangkain metode yang dilakukan selama Penelitian 21
III.5 Cara Kerja Penelitian III.5.1 Penyiapan Template DNA Sampel akar rambut dipotong kecil-kecil kemudian ditambahkan 20 L bufer lysis 10x (500 mm Tris-HCl ph 8,5 (Pharmacia Biotech), 10 mmm EDTA ph 8,5(J. T. Baker), dan 5 % Tween-20 (Merck)), 10 L proteinase-k (100 µg ml -1 ) dan ditambahkan 170 L ddh O steril hingga volume 200 L dalam tabung eppendorf 2 1,5 ml (Innis dan Gelfand, 1990). Tabung eppendorf kemudian dibungkus dengan parafilm dan diinkubasi pada 50 C selama 1 jam dalam inkubator (Water Bath Grant Instrument Ltd) kemudian enzim proteinase K dideaktivasi pada 95 C selama 10 menit. Campuran ekstrak sel kemudian disentrifugasi menggunakan alat mikrosentrifuga tipe 5415 (Eppendorf) pada kecepatan maksimum 8.000 rpm selama 3 menit. dan Supernatan yang diperoleh selanjutnya dapat digunakan sebagai templat mtdna untuk reaksi PCR. Jika tidak segera digunakan maka disimpan dalam tabung eppendorf 1,5 ml pada suhu -20 C [Noer et al., 1994]. III.5.2 Sintesis Primer Pada penelitian ini sintesis primer dilakukan di Singapura (Genset Oligos) menggunakan primer yang dirancang atas dasar urutan nukleotida Elephas maximus indicus yang diambil dari GenBank. Perancangan primer dilakukan dengan bantuan program komputer Genmon versi 4.1 dan Primer select TM versi 4.0.0. Daerah yang dipilih untuk perancangan primer adalah daerah D-loop. Hasilnya adalah sepasang primer P22F dan P22R. Urutan nukleotida masing-masing primer yaitu: primer P22F 5 - CTCTTGATCGTGCATAGCGC -3, primer P22R 5 - CAGTCAATGCTCGGAGGACA -3. III.5.3 Amplifikasi DNA Amplifikasi mtdna dilakukan pada fragmen 0,4 kb yang meliputi sebagian daerah D-loop, menggunakan primer P22F dan P22R. Proses PCR dilakukan dalam tabung 0,25 ml (Eppendorf) dengan pereaksi terdiri atas 5 L templat mtdna hasil lisis, 20 pmol untuk masing-masing primer, 2,5 L buffer PCR 10X (Amersham Pharmacia Biotech: 500 mm KCl, 15 mm MgCl, dan 100 mm Tris- 2 22
HCl ph 9,0), 1 unit enzim Taq DNA polimerase (Amersham Pharmacia Biotech), 20 M campuran dntp yang terdiri dari datp, dgtp, dctp dan dttp (Amersham Pharmacia Biotech) dan ditambah ddh O steril sehingga volumenya 2 mencapai 25 L [Noer, 1991; Marzuki et al., 1991]. Kontrol positif dibuat dengan komposisi reaksi yang sama tetapi template yang digunakan adalah sampel yang sebelumnya sudah memberikan hasil positif dalam proses PCR. Digunakan juga kontrol negatif dengan campuran reaksi yang sama tetapi template diganti dengan ddh 2 O steril. Proses PCR menggunakan mesin PCR merek GeneAmp PCR system 2700 (Applied Biosystems, AS). sebanyak 30 siklus dengan tahap-tahap proses sebagai berikut: denaturasi awal pada suhu 94 C (5 menit), kemudian masuk ke program siklus PCR dengan masing-masing siklus terdiri dari tiga tahap yaitu tahap denaturasi pada suhu 94 C (1 menit), annealing 48 C (1 menit) untuk pasangan primer P22F/P22R, dan extension atau polimerisasi pada suhu 72 C (1 menit) [Noer, 1991; Marzuki et al., 1991, Newton, dan Graham, 1997; Innis, dan Gelfand, 1990]. Pada akhir dari semua siklus dilakukan tambahan proses polimerisasi pada suhu 72 C selama 10 menit yang bertujuan untuk menyempurnakan reaksi polimerisasi yang belum sempurna. DNA hasil PCR disimpan pada suhu 20 C jika tidak dilakukan proses selanjutnya. III.5.4 Analisis Hasil PCR Hasil PCR dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1,5% (b/v) dibuat dengan melarutkan 0,6 gr agarosa dalam 40 ml buffer TAE 1x kemudian dipanaskan hingga agarosa larut. Larutan didinginkan hingga kira-kira mencapai suhu 60 C dan ditambahkan 2,0 L EtBr 10 mg ml -1. Campuran dituang ke dalam cetakan elektroforesis berukuran 6x10 cm yang sebelumnya telah dipasang sisir pembentuk sumur dan didiamkan hingga membentuk gel padat. Hasil PCR diambil sebanyak 5 L dan dicampur dengan 3 L loading buffer kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel. Sebagai penanda (marker) DNA digunakan puc19/hinfi 60 ng L -1 sebanyak 5 L dicampur dengan 3 L loading 23
buffer. Alat elektroforesis dihubungkan dengan sumber arus listrik dan diatur pada tegangan 80 Volt selama 35 menit menggunakan buffer TAE 1x sebagai running buffer. Pita DNA dianalisis dengan melihat gel elektroforesis diatas sinar UV pada panjang gelombang 312 nm dan difoto dengan kamera Digital [Ratnayani, 2000]. Pita hasil PCR dibandingkan dengan pita penanda (marker) untuk mengetahui perkiraan konsentrasi hasil PCR. Proses untuk memperbanyak hasil PCR dilakukan dengan cara melakukan PCR untuk sampel yang sama berulang-ulang. PCR dilakukan terus hingga sampel berjumlah 750-1200 ng, dengan konsentrasi 15 ng µl -1 yaitu jumlah minimal untuk melakukan 1 kali reaksi sequencing. III.5.5 Penentuan Urutan Nukleotida Untuk keperluan penentuan urutan nukleotida, sampel hasil PCR dikumpulkan hingga berjumlah antara 750 1200 ng karena hasil tersebut belum dimurnikan. Disiapkan juga salah satu primer dengan konsentrasi 10 pmol/3 µl dalam tabung mikro lalu dibungkus dengan parafilm. Untuk satu kali reaksi sequencing dibutuhkan 2,5 µl primer dengan konsentrasi 10 pmol/3µl. Penentuan urutan nukleotida (sequencing) dilakukan oleh Macrogen Inc dengan menggunakan metode Dideoksi Sanger dan mengikuti prosedur BigDye TM Terminator. Produk yang terbentuk dimurnikan menggunakan metode presipitasi etanol. Urutan nukleotida dibaca secara otomatis menggunakan alat Automatic Sequencer 3730xl. Data yang diperoleh berupa elektroferogram dalam bentuk abi file. Masing-masing basa nukleotida ditunjukkan oleh warna yang berbeda, yaitu basa A ditunjukkan dengan warna hijau, basa G warna hitam, basa T warna merah, dan basa C warna biru. Selain elektroferogram, diperoleh juga urutan nukleotida lengkap dalam bentuk arsip teks. III.5.6 Analisis Hasil Sequencing Analisis hasil sequencing dilakukan dengan membandingkan urutan sequencing sampel terhadap urutan nukleotida gajah lain yang didapat dari GenBank menggunakan program Seqman TM versi 4.0.0 dari DNASTAR. 24
Analisis terhadap urutan nukleotida menggunakan program Seqman TM versi 4.0.0 dilakukan dengan memasukkan urutan nukleotida gajah lain dan urutan nukleotida sampel lalu program akan secara otomatis menandai basa pada posisi tertentu yang berbeda dengan basa pada urutan nukleotida gajah lain. Elektroforegram yang dihasilkan dari proses sequencing tidak selalu akurat, terutama apabila terdapat puncak yang berhimpitan. Oleh karena itu, pembacaan ulang secara manual untuk memperbaiki urutan nukleotidanya sangat diperlukan dan akan mudah dilakukan dengan bantuan program Seqman TM. Analisis pohon pilogenetik dilakukan dengan menggunakan program komputer Megalign TM. Bab IV Hasil dan Pembahasan 25