3 Metode Penelitian 3.1. Alat Penelitian dilakukan di Laboratorium KBK Protein dan Enzim dan Laboratorium Biokimia, Program Studi Kimia ITB. Peralatan gelas yang digunakan terdiri atas labu erlenmeyer, tabung reaksi, batang pengaduk, gelas kimia, gelas ukur, cawan petri, labu takar, dan pipet tetes. Peralatan lain yang digunakan adalah botol semprot, kawat ose, tabung sentrifuga 15 ml dan 50 ml, tabung Eppendorf 1,5 ml, pipet mikro (Eppendorf) dengan ukuran 1-10 μl, 10-100 μl, 100-1000 μl, kuvet 1 ml, dan stopwatch. Sebelum digunakan, alat- alat gelas dan bahan disterilkan dengan menggunakan autoclave (Portable Steam Sterilizer H 7101, China). Pekerjaan yang memerlukan kondisi aseptik, misalnya pembuatan media dan inokulasi, dilakukan di ruang laminar flow (Oliphant, Ltd, Australia) atau dilakukan di dekat nyala api. Biakan sel padat media diinkubasi menggunakan incubator temperatur 30 C (Griffin). Biakan sel padat media cair diinkubasi dengan menggunakan shaker incubator (Dubnoff GCA). Bahanbahan kimia ditimbang dengan menggunakan neraca analitik (E. mettler, Switzeerland). ph larutan diukur dengan menggunakan ph meter (Orion 710 A). Homogenasi larutan dilakukan menggunakan stirer (pengaduk magnetik) dan Vortex (Fisher Vortex Genie). Penentuan aktivitas enzim dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer UV- Vis (BIORAD, Smartspec TM 3000) dan heating block (Thermolyne). Pemisahan sel dan enzim dari suspensi dilakukan dengan menggunakan sentrifuga (Beckman ETM). Pemisahan pada suhu kamar dilakukan dengan menggunakan mikrosentrifuga (Beckman Microfuge ETM). 21
3.2. Bahan 3.2.1 Bakteri Laut Vibrio sp. B10.2.8 Bakteri yang digunakan pada penelitian ini adalah bakteri laut Vibrio sp. B10.2.8 yang diisolasi dari glass slide yang diinkubasi pada kedalaman 3 meter dan berjarak 2 meter dari koloni karang lunak (softcoral) Sinularia sp. di pulau Peucang, Ujung Kulon-Jawa Barat. 3.2.2 Zat Kimia Ekstrak ragi (Difco), bakto pepton (Difco), dan air laut digunakan untuk membuat media pertumbuhan bakteri laut pada media cair. Bakto agar (Difco) diperlukan sebagai tambahan untuk membuat media padat. Pati dapat larut (Merck) digunakan sebagai substrat pada uji aktivitas α-amilase secara kualitatif dan kuantitatif terhadap pati yang sudah digelatinisasi. NaH 2 PO 4 dan Na 2 HPO 4 digunakan untuk membuat bufer. Pada saat melakukan uji aktivitas enzim digunakan KI/I 2 sebagai reagen pewarna dan HCl 1 N untuk menghentikan reaksi enzimatis. Amonium sulfat (NH 4 ) 2 SO 4 digunakan ketika melakukan pemekatan enzim dengan metoda fraksinasi. 3.3. Cara Kerja 3.3.1. Pembuatan media marine broth padat Media Marine Broth merupakan media pertumbuhan bakteri B10.2.8. Media marine broth padat dibuat dengan mencampurkan bakto pepton 0,25% (b/v), ekstrak ragi 0,05%, baktoagar 2% (b/v), dan air laut untuk melarutkan. Campuran kemudian disterilisasi menggunakan alat autoclave selama 15 menit. Setelah itu, media dituangkan ke dalam cawan petri steril secara aseptik di ruang laminar flow atau di dekat nyala api. Media dibiarkan beberapa saat hingga memadat, kemudian disimpan pada 4 C selama 12-24 jam. Media marine broth cair dibuat dengan metode yang sama dengan pembuatan media marine broth padat, tetapi tanpa penambahan bakto agar. Media marine broth padat untuk uji kualitatif memiliki komposisi yang 22
sama dengan marine broth padat untuk pertumbuhan, dengan penambahan pati dapat larut sebanyak 1% (b/v). 3.3.2. Peremajaan kultur bakteri Vibrio sp. B10.2.8 pada media marine broth padat Peremajaan bakteri laut B10.2.8 pada media marine broth padat dilakukan dengan menggoreskan bakteri menggunakan kawat ose. Setelah itu, bakteri diinkubasi pada suhu 30 C selama 13 jam. 3.3.3. Pembuatan kurva pertumbuhan Vibrio sp. B10.2.8 dan aktivitas α-amilase selama pertumbuhan Pertumbuhan bakteri diukur dengan mengukur densitas optik (Optical Density, OD) pada panjang gelombang 600 nm. Sebanyak 1000 μl inokulum dimasukkan kedalam 100 ml media MB dalam labu erlenmeyer 500 ml, kemudian dikocok dalam shaking incubator pada kecepatan 150 rpm dan temperatur 30 o C. Sampel diambil sebanyak 1 ml secara aseptik pada interval waktu 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 19, 22, dan 25 jam pertumbuhan bakteri dan diukur OD 600. Sekresi α-amilase pada tiap waktu pertumbuhan Vibrio sp B10.2.8. dilakukan dengan mensentrifuga kultur bakteri pada kecepatan 12500 x g selama 3 menit. Supernatan yang diperoleh kemudian diuji aktivitas α-amilase-nya dengan metode Fuwa. 3.3.4. Produksi α-amilase Vibrio sp. B10.2.8 Sebelum menginokulasi bakteri B10.2.8 dalam media produksi, harus dibuat terlebih dahulu starter. Starter dibuat dengan mengambil koloni tunggal dari media padat marine broth dengan jarum ose steril kemudian dinokulasi ke dalam 10 ml marine broth cair. Sel bakteri ini diinkubasi dalam shaking incubator dengan kecepatan 150 rpm, pada suhu 30 C selama 13 jam. Setelah 13 jam, sebanyak 1% (v/v) sel bakteri diambil untuk kemudian diinokulasi ke dalam media produksi. Media produksi yang digunakan adalah media marine broth yang mengandung pati dapat larut 0,1% (b/v). Sel bakteri dalam media produksi kemudian diinkubasi dalam shaking incubator pada suhu 30 C dengan kecepatan 150 rpm selama 13 jam. 23
Setelah ditumbuhkan dalam media produksi selama 13 jam, dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 6000 x g selama 15 menit. Setelah sentrifugasi akan didapatkan fraksi supernatan dan debris sel. Fraksi supernatan inilah yang merupakan enzim α-amilase yang dihasilkan oleh bakteri B10.2.8. Kultur supernatan yang diperoleh kemudian ditambahkan dengan (NH 4 ) 2 SO 4 hingga 70% jenuh (Lampiran G) dan didiamkan selama satu jam. Supernatan kemudian disentrifuga dengan kecepatan 12000 x g selama 10 menit. Setelah itu, fraksi 70% supernatan ini didialisis dan hasilnya disimpan dalam freezer 20 C. 3.3.5. Pembuatan bufer fosfat 20 mm Larutan Na 2 HPO 4 1 M dibuat dengan melarutkan 1,41974 gram padatan Na 2 HPO 4 dalam 100 ml aquades. Larutan NaH 2 PO 4 1 M dibuat dengan melarutkan 1,19974 gram padatan NaH 2 PO 4 dalam 100 ml aquades. Setelah itu, 12 ml larutan Na 2 HPO 4 1 M dicampurkan dengan 88 ml larutan NaH 2 PO 4 1 M sehingga didapatkan larutan bufer fosfat ph 6 dengan konsentrasi 1 M. Untuk membuat larutan bufer fosfat dengan konsentrasi 20 mm, maka dapat diambil sejumlah volume larutan bufer fosfat 1 M kemudian diencerkan dengan aquabides. Pengaturan ph larutan bufer fosfat dapat dilakukan dengan menambahkan NaOH atau H 3 PO 4. 3.3.6. Pembuatan stok larutan KI/I 2 Pembuatan larutan KI/I 2 dilakukan dengan cara mencampurkan KI 0,5% (b/v) dengan I 2 0,15% (b/v) dan dilarutkan menggunakan aquades. Untuk mempercepat proses pelarutan, campuran diaduk menggunakan pengaduk magnetik. Larutan akhir kemudian disimpan dalam botol reagen berwarna gelap. 3.3.7. Pembuatan larutan pati 0,125% (b/v) untuk menentukan aktivitas α- amilase terhadap pati tergelatinisasi Larutan pati ini akan digunakan sebagai substrat pada saat uji aktivitas enzim secara kuantitatif. Larutan pati ini harus dibuat fresh, yaitu sebelum analisis uji aktivitas dilakukan. Larutan pati dibuat dengan cara melarutkan 0,0125 gram pati dalam 10 ml bufer fosfat 20 mm ph 6 dengan pemanasan. 24
3.3.8. Uji Aktivitas α-amilase Vibrio sp. B10.2.8 Uji aktivitas α-amilase dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif. Uji aktivitas secara kualitatif dilakukan terhadap bakteri B10.2.8 yang ditumbuhkan pada media marine broth padat yang mengandung 1% (b/v) amilum. Pengujian dilakukan dengan cara menuangkan larutan KI/I 2 ke dalam cawan petri yang berisi kultur bakteri. Kemudian perubahan warna yang terjadi diamati sebelum dan sesudah penambahan KI/I 2. Aktivitas α-amilase ditandai dengan munculnya daerah bening di sekitar koloni bakteri. Penentuan aktivitas α-amilase secara kuantitatif dilakukan atas dasar kemampuan enzim α- amilase dari bakteri untuk menghidrolisis ikatan α-1,4-glikosidik pada pati (Fuwa, 1954). Definisi satu unit aktivitas enzim α-amilase adalah penurunan absorban pada panjang gelombang 600 nm sebesar 10% per ml enzim pada kondisi percobaan. Uji aktivitas dilakukan dengan cara mencampurkan 0,1 ml substrat pati terlarut 0,125% (b/v) dengan 0,2 ml larutan enzim. Kemudian campuran ini diinkubasi pada temperatur 50 C selama 10 menit. Reaksi enzimatik dihentikan dengan cara menambahkan 0,125 ml HCl 1N. Ke dalam campuran kemudian ditambahkan 0,25 ml campuran KI/I 2 0,15% (b/v). Setiap penambahan setiap reagen campuran harus di-vortex agar campuran menjadi homogen. Setelah itu, ke dalam campuran ditambahkan 4 ml bufer fosfat 20 mm ph 6 dan campuran kemudian di-vortex lagi. Setelah itu, campuran diukur serapannya pada panjang gelombang 600 nm. Sebagai kontrol, enzim digantikan dengan enzim yang telah diinaktivasi. Sebagai blanko digunakan 0,125 ml HCl 1N, 0,25 ml KI/I 2 0,15% (b/v), dan 4 ml bufer fosfat 20 mm ph 6. Unit aktivitas (UA) dari enzim ditentukan berdasarkan persamaan berikut: Unit aktivitas (U/ml) = A 600 (A A ) kontrol sampel A kontrol 10% V enzim : absorban pada panjang gelombang 600 nm faktor pengenceran enzim... (3.1) 10% : penurunan intensitas warna biru kompleks iodin- pati V : volume enzim yang digunakan 25
3.3.9. Penentuan konsentrasi total protein Kadar protein ditentukan dengan metode Bradford (Bradford et.al, 1976) menggunakan pewarna coommasie briliant blue G-250. Sebanyak 800 μl larutan protein dicampurkan dengan 200 μl reagen warna. Campuran reaksi dikocok kemudian didiamkan selama 5-10 menit pada suhu ruang. Absorbans larutan diukur pada panjang gelombang 595 nm. Larutan standar protein yang digunakan adalah larutan BSA (Bovine Serum Albumine) dengan konsentrasi 2-16 μg/ml. 3.3.10. Pengaruh ph dan suhu terhadap aktivitas α-amilase Vibrio sp. B10.2.8 ph optimum aktivitas α-amilase ditentukan dengan melakukan reaksi hidrolisis pati pada rentang ph 5,0 8,0 pada suhu 50 o C. Larutan ph dibuat dengan menggunakan 20 mm buffer fosfat. Suhu optimum aktivitas α-amilase ditentukan dengan melakukan reaksi hidrolisis pati pada rentang suhu 40-80 o C pada ph 6,0. 3.3.11. SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamid Gel Electrophoresis) Komposisi bahan pembuatan stacking gel dan separating gel untuk SDS-PAGE dapat dilihat pada Tabel 3.1. Sebelum dielektroforesis, sampel enzim dicampurkan dengan 5 x sampel bufer dengan perbandingan volume sampel dan sampel bufer adalah 1:4. Setelah itu, sebanyak 20 µl sampel enzim dimasukkan dalam sumur gel untuk dielektroforesis. Proses elektroforesis dilakukan pada tegangan 150 V dan arus 400 ma selama 60 menit. Proses elektroforesis dihentikan bila warna biru tracking dye telah mencapai jarak kurang lebih 1 cm dari tepi bawah gel. Tabel 3.1 Komposisi Gel untuk SDS-PAGE (Komposisi untuk 2 gel) Stacking gel Separating gel - 0,67 ml 30% akrilamida - 3,746 ml dh 2 O - 0,5 ml 1M Tris-HCl ph 6,8-100 μl 10% amonium persulfat - 4 μl TEMED - 3,3 ml 30% akrilamida - 3,996 ml dh 2 O - 2,5 ml 1,5 M Tris-HCl ph 8,8-100 μl 10% amonium persulfat - 4 μl TEMED 26
3.3.12. Zimografi Zimografi dilakukan dengan merendam gel hasil elektroforesis SDS-PAGE yang telah direnaturasi dalam larutan 1% pati dalam bufer fosfat 20 mm, ph 6,0 selama 30 menit pada temperatur 50 ºC. Gel kemudian direndam dalam larutan KI/I 2 selama 15 menit (Lo, 2002). Adanya α-amilase ditandai dengan terbentukkan pita bening setelah dilakukan perendaman dalam larutan KI/I 2. Renaturasi protein pada gel hasil elektroforesis SDS-PAGE dilakukan dengan menginkubasi gel dalam bufer fosfat 20 mm, ph 6 selama 1 jam. 3.3.13. Analisis gula pereduksi yang dilepas α-amilase dalam mendegradasi pati mentah Analisis gula pereduksi dilakukan dengan menggunakan metode antron. Larutan antron dibuat fresh sebelum pengujian dilakukan. Larutan anthron dibuat dengan melarutkan 0,4 gr serbuk anthron dalam 200 ml asam sulfat pekat (larutan A). Larutan B dibuat dengan mencampurkan 60 ml aquabides dengan 15 ml etanol 95%. Ke dalam larutan B ditambahkan larutan A secara perlahan sambil diaduk. Pencampuran kedua larutan dilakukan dalam penangas es. Sebanyak 0,5 ml suspensi 5% (b/v) pati mentah dicampur dengan 0,5 ml larutan enzim dalam sebuah tabung Eppendorf. Campuran diinkubasi pada temperatur 37 o C selama 4 jam, kemudian disentrifuga dengan kecepatan 12.500 x g (microsentrifuge) selama 10 menit. Sebanyak 0,5 ml supernatan ditambahkan dengan 5 ml larutan antron dan diinkubasi pada temperatur 100 o C selama 10 menit. Serapan larutan diukur pada panjang gelombang 620 nm. Kurva standar glukosa dengan rentang konsentrasi 25-150 mg/l digunakan untuk menghitung kadar glukosa dalam sampel. 27